CN113527462A - 一种具有镇痛作用的小分子肽及其特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有镇痛作用的小分子肽及其特异性抗体。本发明提供了一段功能片段，为SEQ ID No.1自N端第872‑888位所示的氨基酸片段或SEQ ID No.2自N端第846‑861位所示的氨基酸片段。本发明还针对该功能片段设计了竞争性拮抗肽和中和性抗体。经过实验验证，竞争性拮抗肽及中和性抗体均具有镇痛功能，但是不影响基础痛阈；同时，该功能片段可以抑制神经元轴突生长，抗体能够逆转功能片段对神经元轴突生长的抑制作用。本发明为慢性痛的研究及治疗提供了新的思路。

Description

一种具有镇痛作用的小分子肽及其特异性抗体
技术领域
本发明涉及一种具有镇痛作用的小分子肽及其特异性抗体。
背景技术
疼痛是一种复杂的生理心理活动，2016年WilliamsAC等人将疼痛的定义更正为：疼痛是一种与实际或潜在组织损伤相关联的苦难经历，涉及感觉、情绪、认知和社会的多维成份。疼痛包括生理性痛(即急性痛)和病理性痛(即慢性痛)，生理性痛作为机体的一种防御机制，引起机体产生一系列防御性保护反应，促使生物体逃避疼痛源；但病理状态，如发生炎症或者神经损伤，则会使痛觉传导的效能增强，产生长期的剧烈疼痛。据有关流行病学调查显示，目前世界人口中慢性痛患病率已达14-77％，并且世界上每天有550万人忍受癌性痛(占晚期癌症病人的60-80％)，49％的疼痛患者无法参加社交活动，60％的疼痛患者导致精神抑郁。因此，疼痛作为一种慢性疾病，已成为严重影响人们生活质量的危险因素，给社会及家庭造成了巨大的经济和精神负担。因此，阐明慢性痛的发病机制以及新的镇痛药的开发，一直是国内外科学家研究的热点问题。
目前国际上对于疼痛的发病机制主要有两个主流观点，即由于外周敏化和中枢敏化所引起。外周背根神经节(Dosal root ganglin,DRG)是感觉信息传导的第一站，因此它和脊髓背角中多重因素(如炎症因子、膜上的离子通道或受体等)参与了痛觉敏化的产生和维持，使突触传递效能的增强而产生疼痛。其中，瞬时受体电位香草酸亚型1(Transientreceptorpotential vanilliod 1,TRPV1，也即辣椒素受体)是温度敏感型TRP(Transient receptorpotential)通道在疼痛的感知过程中最重要的一个分子，也是公认的参与疼痛外周敏化的关键分子。它主要表达于初级伤害性传入感觉神经元上，在热痛敏以及炎症性痛觉敏化中是一种重要的蛋白分子，对于慢性炎症性痛觉敏化的启动以及维持具有非常关键的作用。目前在疼痛的治疗上，针对外周DRG中TRPV1的镇痛药的开发成为一个主要的方向。早期研究显示TRPV1的激动剂和阻断剂特异性作为镇痛剂很有效，但都具有明显的毒副作用。所以，寻找其他调控TRPV1蛋白功能的新的分子和机制(尤其是在外周感觉神经元中)，成为目前疼痛研究领域的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有镇痛作用的小分子肽及其特异性抗体。
第一方面，本发明保护功能片段，为SEQ ID No.1自N端第872-888位所示的氨基酸片段或SEQ ID No.2自N端第846-861位所示的氨基酸片段。
第二方面，本发明保护前文所述功能片段在如下(a1)-(a12)任一种中的应用；
(a1)调控炎症性疼痛的发生；
(a2)促进炎症性疼痛的发生；
(a3)促进炎症性热痛觉敏化；
(a4)提高支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性；
(a5)调控神经元轴突生长；
(a6)抑制神经元轴突生长；
(a7)制备用于调控炎症性疼痛的发生的产品；
(a8)制备用于促进炎症性疼痛的发生的产品；
(a9)制备用于促进炎症性热痛觉敏化的产品；
(a10)制备用于提高支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性的产品；
(a11)制备用于调控神经元轴突生长的产品；
(a12)制备用于抑制神经元轴突生长的产品。
所述应用中，所述调控炎症性疼痛不影响基础痛阈。
第三方面，本发明保护前文所述功能片段的竞争性拮抗肽。
在本发明的实施例中，所述竞争性拮抗肽为SEQ ID No.1自N端第872-888位所示的氨基酸片段或SEQ ID No.2自N端第846-861位所示的氨基酸片段。
第四方面，本发明保护前文功能片段的抗体。
在本发明的实施例中，所述抗体为将所述功能片段作为免疫原，免疫动物得到抗血清；将所述抗血清纯化得到的多克隆抗体。
所述免疫原具体为所述功能片段偶联KLH得到的免疫原。
所述动物为兔子。
第五方面，本发明保护前文任一所述的拮抗肽或抗体在如下(b1)-(b12)任一种中的应用；
(b1)调控炎症性疼痛的发生；
(b2)抑制炎症性疼痛的发生；
(b3)缓解炎症性热痛觉敏化；
