CN113533492A - 一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及小分子物质检测技术领域，更具体地说，涉及一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒及其使用方法，试剂盒中的纳米检测芯片采用顶端—接触萃取技术，通过纳米线阵列芯片与液体样本短时间孵育，即可将待检测液体样本中的小分子物质萃取并富集至纳米线顶端，由于纳米线本身对激光能量的高效吸收效果，被萃取到纳米线顶端的小分子物质无需洗脱，可直接进行质谱分析，实现液体样本中多种小分子物质的高灵敏、高通量、快速检测。此外，本发明提出的顶端—接触萃取技术还避免了液体样本中的盐效应，显著提高激光解吸离子化质谱的检测重现性，尤其适用于含盐量高的液体样本比如尿液、海水中小分子物质的检测。

Description

一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质 谱试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及小分子物质检测技术领域，更具体地说，涉及一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒及其使用方法。
背景技术
当前，针对液体样本中的小分子物质进行快速、准确检测具有重要意义。比如，针对尿液中的代谢小分子物质进行检测，可以应用于反映人体的生理生化状况；针对水体样本中的有机污染物残留进行检测，可以监测环境污染情况等。
尿液作为一种富含人体代谢终产物的生物体液，其中代谢组分的变化可以反映整个机体的生理及生化状况。近年来，利用尿液中代谢组分的变化进行疾病的诊断的新技术应运而生。现有的尿液代谢物分析技术主要包括核磁共振(NMR)和与色谱连用的质谱技术(LC-MS或GC-MS)。专利CN107340337B对尿液样本进行去除样本杂质、干燥、肟化和衍生化预处理后，用气相色谱-质谱联用的方法对代谢物进行检测。专利CN109884300A则尝试了利用高效液相色谱-质谱联用法实现对于结直肠癌患者和健康志愿者的区分。专利CN103033580A则采用气相色谱-质谱联用技术实现了对肺癌患者和健康志愿者的尿液样本的判别分析。
有机污染物对水体的污染可通过水循环系统进入生态链，进而影响生命健康。近年来，由于质谱技术的高精准度、高特异性、高灵敏度等特点，在水体中有机污染物的检测已经得到广泛应用。现有质谱技术中应用最多的主要是液相色谱串联质谱技术。CN110470768A采用超高效液相色谱-串联质谱对经过固相萃取萃取、盐析等预处理后的水样中吡嘧磺隆、三唑磷以及丁草胺残留量进行测定。CN108802243A发明了一种液相色谱法同时检测水中灭草松、2，4-D、2，4-二氯酚、2，4，6-三氯酚、五氯酚的方法，主要包括固相萃取柱的活化，水样的吸附，干燥，洗脱，可同时萃取和检测出水中所述的五种化合物的含量。CN110887922A尝试了强阳离子交换柱对蔬菜中的灭蝇胺进行富集等预处理后，利用高效液相色谱-串联质谱仪对蔬菜中灭蝇胺进行定性和定量分析。CN101598708以水果蔬菜为基质，利用基质分散固相萃取技术对样品进行预处理，结合超高效液相色谱-串联质谱实现水果蔬菜中阿维菌素、涕灭威和灭蝇胺等农药残留的快速检测。CN105548433A对牛奶样品进行蛋白沉淀、除脂和固相萃取等预处理后，利用液相色谱串联质谱法实现了对牛奶中多种非蛋白含氮化合物含量的同时检测。CN106018621A对液态奶样品采用乙酸水溶液提取、乙腈沉淀蛋白后，结合超高效液相色谱-电喷雾离子源多反应监测(MRM)模式串联质谱，实现了对液体乳中三聚氰胺和舒巴坦的定性与定量检测。
