CN113528477B

CN113528477B - 一种能降解黄曲霉毒素b1的锰过氧化物酶的突变体构建方法及其应用

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Publication number: CN113528477B
Application number: CN202110958714.3A
Authority: CN
Inventors: 夏雨; 何瑞; 吴梓凤; 王周平; 秋杨煜; 程倩倩
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-08-20
Filing date: 2021-08-20
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2041-08-20
Also published as: CN113528477A

Abstract

本发明公开了一种能降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的突变体构建方法及其应用，属于生物遗传工程技术。本发明提供了一种降解率提高的降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的突变体，所述突变体具有如下至少一个位点的突变：N105G、N112D、H197D、K204V或T243Q。采用本发明提供的锰过氧化物酶突变体，在相同条件下与未突变的锰过氧化物酶具有相似或较高的催化活性，重组酶表达的锰过氧化物酶酶活显著提高。本发明通过分析有针对性的对锰过氧化物酶PhcMnp的氨基酸残基或结构进行改进，通过基因工程方法来获得突变体，所得突变体对黄曲霉毒素B₁的较高降解效率等特性更加适应工业化生产。

Description

一种能降解黄曲霉毒素B1的锰过氧化物酶的突变体构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种能降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的突变体构建方法及其应用，属于生物遗传工程技术。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin)主要是由黄曲霉、寄生曲霉等多种真菌产生的有毒次级代谢产物，其中黄曲霉毒素B₁(Aflatoxin B₁，AFB₁)是已知黄曲霉毒素家族中毒性最大的，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物，对人和家畜的健康产生极大的威胁。因此在食品、饲料等行业中，黄曲霉毒素B₁的脱毒和降解显得尤为重要。

传统的黄曲霉毒素的脱毒方式有物理和化学方法。物理方法主要包括高温法、辐射法和物理吸附法。其中，采用高温法要加热至300℃才能使黄曲霉毒素B₁有明显的分解，不适合实际生产应用；辐射法存在放射性污染问题，且目前对辐射机理的认知还不够全面，成本也较高。化学法主要包括碱处理法和氧化法，但化学法对黄曲霉毒素B₁降解不彻底，在碱性条件下，黄曲霉毒素B₁的内酯环被打开，毒性消失，然而从碱性恢复到中性时，打开的内酯环会重新连接成毒素。其次，化学法安全性有待于评估，对产品的其他成分也有一定程度的破坏。黄曲霉毒素B₁的生物脱毒主要是利用微生物或其产生的酶及其制剂通过生物催化的方法脱毒，与物理、化学方法相比，生物脱毒条件相对温和且高效，产品的品质得以保证，甚至有些益生菌还能提升产品的营养价值。

已知锰过氧化物酶(MnP)家族具有降解芳香族化合物的特殊能力，因此其在纸浆的生物漂白、农业废弃物的处理、有机污染物和真菌毒素的降解等方面有重要作用。目前有文献报道锰过氧化物酶家族能在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)以及大肠杆菌(Escherichia coli)中成功异源表达；巴斯德毕赤酵母表达系统需要利用有害化学物质甲醇进行诱导表达，因而限制了其应用；而使用大肠杆菌作为表达宿主时，锰过氧化物酶蛋白质不能够正确折叠，一般以没有活性的包涵体形式存在，需要繁琐的重折叠过程使酶恢复活性，实验操作繁杂且成本高，目前还不适合应用于食品工业、农业等领域。

因此，如何能够提高锰过氧化物酶(MnP)的降解黄曲霉素B₁，并且提供一种能够适合食品工业、农业生产的异源表达系统，成为研究的热点。

发明内容

为提高对黄曲霉毒素B₁的降解率，本发明选用来源于Phanerodontiachrysosporium(原称：Phanerochaete chrysosporium)的锰过氧化物酶基因(NCBIGenBank:AAA33745.1)，通过分析酶结构上的潜在突变位点，选择一个或多个突变位点，应用分子生物学技术构建定点突变，并在食品级菌株乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)中异源表达构建重组菌株，筛选出降解率提高的突变体进一步推进降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的优良改造，为工业化生产奠定基础。

本发明的目的在于提供一种降解率提高的降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的突变体及其构建方法。

本发明提供了一种降解率提高的降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的突变体，具有如下至少一个位点的突变：