(b4)降低支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性；
(b5)调控神经元轴突生长；
(b6)恢复由于前文所述的功能片段导致的神经元轴突生长抑制；
(b7)制备用于调控炎症性疼痛的发生的产品；
(b8)制备用于抑制炎症性疼痛的发生的产品；
(b9)制备用于缓解炎症性热痛觉敏化的产品；
(b10)制备用于降低支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性的产品；
(b11)制备用于调控神经元轴突生长的产品；
(b12)制备用于恢复由于前文所述的功能片段导致的神经元轴突生长抑制的产品。
所述应用中，所述调控炎症性疼痛或抑制炎症性疼痛或缓解炎症性热痛觉敏化均不影响基础痛阈。
第六方面，本发明保护产品，其活性成分为前文任一所述的拮抗肽或抗体；所述产品的用途为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)调控炎症性疼痛的发生；
(b2)抑制炎症性疼痛的发生；
(b3)缓解炎症性热痛觉敏化；
(b4)降低支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性；
(b5)调控神经元轴突生长；
(b6)恢复由于前文所述的功能片段导致的神经元轴突生长抑制。
所述用途中，所述调控炎症性疼痛或抑制炎症性疼痛或缓解炎症性热痛觉敏化均不影响基础痛阈。
第七方面，本发明保护镇痛药，其活性成分为前文任一所述的拮抗肽或抗体。
所述镇痛药不影响基础痛阈。
本发明的发明人采用生信分析和行为学筛选等方法找到一个可以同时参与疼痛发生和轴突抑制的功能片段—Nogo-Aaa 846-861，并针对该功能片段设计了竞争性拮抗肽(846-861PE)和中和性抗体(Nogo-A 846-861抗体)。经过实验验证，竞争性拮抗肽(846-861PE)及中和性抗体(Nogo-A 846-861抗体)均具有镇痛功能，但是不影响基础痛阈；同时，功能片段Nogo-Aaa 846-861可以抑制神经元轴突生长，Nogo-A846-861抗体能够逆转功能片段Nogo-Aaa 846-861对神经元轴突生长的抑制作用。本发明为慢性痛的研究及治疗提供了新的思路。
附图说明
图1为鞘内注射846-861PE阻断Nogo-A信号通路后炎症痛大鼠的热痛行为学。(A、C、E和G)使用不同剂量Nogo-A拮抗肽846-861PE及其对照肽阻断Nogo-A信号通路后大鼠的同侧后足的缩足潜伏期。数据采用双因素方差分析。与对照组相比，*P<0.05。(B、D、F和H)为相对应的图A、C、E和G中CFA后1h-24h相对应缩足潜伏期的曲线下面积。数据分析采用两样本独立t检验，与对照组相比，*P<0.05。
图2为Nogo-A蛋白在WT和Nogo-AKO大鼠DRG组织中的表达情况。(A)CellSignaling Technology公司的Nogo-A抗体在WT和Nogo-AKO大鼠DRG组织中的Western Blot结果；(B)制备的Nogo-A 846-861多克隆抗体在WT和Nogo-AKO大鼠DRG组织中的WesternBlot结果；
图3为鞘内注射Nogo-A 846-861特异性抗体阻断Nogo-A信号通路后炎症痛大鼠的热痛行为学。(A)为Nogo-A 846-861特异性抗体和对照IgG两组大鼠的同侧后足的缩足潜伏期。数据采用双因素方差分析。与对照IgG组相比，*P<0.05。(B)为图A中CFA后1h-6h相对应缩足潜伏期的曲线下面积。数据分析采用两样本独立t检验，与对照IgG组相比，*P<0.05。(C)为Nogo-A 846-861特异性抗体和对照IgG两组大鼠的对侧后足的缩足潜伏期。数据采用双因素方差分析。P>0.05。(D)为图C中CFA后1h-6h相对应缩足潜伏期的曲线下面积。数据分析采用两样本独立t检验，P>0.05。
图4为Nogo-Aaa 846-861的拮抗肽846-861PE、Nogo-A 846-861特异性抗体、以及Nogo-A shRNA和Nogo-AKO对大鼠基础痛阈的影响。(A-D)依次为Nogo-A aa846-861的拮抗肽846-861PE、Nogo-A 846-861特异性抗体、Nogo-A shRNA和Nogo-A KO组大鼠的热缩足潜伏期的基础值。数据采用两独立样本t检验，P>0.05,n＝5。
图5为鞘内注射846-861PE拮抗肽后在基础和炎症痛大鼠DRG中TRPV1的含量变化情况。(A)在基础状态下，鞘内注射846-861PE拮抗肽大鼠DRG中TRPV1的表达量相对于对照组未发生明显变化。(B)显示图A中TRPV1条带密度的定量分析统计图，数据采用两独立样本t检验，P>0.05，n＝3。(C)显示在左足底给予CFA2 h后，鞘内注射846-861PE拮抗肽大鼠DRG中TRPV1的表达量明显降低。(D)显示图C中TRPV1条带密度的定量分析统计图。数据采用两独立样本t检验，**P<0.01,n＝3。