如上所述，针对液体样本中小分子物质的检测目前虽然存在很多方法，但是，现有检测方法具有以下缺点：(1)现有技术需要复杂的试样预处理过程，主要包括沉淀、离子交换、固相萃取、洗脱等步骤，在每个步骤中均有可能造成检测对象损失而降低检测回收率。(2)色谱-质谱联用技术中，色谱分离需要较长时间，对大规模样本的检测耗时长。(3)NMR与MS技术相比灵敏度较低，从而限制了对液体样本中小分子物质的快速、灵敏以及高通量检测；(4)在电喷雾质谱平台下，未经预处理的液体样本中的高含盐背景会导致较强的离子抑制效应，导致仪器灵敏度降低，质谱信号出峰较差；(4)在现有的激光解吸离子化质谱平台下，虽然已经有小分子物质检测的相关技术，但高盐液体样本如果未经预处理直接滴加在靶材后，盐的结晶对激光能量的散射会造成离子化效率降低及重现性降低。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒及其使用方法，可以满足液体样本的高通量、高灵敏度、快速检测需求。具体方案如下：
第一方面，本发明提供一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒，所述试剂盒包括：
储液容器，用于储存所述液体样本；
纳米检测芯片，包括基底和设于所述基底上的垂直纳米线阵列，使用时倒扣于所述储液容器上，使得至少部分所述垂直纳米线阵列与所述液体样本接触；和
校准品，包括4种及以上分子量明确的小分子混合物，用于质谱仪的分子量校准和质谱信号稳定性判断。
优选地，所述纳米检测芯片包括检测区域和校准区域，位于所述检测区域内的垂直纳米线阵列使用时能够与所述液体样本接触。
优选地，所述储液容器整体为板状，其表面设有用于储存所述液体样本的样本液槽。
优选地，所述储液容器的表面还设有用于储存所述校准品的校准液槽，位于所述校准区域内的垂直纳米线阵列使用时能够与所述校准品接触。
优选地，所述垂直纳米线阵列为硅纳米线阵列，表面涂覆具有小分子物质萃取能力的聚合物或键合官能团。
优选地，在所述储液容器与所述纳米检测芯片的接触面上设有定位突起，在所述纳米检测芯片表面对应位置上设有定位插槽。
优选地，所述试剂盒还包括封闭容器，使用时所述储液容器和所述纳米检测芯片置于所述封闭容器内部，防止外部因素干扰。
优选地，所述试剂盒用于检测液体样本中的小分子物质，所述液体样本包括尿液、农药残留水体样本、含乳液体、饮料或海水。
第二方面，本发明还提供一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一，将待分析液体样本置于储液容器的样本液槽内；
步骤二，将纳米检测芯片倒扣于所述储液容器上，使得所述垂直硅纳米线阵列与所述待分析液体样本接触，对所述待分析液体样本中的小分子物质进行吸附萃取；
步骤三，吸附萃取结束后，用氮气或干净空气缓速将所述纳米检测芯片表面吹干；
步骤四，将垂直硅纳米线阵列上吸附萃取了小分子物质的纳米检测芯片作为靶材进行质谱检测，获得小分子物质的质谱信号。
优选地，所述方法还包括校准步骤，所述校准步骤为：
将校准品溶液滴加在所述纳米检测芯片的校准区域，按照前述方法步骤四获得标准物质质谱信号，进行精确分子量校准；或
将校准品溶液置于所述储液容器的校准液槽内，所述纳米检测芯片倒扣于所述储液容器上，使得所述纳米检测芯片上校准区域内的垂直硅纳米线阵列与所述待校准品溶液接触，按照前述方法步骤四获得标准物质质谱信号，进行精确分子量校准。
优选地，所述小分子物质包括代谢小分子、药物或添加剂其中之一。
优选地，所述质谱检测包括激光解吸离子化质谱或二次离子质谱。
优选地，所述试剂盒用于检测尿液样本中的代谢小分子及高盐液体样本中的小分子物质。
第三方面，本发明还提供了第一方面中所述的试剂盒在膀胱癌和健康人群尿液样本进行区分中的应用，所述试剂盒通过对尿液样本中特征标志物的检测，对膀胱癌及健康人群尿液样本进行区分，所述特征标志物包括γ-氨基丁酸、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、n-乙酰缬氨酸、n-乙酰苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、烟酸、肌酐、牛磺酸、柠檬酸和月桂酸。
与现有技术相比，本发明提供一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒，具有以下优点：
(1)针对液体样本，试剂盒中的纳米检测芯片可以快速地对其中的小分子物质进行吸附萃取，又由于纳米线本身对激光能量的高效吸收效果，被萃取到垂直纳米线阵列顶端的小分子物质无需洗脱，可直接将纳米检测芯片作为靶材送入质谱仪进行分析，无需进行复杂的样本前处理流程，操作简便，极大地缩短了检测耗时；