N112D、H197D、T243Q、N105G或K204V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第112位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，命名为N112D。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸，命名为H197D。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第243位的苏氨酸突变为谷氨酰胺，命名为T243Q。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第105位的天冬酰胺突变为甘氨酸，命名为N105G。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸，命名为K204V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第112位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸，命名为N112D/K204V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸，同时将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸，命名为H197D/K204V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸，并将第243位的苏氨酸突变为谷氨酰胺，命名为K204V/T243Q。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第112位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸，并将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸，命名为N112D/H197D/K204V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸，并将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸，并将第243位的苏氨酸突变为谷氨酰胺，命名为H197D/K204V/T243Q。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基础上，将第112位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸，并将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸，并将第243位的苏氨酸突变为谷氨酰胺，命名为N112D/H197D/K204V/T243Q。

本发明还提供一种降解率提高的锰过氧化物酶突变体的构建方法，步骤包括：

1)对锰过氧化物酶的核酸序列以乳酸克鲁维酵母为宿主进行密码子优化，并设计上下游引物；利用上下游引物，通过PCR扩增法，采用一定的PCR反应体系和一系列温度控制，扩增锰过氧化物酶基因；

2)使用常规的酶切、连接方式克隆锰过氧化物酶基因至乳酸克鲁维酵母表达载体，使用常规的乳酸克鲁维酵母培养基培养菌，含有MnSO₄和hemin的YEPG培养基诱导目的蛋白的表达；

3)利用专业软件计算锰过氧化物酶结构上的关键氨基酸残基位置作为突变位点，选择一个或多个突变位点；

4)通过全质粒突变法引入定点突变，采用1)、2)中的方法获得重组载体和重组细胞进行突变基因的扩增和工程菌的培养，建立锰过氧化物酶突变库；

5)使用常规培养方法将工程菌扩大培养，后通过检测上清液中锰过氧化物酶的酶活及对毒素的降解率来筛选高酶活、高降解率的突变体。

在本发明的一种实施方式中，本发明的最终核酸序列通常可以用PCR扩增法、基因重组或人工合成中的一种或几种方法获得；之后再将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明还提供了编码所述降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pKLAC1。

本发明还提供了表达上述降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶突变体的重组微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组微生物细胞以乳酸克鲁维酵母为宿主，所述表达载体为pKLAC1，是将SEQ ID NO.2所示基因序列克隆到pKLAC1中得到重组质粒pKLAC1-PhcMnp。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸克鲁维酵母为乳酸克鲁维酵母GG799。

本发明还提供了一种制备上述锰过氧化物酶突变体的方法，所述方法是，培养表达上述锰过氧化物酶突变体的所述重组微生物，收集重组微生物细胞内或培养液中的锰过氧化物酶突变体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组微生物细胞的构建方法为：通过PCR克隆锰过氧化物酶突变体基因，将克隆获得的基因与表达载体连接，获得重组表达载体；然后将所述重组表达载体转化到宿主细胞内，获得表达锰过氧化物酶突变体的重组微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体为，对重组质粒pKLAC1-PhcMnp核酸序列进行分析，设计拟突变位点的PCR用引物(正向引物F、逆向引物R)；利用所述F和R引物，采用一定的PCR反应体系和一系列温度控制，通过PCR扩增锰过氧化物酶PhcMnp所在质粒(pKLAC1-PhcMnp)的序列全长，上述PCR扩增产物经过DpnI酶消化处理后，转化到大肠杆菌宿主菌DH5α中进行扩增、抽提质粒，通过酶切、测序验证等方法获得发生预期突变的突变体质粒，将上述突变体质粒转化到乳酸克鲁维酵母宿主菌GG799中，得到重组酵母转化子，通过抽提重组酵母转化子全基因组序列、测序验证等方法，获得整合有突变体基因的重组酵母菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将重组微生物细胞在培养基中培养至OD₆₀₀达到1.0时，转接至YEPG诱导培养基中，于28～30℃、150～300rpm诱导72～120h产酶；

所述YEPG诱导培养基含有10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L半乳糖，0.5mmol/LMnSO₄和0.2mmol/L hemin，其中起诱导作用的成分是培养基中含有的半乳糖。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括收集培养液中的粗酶液，离心、纯化步骤。

本申请所用的术语“转化”是基因工程领域技术人员熟知的方法：将含有目的基因的表达载体导入宿主细胞内，转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括：电转化、采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染、微粒轰击、脂质体转染、感染等。本发明中较佳的方法电转化法；随后，在适宜的培养条件下繁殖宿主细胞。