图6为鞘内注射Nogo-A特异性抗体后在基础和炎症痛大鼠DRG中TRPV1的含量变化情况。(A)在基础状态下，鞘内注射Nogo-A特异性抗体大鼠DRG中TRPV1的表达量相对于IgG对照组未发生明显变化。(B)显示图A中TRPV1条带密度的定量分析统计图，数据采用两独立样本t检验，P>0.05，n＝3。(C)显示在左足底给予CFA 1h后，鞘内注射Nogo-A特异性抗体大鼠DRG中TRPV1的表达量明显降低。(D)显示图C中TRPV1条带密度的定量分析统计图。数据采用两独立样本t检验，*P<0.05,n＝3。
图7为在炎症痛模型中，使用846-861PE拮抗肽阻断Nogo-A信号通路的大鼠DRG神经元中的TRPV1通道对辣椒素的反应程度。(A-D)使用辣椒素刺激后在不同剂量846-861PE拮抗肽阻断Nogo-A信号通路的大鼠DRG神经元中钙离子内流情况。红色：反应程度高；绿色：反应程度低。右侧统计图显示，炎症痛大鼠DRG神经元从基础状态到5μM辣椒素刺激后F340/F380比率变化情况。箭头表示辣椒素处理。与对照肽组相比，**P<0.01。Cap：辣椒素。图中标尺代表100微米。
图8为Nogo-A蛋白新的功能域846-861aa对DRG组织的轴突生长作用研究结果。(A-C)Nogo-A蛋白经典的抑制肽Nogo-P4对DRG组织中轴突生长的显微镜图像及轴突长度的定量分析统计图。(D-F)Nogo-Aaa 415-430及其对照肽对DRG组织中轴突生长影响的显微镜图像及轴突长度的定量分析统计图。(G-I)Nogo-A aa 846-861及其对照肽对DRG组织中轴突生长影响的显微镜图像及轴突长度的定量分析统计图。统计图代表三次独立实验的轴突长度平均值±标准误。数据分析采用两样本独立t检验，***P<0.001。比例尺为50微米。
图9为Nogo-A 846-861特异性抗体可以逆转Nogo-A aa 846-861对DRG组织轴突生长的抑制作用。(A)Nogo-A aa 846-861和对照组IgG对DRG组织中轴突生长影响的显微镜图像。(B)Nogo-Aaa 846-861和其特异性抗体对DRG组织中轴突生长影响的显微镜图像。(C)图A和图B中轴突长度的定量分析统计图。统计图代表三次独立实验的轴突长度平均值±标准误。数据分析采用两样本独立t检验，***P<0.001。
比例尺为50微米。
图10为不同组别中体外培养第三天的皮层神经元激光共聚焦显微镜图像及其形态学分析。(A-B)Nogo-A aa 846-861及其对照肽对体外培养第三天的皮层神经元的轴突生长和胞体周围的突起分支数具有很强的抑制作用。(C-D)Nogo-A 846-861特异性抗体可以拮抗Nogo-A aa 846-861对轴突生长和胞体周围的突起分支数的抑制作用。(E-F)图A-D中皮层神经元的轴突长度和胞体周围的突起分支数的形态学统计分析图。统计图代表三次独立实验的轴突长度平均值±标准误。数据分析先采用单因素方差分析，然后进行两样本t检验，***P<0.001。比例尺为50微米。
图11为三种不同基因型大鼠的PCR鉴定结果。
图12为WT和KO大鼠Nogo-A基因的测序结果。
图13为基因敲除大鼠DRG组织中的Nogo-A蛋白表达水平检测结果。(A)Nogo-A蛋白在三种基因型大鼠DRG组织中的表达情况。(B)为图A中Nogo-A蛋白表达量的统计图。柱状图代表平均值±标准误。数据分析先采用单因素方差分析，然后进行两样本t检验，与野生型组比较，***P<0.001,n＝3。
图14为基因敲除大鼠脊髓和脑组织中的Nogo-A蛋白表达水平检测结果。(A)Nogo-A蛋白在三种基因型大鼠的脊髓和大脑组织中的表达情况。(B-C)为图A中Nogo-A蛋白表达量的统计图。柱状图代表平均值±标准误。数据分析先采用单因素方差分析，然后进行两样本t检验，与野生型组比较，***P<0.001,n＝3。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、功能片段—Nogo-Aaa 846-861的发现
人源性的Nogo-A蛋白具有1192个氨基酸残基(SEQ ID No.1)，使用生物信息学的方法，通过对人源性Nogo-A蛋白结构特征如空间结构、亲水性、灵活性、抗原性以及表面暴露概率等蛋白质二级结构进行了生信分析，发现两个潜在的新功能域，分别为Nogo-Aaa435-451和Nogo-Aaa 872-888。同时通过比对人源性和大鼠源性Nogo-A蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，找到了生信分析中两个潜在的新的功能域的大鼠序列：Nogo-Aaa 415-430和Nogo-Aaa 846-861。功能片段具体序列见表1。
表1
Figure BDA0002461341990000061
实施例2、Nogo-Aaa 846-861片段及其拮抗肽和特异抗体的功能验证