(2)试剂盒中的纳米检测芯片可以实地对各类液体样本中的小分子物质吸附萃取，干燥封装后进行质谱检测，不需要将体积较大的液体样品运输至检测中心检测，降低运输体积及成本，同时也避免液体样本在运输过程中的变质导致分析结果的变异。
(3)试剂盒中的纳米检测芯片采用顶端-接触萃取技术，以倒扣方式与液体样本接触，避免了液体样本中的盐沉积效应，从而剔除了盐沉积及样本干燥后盐结晶对质谱信号的严重干扰，不仅提高了检测灵敏度，而且显著提高质谱信号的重现性，尤其适用于含盐量高的液体样本检测；
(4)试剂盒中的纳米检测芯片通过简单、快速孵育即可从微量的液体样本中萃取、分离及富集小分子物质，配合质谱检测，可以针对样本量较小的液体样本实现高通量、快速地检测；
本发明提供一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒的使用方法，同样具有上述优点。
本发明提供一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒及其使用方法，可成功应用于尿液样本中的代谢物高灵敏、高通量及高稳定检测。相比于液体样本滴加于靶材的方式，尿液样本中代谢物出峰数量提高5倍以上。批内检测变异系数(RSD)可控制在14％以内，批间RSD控制在16％以内。特别地，针对膀胱癌患者尿液代谢物的检测，获得了与膀胱癌显著相关的代谢标志物信息，揭示了膀胱癌患者中γ-氨基丁酸(GABA)、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、n-乙酰缬氨酸、n-乙酰苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸和烟酸表达上调，而肌酐、牛磺酸、柠檬酸和月桂酸表达下调。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的纳米检测芯片顶端-接触萃取示意图；
图2为本发明实施例中纳米检测芯片的示意图；
图3为本发明实施例2中硅纳米检测芯片检测小分子物质的背景噪音示意图；
图4为本发明实施例2中硅纳米检测芯片不同吸附萃取时间下代谢物出峰的总离子强度比较图；
图5为本发明实施例2中硅纳米检测芯片经过顶端—接触萃取或直接滴加制样后的金相显微图，其中：(A)直接滴加制样，(B)顶端-接触萃取制样，(C)和(D)分别为(A)、(B)的放大图；
图6为本发明实施例2中硅纳米检测芯片对不同浓度校准品溶液吸附萃取后的线性关系图；
图7为本发明实施例2中硅纳米检测芯片对不同标准品溶液萃取后的回收率；
图8为本发明实施例2中硅纳米检测芯片对不同浓度尿素干扰下校准品混合溶液检测的质谱图，其中：(A)采取传统滴加制样方法的质谱图，(B)采用顶端-接触萃取制样的质谱图；
图9为本发明实施例2中硅纳米检测芯片对不同浓度尿素干扰下校准品混合溶液检测的稳定性，其中：(A)采取传统滴加制样方法的质谱图，(B)采用顶端-接触萃取制样的质谱图；
图10为本发明实施例2中硅纳米检测芯片对不同浓度尿素干扰下混合尿液检测的质谱图，其中：(A)采取传统滴加制样方法的质谱图，(B)采用顶端-接触萃取制样的质谱图；
图11为本发明实施例2中硅纳米检测芯片对不同浓度尿素干扰下混合尿液检测的稳定性，其中：(A)采取传统滴加制样方法的质谱图，(B)采用顶端-接触萃取制样的质谱图；
图12为本发明实施例2中硅纳米检测芯片对不同梯度稀释下混合尿液检测的稳定性，其中：(A)采取传统滴加制样方法的质谱图，(B)采用顶端-接触萃取制样的质谱图；1,2,3,4及5分别代表不同梯度稀释的1U，0.5U，0.25U，0.125U及0.0625U尿液样本；
图13为本发明实施例2中硅纳米检测芯片对不同尿液样本检测的质谱图，其中：(A)采取传统滴加制样方法的质谱图，(B)采用顶端-接触萃取制样的质谱图；
图14为本发明实施例2中硅纳米检测芯片的顶端—接触萃取技术对膀胱癌尿液样本与健康对照样本的判别分析，其中：(A)测试集尿液样本的PCA判别分析图，(B)验证集尿液样本的PCA判别分析图，(C)测试集尿液样本的OPLSDA判别分析图，(D)验证集尿液样本的OPLSDA判别分析图，HC代表健康志愿者尿液样本，BC代表膀胱癌患者尿液样本；