本领域技术人员根据常规试验就能选择和确定培养基配方、培养温度、诱导物、诱导剂量和时间等条件。采用本领域常规检测手段，如聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、酶活测定法等，可以检测出本发明融合酶的表达，本发明采用1％琼脂糖凝胶电泳检测。最后，用常规的蛋白分离纯化技术，进行融合酶的纯化，其包括离心、过滤、浓缩、层析等过程；具体地，层析方法又包括亲和层析、凝胶过滤、离子交换色谱及疏水层析等；本发明提供的融合酶分离浓缩方法为10kDa的超滤浓缩管进行超滤浓缩。

本发明还提供了所述锰过氧化物酶突变体在降解黄曲霉毒素B₁中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述锰过氧化物酶突变体，或含所述锰过氧化物酶突变体的微生物发酵上清液添加至含有黄曲霉毒素B₁的反应体系中，进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的反应条件为：pH 4.0～5.0，30～50℃下反应7～9h。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中还含有MnSO₄，H₂O₂。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中黄曲霉毒素B₁的浓度为5μg/mL。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中MnSO₄浓度为0.1～1.0mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，反应体系中H₂O₂浓度为0.1～5.0mmol/L。

在本发明的一种实施方式中，锰过氧化物酶突变体浓度为0.1～5.0mg/mL。

本发明还提供了所述锰过氧化物酶突变体在在制备可降解黄曲霉毒素B₁的产品中的应用。

有益效果

(1)本发明提供的锰过氧化物酶突变体，在相同条件下与未突变的锰过氧化物酶具有相似或较高的催化活性，重组酶表达的锰过氧化物酶酶活显著提高。

(2)本发明通过分析有针对性的对锰过氧化物酶PhcMnp的氨基酸残基或结构进行改进，通过基因工程方法来获得突变体，所得突变体对黄曲霉毒素B₁的较高降解效率等特性更加适应工业化生产。

附图说明

图1：锰过氧化物酶PhcMnp的单点突变体的酶活力对比图。

图2：表达锰过氧化物酶PhcMnp的单点突变体的重组乳酸克鲁维酵母发酵上清液对黄曲霉毒素B₁降解率对比图。

图3：锰过氧化物酶PhcMnp的多位点组合突变体的酶活力对比图。

图4：表达锰过氧化物酶PhcMnp的多位点组合突变体的重组乳酸克鲁维酵母发酵上清液对黄曲霉毒素B₁降解率对比图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。

本发明生物材料的来源的一般性说明：

1、引物合成：本发明中所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、实验中所使用的所有培养基配料、所有限制性内切酶均购于Thermo FisherScientific公司。PCR产物纯化试剂盒、胶回收产物纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒、真菌基因组提取试剂盒、Phusion酶、T4 DNA连接试剂盒、Protein Ladder、DNA Marker、超滤浓缩管、BCA蛋白定量试剂盒等均购于Thermo Fisher Scientific公司。序列测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

下述实施例中所涉及的黄曲霉毒素B₁购自Sigma-Aldrich公司；hemin(氯高铁血红素)购自阿拉丁试剂(上海)有限公司；MnSO₄、H₂O₂、丙二酸、丙二酸钠等均购自国药集团化学试剂有限公司。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：5g/L酵母粉、10g/L胰蛋白胨、10g/L NaCl。

YEPD液体培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。

YEPG诱导培养基：酵母粉10g/L、蛋白胨20g/L、半乳糖20g/L，该培养基中的添加物为：0.5mmol/L MnSO₄和0.2mmol/L hemin。

YCB平板培养基：3.4g/L YNB、10g/L葡萄糖、15g/L琼脂粉、5.0mmol/L乙酰胺。

下述实施例中所涉及的溶液配制方法为：

丙二酸缓冲液(pH 4.0)：丙二酸缓冲液由70.0mmol/L丙二酸溶液(溶液A)和70.0mmol/L丙二酸钠溶液(溶液B)混合配制而成。70.0mmol/L丙二酸溶液(溶液A)配制方法：称取0.58g丙二酸溶于超纯水定容至100.0mL；70.0mmol/L丙二酸钠溶液(溶液B)配制方法：称取0.74g丙二酸钠溶于超纯水中，定容至100.0mL。将溶液A和溶液B分别取一定量混匀至pH达到4.0，常温保存备用。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