一、实验相关肽的制备
Nogo-Aaa 846-861片段的竞争性拮抗肽846-861PE：吉尔生化(上海)有限公司合成，序列为PTFVSAKDDSPKLAKE，根据纯度用灭菌生理盐水溶解，终浓度为1μg/μl。Scramble1(对照肽1)：吉尔生化(上海)有限公司合成，序列为KDKESLDTPPVAFAKS，根据纯度用灭菌生理盐水溶解，终浓度为1μg/μl。
Nogo-Aaa 415-430竞争性拮抗肽415-430PE：吉尔生化(上海)有限公司合成，序列为KDSEGRNEDASFPSTP，根据纯度用灭菌生理盐水溶解，终浓度为1μg/μl。Scramble2(对照肽2)：吉尔生化(上海)有限公司合成，序列为ADDSRTNEPSEPGFKS，根据纯度用灭菌生理盐水溶解，终浓度为1μg/μl。
二、竞争性拮抗肽(846-861PE)对CFA诱导的炎症热痛觉敏化作用研究
实验动物：成年雄性SD大鼠(Sprague-Dawley Rat，体重150-200g，6-8周龄)。
1、蛛网膜下腔置管手术
(1)使用10％水合氯醛(400mg/kg，i.p.)将SD大鼠麻醉，背部剪毛后碘伏和酒精依次进行消毒；
(2)用手触及大鼠T12、T13脊椎棘突交界(腰膨大部位)和髂棘(腰椎骨对应L4水平)，划横线做标记两线间距离即为进管长度；
(3)在髂棘水平正中线纵向划开皮肤，用不锈钢管作为外套管(长约5cm，外径0.9mm，可容PE-10管通过)，在L4和L5脊椎骨间隙垂直刺入椎管(成功刺入后大鼠的尾巴或后肢会出现轻微抽动)；
(4)使用提前消毒过的PE-10管通过外套管送入蛛网膜下腔(腰髓L3-L4水平)，拔除套管，局部缝合固定PE-10管；
(5)使PE-10管经颈后皮肤穿出，缝合固定PE-10管，然后缝合背部皮肤。术后腹腔注射青霉素1万单位以预防感染。大鼠术后恢复4d后即可鞘内给药进行后续实验。
2、鞘内注射干扰肽
大鼠进行蛛网膜下腔置管手术5天测定基础痛阈(排除异常大鼠)，把大鼠随机分为两组，然后蛛网膜下腔分别注射3μg、10μg、17μg和30μg剂量的竞争性拮抗肽846-861PE及其对照肽Scramble 1，30分钟后左侧足底再注射100μl 25％的完全弗氏佐剂CFA(美国Sigma-Aldrich公司，CFA：F5881)进行炎症痛造模，于注射后1h、2h、6h和24h测定大鼠的热痛觉敏化行为学。
3、热诱发痛缩足潜伏期的测定
使用辐射热刺激缩足潜伏期(Paw withdrawal latency,PWL)反映大鼠的炎症热痛觉敏化程度，具体方法如下：
(1)测试前将大鼠置于玻璃板上，使大鼠适应环境15min；
(2)等大鼠的梳理和探究活动基本消失后，开始行为学测试；
(3)将辐射热灯的焦点对准大鼠脚掌中心部位，开启辐射热灯，计时大鼠出现迅速缩足反应的时间；
(4)调整热痛仪的强度使大鼠基础状态的PWL在10-15s，如果超过30s仍未出现阳性反应，关闭辐射热灯，停止计时以避免烫伤；
(5)每只大鼠重复测量5次，每次测试间隔15min，所测PWL的平均值即为其辐射热缩足潜伏期。
结果如图1所示。结果显示，与Scramble 1组相比，使用10μg和17μg剂量的Nogo-Aaa 846-861竞争性拮抗肽846-861PE阻断Nogo-Aaa 846-861信号通路可以明显增加大鼠同侧的辐射热缩足潜伏期，即缓解大鼠的热痛觉敏化。
三、中和性抗体(Nogo-A 846-861抗体)的制备
1、针对PTFVSAKDDSPKLAKE(846-861)特异性兔多克隆抗体制备
多克隆抗体委托京天成生物技术(北京)有限公司(AbMax Biotechnology Co.,LTD)制备，简略步骤描述如下：
(1)免疫原的制备
合成多肽：PTFVSAKDDSPKLAKE，纯度>75％，4～6mg。
将1.5mg上述多肽偶联到KLH，脱盐后作为免疫原备用。
将0.5mg上述多肽偶联到BSA，脱盐后作为检测抗原备用。
(2)制备针对免疫原的兔多克隆抗体
采用AbMax快速程序28天使用免疫原免疫2只兔子并进行若干次加强免疫，在免疫后的第25天取血，采用ELISA法检测免疫效果(1μg/孔偶联KLH多肽和裸肽分别包被)，如果多抗效价达到标准(ELISA检测，多抗血清滴度针对多肽-KLH≥1：50000)，即可在第28天进行终放血收集血清；如果多抗效价未达到标准，则延长并加强免疫，第38天检测免疫效果，第42天进行终放血收集血清。
采用ProteinG纯化血清，每只兔子纯化1ml血清，得到纯化抗体(Nogo-A 846-861抗体)。
四、基因敲除大鼠制备及验证
Nogo-A基因敲除大鼠最初购自南京大学-南京生物医药研究院，由公司按照CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)-cas9技术构建Nogo-A基因敲除的杂合子大鼠(以SD大鼠为材料构建)，之后在北大医学部实验动物中心将杂合子大鼠进行交配繁殖后获得纯合敲除大鼠。其基因型由PCR鉴定和测序进行鉴定。