图15为本发明实施例3中含有不同浓度2,4-D标品的人造海水经过硅纳米检测芯片萃取后的线性关系；
图16为本发明实施例3中含有2,4-D标品的人造海水样品的最低检测限；
图17为本发明实施例4中含有不同浓度三聚氰胺的乳液样本经过硅纳米检测芯片萃取后的线性关系；
图18为本发明实施例4中含有三聚氰胺的乳液样本的最低检测限。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒，试剂盒包括储液容器100、纳米检测芯片200和校准品。
储液容器100用于储存待检测的液体样本。进一步地，储液容器100整体呈板状，并且其表面设有用于储存液体样本的样本液槽110，样本液槽110可以是长方体、正方体、圆柱形或半球形等，只要能实现液体样本的储存即可，此外，样本液槽110的数量也不做限定，可以根据实际需要进行设置，通过设置多个样本液槽110可以实现高通量检测。储液容器100的材质不做限定，可以是塑料、玻璃、石英等材质。
纳米检测芯片200，包括基底201和设于基底上的垂直硅纳米线阵列202。使用时，将纳米检测芯片200倒扣于储液容器100上，使得至少部分垂直硅纳米线阵列202与液体样本接触，垂直硅纳米线阵列202将液体样本中的小分子物质通过吸附萃取分离，经过干燥后，后续可以进行质谱检测。实际操作中，纳米检测芯片倒扣于储液容器100上，只要垂直硅纳米线阵列202的顶部与待检测液体样本接触即可实现吸附萃取分离，因此仅需要微量的液体样本即可完成检测。
进一步地，纳米检测芯片200包括检测区域210和校准区域220，检测区域和校准区域中都设有垂直硅纳米线阵列202。位于检测区域内的垂直硅纳米线阵列202用于吸附萃取液体样本中的小分子物质，所以在使用时其能够与液体样本进行接触。而校准区域内的垂直硅纳米线阵列202用于与校准品结合，进行样品测试前的校准。利用校准品校准时，可以将校准品溶液滴加在校准区域内，干燥后，通过精确分子量进行校准。
为了更有利于垂直硅纳米线阵列202对样本液槽110内小分子物质的吸附萃取，样本液槽110的容积大于检测区域内的垂直硅纳米线阵列202所占体积的两倍。
进一步地，在储液容器100的表面上另外设有的校准液槽，可以储存校准品溶液。利用校准品校准时，也可以通过纳米检测芯片200倒扣在储液容器100上的方式，使得位于校准区域内的垂直硅纳米线阵列202与校准液槽内的校准品溶液接触，进而实现吸附萃取分离，从而提高校准的精度。
为了在使用时便于纳米检测芯片200和储液容器100定位，在储液容器100与纳米检测芯片200的接触面上设有定位突起，而在纳米检测芯片200表面对应位置上设有定位插槽，定位突起和定位插槽相配合，从而便于垂直硅纳米线阵列202顺利进入样本液槽110，并且在使用中也起到固定作用，提高吸附萃取过程的稳定性。
进一步地，试剂盒还包括封闭容器。在吸附萃取过程中，储液容器100和纳米检测芯片200均置于封闭容器内部，从而可以防止外部因素干扰，比如防止外界的灰尘、水滴进入等。封闭容器的材质、形状不做具体限定，只要能起到上述作用即可，优选地，封闭容器采用透明材质制成，方便外部观察，更优选地，封闭容器为玻璃表面皿。
本发明还提供上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
步骤一，将待分析液体样本置于储液容器的样本液槽110内；
步骤二，将纳米检测芯片倒扣于所述储液容器上，使得所述纳米检测芯片上的至少部分垂直纳米线阵列与所述待分析液体样本接触，对所述待分析液体样本中的小分子物质进行吸附萃取。此处，垂直硅纳米线阵列无需全部浸入液体样本内，只要其一部分与液体样本接触即可；
步骤三，吸附萃取结束后，用氮气或干净空气缓速将所述纳米检测芯片表面吹干；
步骤四，对所述垂直纳米线阵列上吸附萃取的小分子物质进行质谱检测。本方案可以适用于各种质谱检测方法，比如激光解吸离子化质谱或二次离子质谱等。
进一步地，试剂盒的使用方法还可以包括校准步骤。根据标准品与纳米检测芯片的吸附方式不同，可以分为两种校准方法。