锰过氧化物酶酶活的检测：

用酚红法测定锰过氧化物酶(PhcMnp)的酶活。具体方法是：0.01mol/L MnSO₄、0.1mol/L丙二酸钠缓冲液(pH 4.5)，0.25mmol/L酚红和1.0mL粗酶液。测量624nm处的吸光度，加0.1mol/L H₂O₂，在30℃下反应5min，然后立即用1％NaOH终止，再测量624nm处的吸光度，计算两次之差。定义在1min内氧化1.0mmol底物所需酶的量为一个酶活力单位(U)。

比酶活定义：每毫克蛋白所具有的酶活力单位数，比酶活单位为U/mg。

黄曲霉毒素B₁的含量的检测：

通过UPLC-MS分析剩余黄曲霉毒素B₁的含量。具体的UPLC-MS检测条件如下：

(1)色谱条件：柱：C18；流速：0.30mL/min；柱温：40℃；流动相：H₂O(A相)和乙腈(B相)；梯度洗脱程序如表1所示。

表1黄曲霉毒素B₁液相色谱梯度洗脱程序表

(2)质谱条件：离子源：电喷雾离子源；质谱扫描方式：多重反应监测模式(MRM)；锥孔电压：3.0kV；加热气温度：500℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气：800L/h；质谱参数见表2所示。

表2黄曲霉毒素B₁的质谱参数表

注：*表示定量子离子

黄曲霉毒素B₁降解率的计算：

AFB₁降解率计算公式如下：

实施例1锰过氧化物酶PhcMnp突变热点的选择和突变方法

所述锰过氧化物酶PhcMnp未突变酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过分析确定突变热点，选取并进行了如下突变：R32A、E59A、I65L、H70D、N105G、N105A、N105L、S110I、S110A、N112D、L138V、K174S、R178E、F179M、S192A、H197D、H197P、H197Y、V199I、R201A、K204V、K204E、V205I、T243Q、T243P、L300M。

具体步骤如下：

(1)采用PCR扩增法，设计上下游引物，利用上下游引物，采用如下所述的PCR反应体系和一系列温度控制，以重组质粒pKLAC1-PhcMnp为模板进行PCR反应(该质粒的构建方法参考学位论文《锰过氧化物酶的酵母异源表达及其降解黄曲霉毒素研究》)。例如，以重组质粒pKLAC1-PhcMnp为模板，以Pri-R32A-F和Pri-R32A-R为引物引入R32A突变；PCR扩增产物用DpnI限制性内切酶进行酶切、回收后，与载体pKLAC1连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂抗性平板，37℃过夜培养。

(2)在抗性平板上挑取阳性克隆，用BglII、SalI双酶切验证，并将验证正确的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序后发生上述突变的质粒和含质粒的大肠杆菌菌种进行保藏。组合突变的步骤是在单点突变序列的基础上，依次用对应于不同突变位点的引物，对已获得的突变体继续进行PCR反应，从而引入更多突变位点，直至获得目标组合突变体。

本实施例中所述的PCR突变反应体系及程序如表3所示，DpnI酶切反应体系如表4所示。

表3 PCR突变反应体系及程序表

表4 DpnI酶切反应体系表

本实施例中所述的突变引物如表5所示：

表5锰过氧化物酶PhcMnp突变所需引物序列

实施例2表达锰过氧化物酶PhcMnp突变体的重组酵母菌的构建

具体步骤如下：

用SacII限制性内切酶对实施例1构建的重组质粒进行线性化，采用PCR产物纯化试剂盒纯化回收酶切产物。制备乳酸克鲁维酵母GG799感受态细胞并用电脉冲法将线性化的质粒转化到乳酸克鲁维酵母GG799感受态细胞中。电击后的酵母细胞立即加入1.0mL预冷的山梨醇溶液，30℃孵育1～3h，离心收集酵母菌体，留100μL重悬菌体，均匀涂布在含有乙酰胺的YCB平板上，于30℃培养3～5d。挑取转化后平板上多个生长良好的单一菌落，接种于10.0mL YEPD液体培养基的试管中，于30℃、200rpm过夜培养。离心收集菌体，根据真菌基因组抽提试剂盒的要求抽提重组菌基因组。在测定基因组DNA浓度后，以此DNA作为模板，进行PCR验证。将验证成功的PCR产物及对应的重组酵母菌送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序正确的重组酵母菌进行保藏。