1、PCR及测序鉴定
使用酒精常规消毒10天龄大鼠的尾尖，手术剪刀剪取2-3mm长的尾巴组织，加入50μl DNA裂解液和蛋白酶K的混合液体，55℃水浴6-8h，待组织消化彻底后，补水100μl，沸水煮5min，振荡器上震荡1min，10000转离心3min，之后采用引物NOGO-A-TF2和引物NOGO-A-TR2进行PCR扩增，将扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察拍照。PCR剩余产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行目的基因碱基序列的测定。
NOGO-A-TF2：5’-TCAGTAATGATCCAAGCCTGTG-3’；
NOGO-A-TR2：5’-ACTCCTCACAATTACTTCTTC-3’。
电泳结果见图11。野生型大鼠在500bp左右有一条Nogo-A特异性条带，杂合子大鼠分别在500bp、250bp左右各有一条带，基因敲除大鼠由于敲除了266bp的碱基而在250bp左右有一条带。
测序结果见图12。与正常大鼠Nogo-A基因序列比对后发现基因敲除大鼠编码Nogo-A蛋白的Rtn4基因的exon 3第584-849bp位点被敲除，Nogo-A蛋白的氨基酸序列第195位Met(atg)移码突变为Arg(aga)，并且其后续的氨基酸也相应发生了移码突变，以上结果提示Nogo-A基因敲除成功。
2、Western Blot鉴定
取材野生、杂合和纯合三种不同基因型成年雄性大鼠，异氟烷麻醉后断头处死，分别取出其大脑、脊髓以及L4、L5 DRG组织，检测Nogo-A蛋白含量的变化情况。
结果如图13和图14所示。结果显示，与野生型大鼠相比，Nogo-A蛋白在杂合子大鼠DRG组织中表达明显减少，而在纯合子大鼠中则不表达(图13)；并且在三种大鼠的脊髓和大脑组织中也同样证实了这一结果(图14)，综合以上实验结果说明Nogo-A基因敲除大鼠构建成功。
五、Nogo-A 846-861抗体特异性验证
使用Western Blot实验在野生型(WT)和步骤四制备的Nogo-A基因敲除大鼠脊髓两侧L4、L5的DRG组织中验证了Nogo-A 846-861特异性抗体的特异性，结果如图2所示。结果显示，新制备的Nogo-A 846-861多克隆抗体可以特异性识别Nogo-A蛋白的条带(220kDa)(图2A)，这一结果和现有的Nogo-A商业化抗体(Cell Signaling Technology,#13401)Western Blot结果一致(图2B)。提示Nogo-A 846-861特异性抗体制备成功。
六、中和性抗体(Nogo-A 846-861抗体)对CFA诱导的炎症热痛觉敏化作用研究实验动物：成年雄性SD大鼠(Sprague-Dawley Rat，体重150-200g，6-8周龄)。
参照前文的方法进行蛛网膜下腔置管手术。
大鼠进行蛛网膜下腔置管手术5天测定基础痛阈(排除异常大鼠)，把大鼠随机分为两组，然后蛛网膜下腔分别注射0.6μg剂量的Nogo-A 846-861特异性抗体或其对照IgG(Normal rabbit IgG，购自武汉爱博泰克生物科技有限公司)，30分钟后左侧足底再注射100μl 25％的CFA进行炎症痛造模，于注射后1h、2h、6h和24h测定大鼠的热痛觉敏化行为学，测定方法见前文。
结果如图3所示。结果显示，与对照抗体相比，使用0.6μg剂量的Nogo-A 846-861特异性抗体阻断Nogo-Aaa 846-861信号通路可以明显增加大鼠同侧的辐射热缩足潜伏期，即缓解大鼠的热痛觉敏化。
七、竞争性拮抗肽(846-861PE)及Nogo-A 846-861抗体对基础痛阈的作用研究实验动物：成年雄性SD大鼠(Sprague-Dawley Rat，体重150-200g，6-8周龄)。
参照前文的方法进行蛛网膜下腔置管手术。
大鼠进行蛛网膜下腔置管手术5天测定基础痛阈(排除异常大鼠)，按照如下进行分组操作：
拮抗肽846-861PE：蛛网膜下腔注射10μg剂量的竞争性拮抗肽846-861PE或其对照肽Scramble 1(具体信息见前文)，30分钟后左侧足底再注射100μl 25％的完全弗氏佐剂CFA(美国Sigma-Aldrich公司，CFA：F5881)进行炎症痛造模，于注射后立刻测定大鼠的热痛觉敏化行为学。
Nogo-Aaa 846-861特异性抗体：蛛网膜下腔注射0.6μg剂量的Nogo-Aaa 846-861特异性抗体或其对照抗体(具体信息见前文)，30分钟后左侧足底再注射100μl 25％的完全弗氏佐剂CFA(美国Sigma-Aldrich公司，CFA：F5881)进行炎症痛造模，于注射后立刻测定大鼠的热痛觉敏化行为学。