第一种校准步骤为：将校准品溶液滴加在所述纳米检测芯片的校准区域，通过精确分子量进行校准。
第二种校准步骤为：将校准品溶液置于所述储液容器的校准液槽内，所述纳米检测芯片倒扣于所述储液容器上，使得所述纳米检测芯片上校准区域内的垂直纳米线阵列与所述待校准品溶液接触，通过精确分子量进行校准。
本发明提供用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒及其使用方法，纳米检测芯片采用顶端—接触萃取技术，通过短时间孵育，即可将待检测液体样本中的小分子物质进行分离，无需进行复杂的样本前处理流程，结合质谱检测方法，可以实现高通量、快速地检测。此外，相较于将液体样本滴加在纳米检测芯片上或者纳米检测芯片浸渍于液体样本中的吸附方式，本发明采用的顶端—接触萃取技术，避免了液体样本中的盐沉积效应，从而剔除了盐沉积对质谱信号的干扰，提高了检测精度，尤其适用于比如海水等含盐量高的液体样本的检测。
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒及其使用方法进行详细描述。
实施例1硅纳米检测芯片的制备方法
本实施例中的纳米检测芯片是通过单晶硅片经过金属辅助刻蚀得到的，具体制备过程如下：
S101，利用金刚石刀对单晶硅片进行切割，得到规整尺寸的长方形硅片，然后使用浓硫酸和过氧化氢的混合溶液、丙酮、乙醇、异丙醇或去离子水等进行超声清洗，除去材料表面的有机物、灰尘等。
S102，将表面预处理过的单晶硅片浸入含0.02mol/L硝酸银和4.8mol/L氢氟酸的混合溶液中，于室温下刻蚀15min。刻蚀完成后，用去离子水冲洗硅片表面，直至表面没有氢氟酸残留，然后再浸入稀硝酸中浸泡2h，除去沉积在硅片表面的银，除银完成后，用去离子水冲洗硅片表面，直至表面没有稀硝酸残留，最终得到亲水性的无修饰的垂直阵列结构硅纳米检测芯片。其中，垂直硅纳米线阵列长度为1-3μm，尺寸为50-200nm。
S103，用引发剂对垂直阵列结构的硅纳米检测芯片进行修饰。引发剂可以为含氟聚合物分散液、含氟硅烷、硅氧烷、月桂酸等。
含氟聚合物分散液修饰具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米检测芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，在表面涂覆一层含氟聚合物分散液，室温下反应30min，用旋涂仪旋干后得到表面有含氟聚合物颗粒的硅纳米检测芯片。
含氟硅烷修饰具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米检测芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，以甲苯为溶剂，控制严格干燥的条件下与含氟硅烷反应30min，后用甲苯浸泡洗涤15min除去多余的含氟硅烷，晾干后得到表面有含氟硅烷修饰的硅纳米检测芯片。
含氨基硅氧烷修饰的具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米检测芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，以甲苯为溶剂，控制严格干燥的条件下与含氨基硅氧烷反应30min，后用甲苯浸泡洗涤15min除去多余的含氨基硅氧烷，晾干后得到表面有含氨基硅氧烷修饰的硅纳米检测芯片。
硅氧烷修饰的具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米检测芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，在表面涂覆一层硅氧烷，室温下反应30min，用旋涂仪旋干后得到表面有硅氧烷修饰的硅纳米检测芯片。
月桂酸修饰的具体过程为：将具有垂直阵列结构的硅纳米检测芯片依次用去离子水和乙醇洗涤并晾干后，以氯仿为溶剂，控制严格干燥的条件下与月桂酸反应30min，后用氯仿浸泡洗涤15min除去多余的月桂酸，晾干后得到表面有月桂酸修饰的硅纳米检测芯片。
本实施例中制备的硅纳米检测芯片，垂直硅纳米线阵列不仅具备优异的吸附萃取能力，而且通过表面引发剂修饰，进一步降低了芯片的背景噪音。