实施例3锰过氧化物酶PhcMnp突变体的表达、酶活力测定及对黄曲霉毒素B₁的降解具体步骤如下：

(1)取出实施例2保存的测序验证正确、携带突变体基因的重组酵母菌进行活化。挑取单菌落于10.0mL YEPD培养基中，在30℃，200rpm条件下，培养18～22h。当OD₆₀₀达到1.0时，以1％(1mL/100mL)的接种量转接至含有0.5mmol/L MnSO₄和0.2mmol/L hemin的YEPG诱导培养基中，于30℃、200rpm诱导72h产酶(分泌表达)。

发酵结束后8000rpm离心，收集发酵上清液，并用截留分子量为10kDa的超滤离心管浓缩。用蛋白质定量试剂盒对浓缩前后的发酵液进行蛋白质定量后，用SDS-PAGE电泳鉴定目标蛋白质是否表达且条带大小是否正确。

按照上述酚红法测定发酵上清液中单点突变的锰过氧化物酶PhcMnp的比酶活力，结果如表6及图1所示。

表6锰过氧化物酶PhcMnp的单点突变体的比酶活力

(2)利用锰过氧化物酶突变体的重组乳酸克鲁维酵母发酵上清液降解黄曲霉毒素B₁，具体反应体系和反应过程如下，反应体系总体积为1.0mL：

向丙二酸缓冲液(pH 4.0)中分别添加黄曲霉毒素B₁、MnSO₄、H₂O₂及上述步骤(1)制备得到的锰过氧化物酶突变体菌株的发酵上清液，得到反应体系；其中，黄曲霉毒素B₁在反应体系中的终浓度为5.0μg/mL，MnSO₄在反应体系中的终浓度为0.2mmol/L，H₂O₂在反应体系中的终浓度为1.0mmol/L，上述发酵上清液中的蛋白质在反应体系中的添加量(终浓度)为0.1mg/mL，将反应体系在40℃条件下，反应8h后，加入3.0mL甲醇以终止反应。反应物用0.22μm滤膜过滤后，通过UPLC-MS分析剩余黄曲霉毒素B₁的含量，并分析单点突变的锰过氧化物酶PhcMnp突变体对黄曲霉毒素B₁的计算降解率，结果如表7及图2所示。

表7锰过氧化物酶PhcMnp的单点突变体对黄曲霉毒素B₁的降解率

从表7及图2中可以看出，突变体N105G、N112D、H197D、K204V、T243Q对黄曲霉毒素B₁具有较高的降解效果，降解率分别为58.83％、64.28％、54.33％、59.26％、61.37％，相对于未突变的锰过氧化物酶对黄曲霉毒素B₁的降解率，均有所提高。

实施例4锰过氧化物酶PhcMnp的两点组合突变体对黄曲霉毒素B₁的降解结果

根据实施例2～3得到的单点突变的有效位点，在单点突变N105G、N112D、H197D、K204V、T243Q的基础上，对锰过氧化物酶PhcMnp进行两点组合突变，组合突变的步骤为：以含有单点突变的重组质粒为模板，依次用对应于其他不同突变位点的引物，对已获得的含单点突变的重组质粒继续进行PCR反应，从而引入更多突变位点，直至获得含组合突变体基因的重组质粒。PCR反应条件如实施例1中所述。

按照实施例2相同方法在乳酸克鲁维酵母中进行了突变体酶的分泌表达。

用得到的发酵上清液进行黄曲霉毒素B₁降解试验，反应体系与实施例3的步骤(2)中反应体系相同。发酵上清液中两点组合突变的锰过氧化物酶PhcMnp突变体的比酶活力，以及经UPLC-MS检测的其对黄曲霉毒素B₁的降解率的结果如表8和图3～4所示。

表8锰过氧化物酶PhcMnp的两点组合突变体的比酶活力及其对黄曲霉毒素B₁的降解率

从表8及图3～4可以看出，两位点组合突变的锰过氧化物酶PhcMnp突变体组合N112D/K204V、H197D/K204V、K204V/T243Q对黄曲霉毒素B₁具有较高的降解效果，降解率分别为79.24％、74.26％、71.68％，相对于未突变的锰过氧化物酶对黄曲霉毒素B₁的降解率，均有所提高。