Nogo-A shRNA：蛛网膜下腔注射Lipofectamine 2000和10μg剂量的Nogo-A shRNA质粒或其对照质粒(DNA:Lipofectamine＝1μg:1.5μl)进行在体转染，30分钟后左侧足底再注射100μl 25％的完全弗氏佐剂CFA(美国Sigma-Aldrich公司，CFA：F5881)进行炎症痛造模，于注射后5天测定大鼠的热痛觉敏化行为学。
Nogo-A shRNA质粒：根据PubMed中大鼠(Rattus norvegicus)Rtn4基因编码蛋白的CDS序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_031831.1)，制作了Nogo-AshRNA(靶序列为：5’-GGAAGCATGTGAAAGTGAACT-3’)，该shRNA可以识别Rtn4基因的exon 3第1599-1619bp位点，使该外显子特异性编码的Nogo-A蛋白第534位及其之后的氨基酸产生移码突变，进而特异性敲低Nogo-A蛋白的表达。根据Nogo-A shRNA构建shRNA基因沉默沉默载体(由北京合生生物科技有限公司定制，该公司同时提供对照载体)。
除上述分组外，还对Nogo-A基因敲除大鼠和野生型大鼠进行基础痛阈的测定(排除异常大鼠)，左侧足底注射100μl 25％的完全弗氏佐剂CFA(美国Sigma-Aldrich公司，CFA：F5881)进行炎症痛造模，于注射后0h测定大鼠的热痛觉敏化行为学。
结果如图4所示。结果显示，Nogo-Aaa 846-861的拮抗肽846-861PE、Nogo-A846-861特异性抗体、以及Nogo-A shRNA和Nogo-AKO均不影响大鼠基础痛阈，提示Nogo-Aaa846-861的拮抗肽846-861PE和Nogo-Aaa 846-861特异性抗体镇痛作用的特异性，能够特异性调控支配炎症部位的外周神经中TRPV1的功能来发挥镇痛作用，较直接作用于TRPV1的拮抗剂和激动剂所产生的副作用较少。
功能Nogo-Aaa 415-430片段及其拮抗肽经实验验证发现不具有镇痛作用，不参与疼痛调控。
实施例3、Nogo-Aaa 846-861片段及其拮抗肽和特异抗体对TRPV1的调控作用
一、拮抗肽对TRPV1的调控作用
实验动物：成年雄性SD大鼠(Sprague-Dawley Rat，体重150-200g，6-8周龄)。
参照前文的方法进行蛛网膜下腔置管手术。
大鼠进行蛛网膜下腔置管手术5天测定基础痛阈(排除异常大鼠)，把大鼠随机分为两组，然后蛛网膜下腔分别注射10μg剂量的竞争性拮抗肽846-861PE及其对照肽Scramble 1，使用Western Blot方法检测基础状态下TRPV1蛋白(TRPV-1,sc-12498，SantaCruz Biotechnology)含量的变化。
大鼠进行蛛网膜下腔置管手术5天测定基础痛阈(排除异常大鼠)，把大鼠随机分为两组，然后蛛网膜下腔分别注射10μg剂量的竞争性拮抗肽846-861PE及其对照肽Scramble 1，30分钟后左侧足底再注射100μl 25％的CFA进行炎症痛造模，于注射后2h测定，使用Western Blot方法检测了炎症痛DRG中TRPV1蛋白含量的变化。
结果如图5所示。结果显示，相对于Scramble 1组，846-861PE组炎症痛模型大鼠DRG中TRPV1的表达量明显减少，但是，846-861PE并不减低基础非炎症状态DRG神经节中TRPV1的含量(图5A)。
同时，急性分离CFA2 h时L4-L6 DRG神经元，使用活细胞钙成像的方法检测TRPV1蛋白的功能。
大鼠DRG神经元的急性分离方法的实验步骤如下：
1、实验开始前12h使用多聚赖氨酸(poly-D-lysine，PDL；1mg/ml，Sigma-Aldrich)在confocal小皿中铺皿(50μl/皿)，37℃孵箱过夜。
2、高压所需的器械，12h后吸走PDL(可回收多次使用)，用高压过的三蒸水洗涤三次，置入超净台吹干。
3、麻醉后取出实验大鼠L4-L5 DRG胞体，置于1.5ml胶原酶(3mg/ml)中，37℃恒温摇床，120rmp消化60min。胶原酶(3mg/ml)：称取1.5g胶原酶(Sigma)溶于450ml DMEM培养液中，磁力搅拌器搅拌溶解后定容至500ml，使用0.22μm微孔滤器过滤除菌后-20℃保存。
4、吸出胶原酶，加入1ml胰酶，37℃恒温摇床，90rmp消化10-11min。
5、用500μl FBS终止消化，移入新的15ml离心管中，玻璃滴管吹打10-30次。
6、700rmp离心4min，小心吸去上清，加入适量的接种液(含10％FBS的DMEM)，混匀。
7、将细胞接种于铺有PDL的confocal皿中，置于37℃孵箱中贴壁1.5-2h，进行后续钙成像实验。
活细胞钙成像实验实验步骤如下：
1、首先使用37℃预热的loading buffer轻洗细胞2次。
Loading buffer：用1％BSA/含Ca2+，Mg2+DPBS稀释Fura-2 AM至5μM。
2、加入适量37℃预热的loading buffer室温30min孵育。