实施例2试剂盒应用于尿液检测
收集健康志愿者和膀胱癌患者空腹状态下的中段晨尿，尿液样本收集前8小时内避免进食，饮酒，服药等活动。
对尿液样本进行离心除去不溶物后，冷冻保存备用。
本发明申请试剂盒采用的顶端—接触萃取制样：将校准品或尿液样本置于储液容器的样本液槽内，将硅纳米检测芯片倒扣在储液容器的表面，垂直硅纳米线阵列顶端接触尿液样本，对代谢物进行吸附萃取，静置20min。萃取完全后，用N2缓速将表面剩余液滴吹干，将表面萃取吸附有代谢分子的硅纳米检测芯片用碳导电胶贴于靶板上，于干燥真空环境中保存至质谱检测。
图3展示了硅纳米检测芯片检测小分子物质的背景噪音，图4展示了硅纳米检测芯片不同吸附萃取时间下代谢物出峰的总离子强度。
传统的直接滴加制样：在硅纳米检测芯片表面滴加校准品或尿液样本，在室温下自然干燥或N2缓速吹干，通过碳导电胶将硅纳米线芯片贴于靶板上，于干燥真空环境中保存至质谱检测。
本实施例中，进一步比较了传统的直接滴加制样方式与顶端—接触萃取制样方式得到的硅纳米检测芯片微观结构差异，所用的样本为加入1M尿素后的标准品混合溶液。如图5A和5C所示，直接滴加制样方式得到的硅纳米检测芯片表面有明显的结晶，不适于质谱检测，而从图5B和5D可以看出，顶端—接触萃取制样方式得到的硅纳米检测芯片表面没有出现结晶，保证了检测的灵敏度。
本实施例中，还对试剂盒中硅纳米检测芯片的顶端-接触萃取的各项性能进行了试验评估。
(1)针对硅纳米检测芯片的顶端-接触萃取的萃取性能进行评估。
以一系列不同浓度(0.01，0.1，0.2，0.5，1M)的校准品溶液和加标尿液样本为检测对象，在反射负离子模式下，计算不同浓度校准品溶液与加标尿液样本的线性关系与回收率，评估萃取性能。
所述校准品溶液或加标生物样本包括：牛磺酸、哌啶酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸以及磺基丙氨酸的校准品溶液；加入牛磺酸、哌啶酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸以及磺基丙氨酸标准品的尿液混合样本(30例健康志愿者)。
图6展示了硅纳米检测芯片对不同浓度校准品溶液吸附萃取后的线性关系，如图所示，针对不同浓度校准品均具备良好的线性关系。
图7展示了硅纳米检测芯片对不同标准品溶液萃取后的回收率。
(2)针对硅纳米检测芯片的顶端-接触萃取技术的耐盐性进行评估。
以一系列含有不同浓度尿素(0，0.05，0.1，0.5，1M)的校准品混合溶液与加盐尿液样本为检测对象，在反射负离子模式下，评估不同浓度尿素干扰时采用顶端-接触萃取技术出峰的稳定性与代谢物的信噪比，并与传统直接滴加-干燥制样所得的结果进行比较。
所述加入尿素干扰的校准品混合溶液或生物样本包括：加入不同浓度尿素(0，0.05，0.1，0.5，1M)的丙二酸，肌酐，肉碱，哌啶酸，谷氨酸，苹果酸，脯氨酸，天冬氨酸，组氨酸以及磺基丙氨酸的混合校准品溶液；加入不同浓度尿素(0，0.05，0.1，0.5，1M)的尿液混合样本(30例健康志愿者)。
图8和图9分别展示了硅纳米检测芯片对不同浓度尿素干扰下校准品混合溶液检测的质谱图和稳定性，从图中可以看出，采用传统滴加制样的方式，获得的质谱图受盐浓度的干扰较大，谱图一致性较差，而采用顶端-接触萃取技术，即使在不同盐浓度的干扰下，仍能获得较为稳定一致的质谱图。如图9所示，代表不同盐浓度下获得的质谱归一化峰强度与未加盐溶液归一化峰强度的比值，比值越接近于1，对数箱形图越接近于0，表示在盐浓度干扰下的出峰越稳定，一致性越高。从图9可以看出，相较于传统滴加的制样方式，采用顶端接触-萃取技术在不同盐浓度干扰下能获得更为稳定一致的谱图。
图10和图11分别展示了硅纳米检测芯片对不同浓度尿素干扰下混合尿液检测的质谱图和稳定性，
从图10中可以看出，相较于传统滴加的方法，采用顶端-接触萃取技术，在不同盐浓度的干扰下，仍能获得较为稳定一致的尿液代谢谱。如图11所示，代表不同盐浓度下获得的尿液归一化代谢峰强度与未加盐尿液归一化代谢峰强度的比值，从图中可以看出，采用顶端接触-萃取技术在不同盐浓度干扰下的峰强度比值更接近于1，对数箱形图更趋近于0，代表技术的抗盐性更高。