实施例5锰过氧化物酶PhcMnp的多位点组合突变体对黄曲霉毒素B₁的降解结果

根据实施例4得到的两位点组合突变结果，在此基础上，对锰过氧化物酶PhcMnp进行多位点组合突变。组合突变的步骤是：以含有实施例4所述两位点组合突变的重组质粒为模板，依次用对应于其他不同突变位点的引物，对已获得的突变体继续进行PCR反应，从而引入更多突变位点，直至获得目标组合突变体。PCR反应条件如实施例1中所述。

用得到的粗酶液进行毒素降解试验，反应体系与实施例3的步骤(2)中反应体系相同。发酵上清液中多位点组合突变的锰过氧化物酶PhcMnp突变体的比酶活力，以及经UPLC-MS检测的其对黄曲霉毒素B₁的降解率的结果如表9和图3～4所示。

表9锰过氧化物酶PhcMnp的多位点组合突变体对黄曲霉毒素B₁的降解率

从表9和图3～4可以看出，三位点组合突变的锰过氧化物酶PhcMnp突变体组合N112D/H197D/K204V和H197D/K204V/T243Q对黄曲霉毒素B₁具有较高的降解效果。而随着突变的氨基酸残基位点数的继续增加，突变体组合N112D/H197D/K204V/T243Q对黄曲霉毒素B₁具有最高的降解率，为91.49％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种能降解黄曲霉毒素B1的锰过氧化物酶的突变体构建方法及其应用

<130> BAA210883A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 382

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Phe Gly Ser Leu Leu Ala Phe Val Ala Leu Ala Ala Ile Thr

1 5 10 15

Arg Ala Ala Pro Thr Ala Glu Ser Ala Val Cys Pro Asp Gly Thr Arg

20 25 30

Val Thr Asn Ala Ala Cys Cys Ala Phe Ile Pro Leu Ala Gln Asp Leu

35 40 45

Gln Glu Thr Leu Phe Gln Gly Asp Cys Gly Glu Asp Ala His Glu Val

50 55 60

Ile Arg Leu Thr Phe His Asp Ala Ile Ala Ile Ser Gln Ser Leu Gly

65 70 75 80

Pro Gln Ala Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Met Leu His Phe Pro Thr

85 90 95

Ile Glu Pro Asn Phe Ser Ala Asn Asn Gly Ile Asp Asp Ser Val Asn

100 105 110

Asn Leu Leu Pro Phe Met Gln Lys His Asp Thr Ile Ser Ala Ala Asp

115 120 125

Leu Val Gln Phe Ala Gly Ala Val Ala Leu Ser Asn Cys Pro Gly Ala

130 135 140

Pro Arg Leu Glu Phe Met Ala Gly Arg Pro Asn Thr Thr Ile Pro Ala

145 150 155 160

Val Glu Gly Leu Ile Pro Glu Pro Gln Asp Ser Val Thr Lys Ile Leu

165 170 175

Gln Arg Phe Glu Asp Ala Gly Asn Phe Ser Pro Phe Glu Val Val Ser

180 185 190

Leu Leu Ala Ser His Thr Val Ala Arg Ala Asp Lys Val Asp Glu Thr

195 200 205

Ile Asp Ala Ala Pro Phe Asp Ser Thr Pro Phe Thr Phe Asp Thr Gln

210 215 220

Val Phe Leu Glu Val Leu Leu Lys Gly Thr Gly Phe Pro Gly Ser Asn

225 230 235 240

Asn Asn Thr Gly Glu Val Met Ser Pro Leu Pro Leu Gly Ser Gly Ser

245 250 255

Asp Thr Gly Glu Met Arg Leu Gln Ser Asp Phe Ala Leu Ala Arg Asp

260 265 270

Glu Arg Thr Ala Cys Phe Trp Gln Ser Phe Val Asn Glu Gln Glu Phe

275 280 285

Met Ala Ala Ser Phe Lys Ala Ala Met Ala Lys Leu Ala Ile Leu Gly

290 295 300

His Ser Arg Ser Ser Leu Ile Asp Cys Ser Asp Val Val Pro Val Pro

305 310 315 320

Lys Pro Ala Val Asn Lys Pro Ala Thr Phe Pro Ala Thr Lys Gly Pro

325 330 335

Lys Asp Leu Asp Thr Leu Thr Cys Lys Ala Leu Lys Phe Pro Thr Leu

340 345 350

Thr Ser Asp Pro Gly Ala Thr Glu Thr Leu Ile Pro His Cys Ser Asn

355 360 365

Gly Gly Met Ser Cys Pro Gly Val Gln Phe Asp Gly Pro Ala

370 375 380

<210> 2

<211> 1146

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggctttcg gttctttatt ggctttcgtt gctttagctg ctattactag agctgctcca 60