(3)针对硅纳米检测芯片的顶端-接触萃取技术对尿液梯度稀释的出峰稳定性评估。
以一系列梯度稀释(0.0625U，0.125U，0.25U，0.5U，1U)的混合尿液样本为检测对象，在反射负离子模式下，评估顶端—接触萃取技术在梯度稀释下的出峰稳定性，并与传统的直接滴加-干燥制样所得的结果进行比较；所述生物样本为尿液混合样本(30例健康志愿者)。
图12展示了硅纳米检测芯片对不同梯度稀释下混合尿液检测的稳定性，
如图12所示，代表不同稀释梯度下获得的尿液归一化代谢峰强度与稀释梯度最高的尿液样本归一化代谢峰强度的比值，从图中可以看出，采用顶端接触-萃取技术在不同稀释梯度下的峰强度比值更接近于1，对数箱形图更趋近于0，代表技术的抗盐性更高。
(4)针对硅纳米检测芯片的顶端—接触萃取技术对消除尿液样本个体差异性的效果评估。
以5例健康志愿者的尿液样本为检测对象，在反射负离子模式下，评估不同样本出峰的相似性，并与传统的直接滴加-干燥制样所得的结果进行比较。
图13展示了硅纳米检测芯片对不同尿液样本检测的质谱图，从图中可以看出，采用顶端接触萃取技术可以显著降低不同个体间因为饮食习惯导致的盐浓度差异对代谢质谱出峰的影响，不同个体间尿液代谢谱形一致性更高。
(5)针对硅纳米检测芯片的顶端—接触萃取技术对膀胱癌患者的尿液样本与健康对照分析。
硅纳米检测芯片通过对尿液样本中特征标志物吸附萃取，进行质谱检测，对膀胱癌及健康人群尿液样本进行区分。
针对膀胱癌患者尿液代谢物的检测，获得了与膀胱癌显著相关的代谢标志物信息，揭示了膀胱癌患者中γ-氨基丁酸(GABA)、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、n-乙酰缬氨酸、n-乙酰苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸和烟酸表达上调，而肌酐、牛磺酸、柠檬酸和月桂酸表达下调。
图14展示了硅纳米检测芯片的顶端—接触萃取技术对膀胱癌尿液样本与健康对照样本的判别分析结果，从图中可以看出，基于代谢谱分析，结合主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判别分析(OPLSDA)算法，可以将膀胱癌患者的尿液样本与健康对照分开，具有较好的判别效果。
实施例3试剂盒应用于高盐海水样本中农药残留的检测
制备人造海水样本，加入不同浓度2,4-D除草剂标品(4，8，16.875，33.75，67.5，135，270以及540mg/L)，采用硅纳米检测芯片进行顶端—接触萃取，萃取完全后，用N2缓速将表面剩余液滴吹干，用碳导电胶固定于靶板上，送入质谱仪于负离子的反射模式下进行检测。
图15是含有不同浓度2,4-D标品的人造海水经过硅纳米检测芯片萃取后的线性关系，图16是含有2,4-D标品的人造海水样品的最低检测限。从图中可以看出，该试剂盒对于海水中的2,4-D检测具有较好的线性关系，线性检测范围为8-540mg/L，最小检测限为4mg/L。
实施例4试剂盒应用于乳液样本的检测
在液体乳样本(牛奶)中加入不同浓度三聚氰胺标品溶液(1,5,10,25,50,100,200,300,375,750,1500以及3000μg/mL)，采用硅纳米检测芯片进行顶端—接触萃取，萃取完全后，用N2缓速将表面剩余液滴吹干，用碳导电胶固定于靶板上，送入质谱仪于负离子的反射模式下进行检测
图17是含有不同浓度三聚氰胺的乳液样本经过硅纳米检测芯片萃取后的线性关系，图18是含有三聚氰胺的乳液样本的最低检测限。从图中可以看出，该试剂盒对于牛奶中的三聚氰胺检测具有较好的线性关系，线性检测范围为50～3000μg/mL，最小检测限为25μg/mL。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (14)

1.一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
储液容器，用于储存所述液体样本；
纳米检测芯片，包括基底和设于所述基底上的垂直纳米线阵列，使用时倒扣于所述储液容器上，使得至少部分所述垂直纳米线阵列与所述液体样本接触；和
校准品，包括4种及以上分子量明确的小分子混合物，用于质谱仪的分子量校准和质谱信号稳定性判断。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米检测芯片包括检测区域和校准区域，位于所述检测区域内的垂直纳米线阵列使用时能够与所述液体样本接触。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述储液容器整体为板状，其表面设有用于储存所述液体样本的样本液槽。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述储液容器的表面还设有用于储存所述校准品的校准液槽，位于所述校准区域内的垂直纳米线阵列使用时能够与所述校准品接触。
5.如权利要求1～4任一项中所述的试剂盒，其特征在于，所述纳米检测芯片为硅纳米检测芯片，所述垂直纳米线阵列为硅纳米线阵列，表面涂覆具有小分子物质萃取能力的聚合物或键合官能团。
6.如权利要求1～4任一项中所述的试剂盒，其特征在于，在所述储液容器与所述纳米检测芯片的接触面上设有定位突起，在所述纳米检测芯片表面对应位置上设有定位插槽。
7.如权利要求1～4任一项中所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭容器，使用时所述储液容器和所述纳米检测芯片置于所述封闭容器内部，防止外部因素干扰。
8.如权利要求1～4任一项中所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于检测液体样本中的小分子物质，所述液体样本包括尿液、农药残留水体样本、含乳液体、饮料或海水。
9.一种用于液体样本小分子物质快速检测的激光解吸离子化质谱试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，将待分析液体样本置于储液容器的样本液槽内；
步骤二，将纳米检测芯片倒扣于所述储液容器上，使得所述垂直硅纳米线阵列与所述待分析液体样本接触，对所述待分析液体样本中的小分子物质进行吸附萃取；
步骤三，吸附萃取结束后，用氮气或干净空气缓速将所述纳米检测芯片表面吹干；
步骤四，将垂直硅纳米线阵列上吸附萃取了小分子物质的纳米检测芯片作为靶材进行质谱检测，获得小分子物质的质谱信号。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括校准步骤，所述校准步骤为：
将校准品溶液滴加在所述纳米检测芯片的校准区域，按照所述权利要求9步骤四获得标准物质质谱信号，进行精确分子量校准；或
将校准品溶液置于所述储液容器的校准液槽内，所述纳米检测芯片倒扣于所述储液容器上，使得所述纳米检测芯片上校准区域内的垂直硅纳米线阵列与所述待校准品溶液接触，按照所述权利要求9步骤四获得标准物质质谱信号，进行精确分子量校准。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述小分子物质至少包括代谢小分子、药物或添加剂其中之一。
12.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述质谱检测包括激光解吸离子化质谱或二次离子质谱。
13.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述试剂盒用于检测尿液样本中的代谢小分子及高盐液体样本中的小分子物质。
14.如权利要求1～8任一项中所述的试剂盒在膀胱癌和健康人群尿液样本进行区分中的应用，其特征在于，所述试剂盒通过对尿液样本中特征标志物的检测，对膀胱癌及健康人群尿液样本进行区分，所述特征标志物包括γ-氨基丁酸、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、n-乙酰缬氨酸、n-乙酰苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、烟酸、肌酐、牛磺酸、柠檬酸和月桂酸。
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