actgctgaat cagctgtttg tcctgatggt actagagtta ctaatgctgc ttgttgtgct 120

ttcattcctt tagctcaaga tttgcaagaa actttattcc aaggtgattg tggtgaagat 180

gctcatgaag ttattagatt gactttccat gatgctattg ctatttcaca atctttgggt 240

ccacaagctg gtggtggtgc tgatggttct atgttgcatt tcccaactat tgaacctaat 300

ttctcagcta ataatggtat tgatgattca gttaataatt tattgccatt catgcaaaaa 360

catgatacta tttcagctgc tgatttagtt caattcgctg gtgctgttgc tttatctaat 420

tgtcctggtg ctcctagatt ggaatttatg gctggtagac caaatactac tattccagct 480

gttgaaggtt taattccaga accacaagat tcagttacta aaattttaca aagattcgaa 540

gatgctggta atttctcacc attcgaagtt gtttctttat tagcttcaca tactgttgct 600

agagctgata aagttgatga aactattgat gctgctccat tcgattctac tcctttcact 660

ttcgatactc aagttttctt agaagtttta ttaaaaggta ctggtttccc aggttctaat 720

aataatactg gtgaagttat gtcacctttg ccattaggtt caggttctga tactggtgaa 780

atgagattac aatcagattt cgctttggct agagatgaaa gaactgcttg tttctggcaa 840

tcattcgtta atgaacaaga atttatggct gcttcattca aagctgctat ggctaaatta 900

gctattttgg gtcattctcg ctcatcttta attgattgtt ctgatgttgt tccagttcct 960

aaaccagctg ttaataaacc agctactttc ccagctacta aaggtccaaa agatttggat 1020

actttgactt gtaaggcttt aaaattccca actttgactt ctgatccagg tgctactgaa 1080

actttaattc cacattgttc taatggtggt atgtcttgtc caggtgttca attcgatggt 1140

ccagct 1146

Claims

1.一种降解率提高的降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的突变体，其特征在于，在SEQID NO.1所示氨基酸序列的基础上，进行了（a）~（e）任一突变：

（a）将第112位的天冬酰胺突变为天冬氨酸；

（b）将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸；

（c）将第243位的苏氨酸突变为谷氨酰胺；

（d）将第105位的天冬酰胺突变为甘氨酸；

（e）将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸。

2.一种降解率提高的降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的突变体，其特征在于，在SEQID NO.1所示氨基酸序列的基础上，进行了（a）~（c）任一突变：

（a）将第112位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸；

（b）将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸，并将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸；

（c）将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸，并将第243位的苏氨酸突变为谷氨酰胺。

3.一种降解率提高的降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的突变体，其特征在于，在SEQID NO.1所示氨基酸序列的基础上，进行了（a）或（b）任一突变：

（a）将第112位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸，并将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸；

（b）将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸，并将第204位的赖氨酸突变为缬氨酸，并将第243位的苏氨酸突变为谷氨酰胺。

4.一种降解率提高的降解黄曲霉毒素B₁的锰过氧化物酶的突变体，其特征在于，在SEQID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第112位的天冬酰胺突变为天冬氨酸，并将第197位的组氨酸突变为天冬氨酸，并将第204位的赖氨酸突为缬氨酸，并将第243位的苏氨酸突变为谷氨酰胺。

5.编码权利要求1~4任一所述的锰过氧化物酶突变体的基因。

6.一种制备权利要求1~4任一所述的锰过氧化物酶突变体的方法，其特征在于，培养表达权利要求1~4任一所述锰过氧化物酶突变体的重组微生物细胞，收集重组微生物细胞内或培养液中的锰过氧化物酶突变体。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组微生物细胞的构建方法为：通过PCR克隆锰过氧化物酶突变体基因，将克隆获得的基因与表达载体连接，获得重组表达载体；然后将所述重组表达载体转化到宿主细胞内，获得表达锰过氧化物酶突变体的重组微生物细胞。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法是将重组微生物细胞在培养基中培养至OD₆₀₀达到1.0时，转接至YEPG诱导培养基中，于28~30℃、150~300 rpm诱导72~120h产酶。

9.权利要求1~4任一所述的锰过氧化物酶突变体在制备可降解黄曲霉毒素B₁的产品或降解黄曲霉毒素B₁中的应用。