3、弃去loading buffer，再次用37℃预热的loading buffer轻洗细胞2次。
4、加入无酚红的Neurobasal培养液(Gibco公司)，室温恢复1h
5、活细胞钙成像工作站显微镜下检测钙离子活动情况。观测时程包括：先观察15张baseline值(每10s拍摄一张)，然后给予辣椒素刺激后观察35张。
结果如图7所示。结果显示，846-861PE组大鼠中阻断Nogo-Aaa 846-861信号通路可以明显降低炎症痛大鼠DRG神经元对辣椒素的反应。
二、特异抗体对TRPV1的调控作用
实验动物：成年雄性SD大鼠(Sprague-Dawley Rat，体重150-200g，6-8周龄)。
参照前文的方法进行蛛网膜下腔置管手术。
大鼠进行蛛网膜下腔置管手术5天测定基础痛阈(排除异常大鼠)，把大鼠随机分为两组，然后蛛网膜下腔分别注射0.6μg剂量的Nogo-A 846-861特异性抗体或其对照IgG(Normal rabbit IgG，购自武汉爱博泰克生物科技有限公司)，30分钟后左侧足底再注射100μl 25％的CFA进行炎症痛造模，于注射后2h通过Western Blot方法检测炎症痛DRG中TRPV1蛋白表达量变化。
结果如图6所示。结果显示，炎症痛DRG中TRPV1蛋白表达量明显减少。
综合以上实验结果，说明Nogo-Aaa 846-861功能域通过调控TRPV1蛋白参与CFA诱导的炎症热痛觉敏化过程。
实施例4、Nogo-Aaa 846-861及其抗体在轴突生长中的作用研究
1、实验开始的前一天晚上在培养皿中铺好多聚赖氨酸(poly-D-lysine，PDL；1mg/ml，Sigma-Aldrich)，37℃孵箱过夜，并高压所需的实验所需的器械(精密手术器械不能高压，需酒精棉球擦拭并照射紫外)。
2、取出ICR小鼠E16.5天的胚胎组织，体视镜下分离出DRG组织(不需要消化成单个细胞)和皮层组织。首先向皮层组织中加入1ml 0.25％的胰酶，在37℃孵箱中消化30min；然后吸出皮层组织转至盛有5ml DMEM完全培养基(加入1％双抗)的离心管中。
3、用1ml的移液枪轻轻将皮层组织块吹散，然后将离心管放在试管架上沉淀未消化的组织块；使用计数板细胞记数后将细胞DMEM完全培养基稀释成适宜浓度后，接种于35mm培养皿中；孵箱培养6h待神经元细胞贴壁后，换成神经元完全培养基(长期培养的原代神经元需要每3天进行一次半换液)。
4、DRG组织在取出后首先使用解剖液冲洗，然后种植于铺有多聚赖氨酸细胞培养皿中(每个35mm培养皿中种植6-8个DRG组织)，培养皿中加入500μl DMEM完全培养基，孵箱培养6h待DRG组织贴壁后，换成神经元完全培养基。
5、皮层神经元的转染步骤同细胞系转染(将荧光质粒和各组待测物共同转入细胞)，但加入转染试剂后的转染时间为20min，之后立即换回原培养液。转染完成后第三天采用激光共聚焦显微镜拍照并进行形态学分析。
本课题该部分实验中使用的荧光质粒为pEYFP-N1(长沙优宝生物科技有限公司，货号：VT1105；使用的功能肽为Nogo-A P4 peptide(EELVQKYSNSALGHVNSTIKELRRL)(浓度为4μmol/L)，Nogo-A aa 415-430peptide及其对照肽2(浓度为2μmol/L)，Nogo-Aaa 846-861peptide及其对照肽1(浓度为2μmol/L)，Nogo-A 846-861特异抗体及其对照IgG(剂量为2μg)。
结果如图8-图10所示。结果显示Nogo-A aa 846-861对DRG组织的轴突生长和皮层神经元的轴突生长具有明显的抑制作用(图8和图10)。并且Nogo-A 846-861特异性抗体可以阻断Nogo-Aaa 846-861信号通路，逆转Nogo-Aaa 846-861对DRG组织和皮层神经元的轴突生长抑制作用(图9和图10)。
以上结果提示，Nogo-Aaa 846-861新功能域也具有抑制神经元轴突生长的作用。
序列表
<110> 北京大学
<120> 一种具有镇痛作用的小分子肽及其特异性抗体
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1192
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
Met Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro
1 5 10 15
Pro Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu
20 25 30
Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp
35 40 45
Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser
50 55 60
Ala Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp
65 70 75 80
Phe Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro
100 105 110
Val Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val
115 120 125
Ser Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr
145 150 155 160
Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro
165 170 175
Lys Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu Phe Ala Leu
180 185 190
Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Arg Ser Ser Ala Glu Asn Met Asp
195 200 205
Leu Lys Glu Gln Pro Gly Asn Thr Ile Ser Ala Gly Gln Glu Asp Phe
210 215 220
Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro Ser Leu Ser Pro
225 230 235 240
Leu Ser Ala Ala Ser Phe Lys Glu His Glu Tyr Leu Gly Asn Leu Ser
245 250 255
Thr Val Leu Pro Thr Glu Gly Thr Leu Gln Glu Asn Val Ser Glu Ala
260 265 270
Ser Lys Glu Val Ser Glu Lys Ala Lys Thr Leu Leu Ile Asp Arg Asp
275 280 285
Leu Thr Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met Gly Ser Ser Phe
290 295 300
Ser Val Ser Pro Lys Ala Glu Ser Ala Val Ile Val Ala Asn Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Ile Ile Val Lys Asn Lys Asp Glu Glu Glu Lys Leu Val Ser
325 330 335
Asn Asn Ile Leu His Asn Gln Gln Glu Leu Pro Thr Ala Leu Thr Lys
340 345 350
Leu Val Lys Glu Asp Glu Val Val Ser Ser Glu Lys Ala Lys Asp Ser
355 360 365
Phe Asn Glu Lys Arg Val Ala Val Glu Ala Pro Met Arg Glu Glu Tyr
370 375 380
Ala Asp Phe Lys Pro Phe Glu Arg Val Trp Glu Val Lys Asp Ser Lys
385 390 395 400
Glu Asp Ser Asp Met Leu Ala Ala Gly Gly Lys Ile Glu Ser Asn Leu
405 410 415
Glu Ser Lys Val Asp Lys Lys Cys Phe Ala Asp Ser Leu Glu Gln Thr
420 425 430
Asn His Glu Lys Asp Ser Glu Ser Ser Asn Asp Asp Thr Ser Phe Pro
435 440 445
Ser Thr Pro Glu Gly Ile Lys Asp Arg Ser Gly Ala Tyr Ile Thr Cys
450 455 460
Ala Pro Phe Asn Pro Ala Ala Thr Glu Ser Ile Ala Thr Asn Ile Phe
465 470 475 480
Pro Leu Leu Gly Asp Pro Thr Ser Glu Asn Lys Thr Asp Glu Lys Lys
485 490 495
Ile Glu Glu Lys Lys Ala Gln Ile Val Thr Glu Lys Asn Thr Ser Thr
500 505 510
Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu Val Ala Ala Gln Asp Ser Glu Thr Asp
515 520 525
Tyr Val Thr Thr Asp Asn Leu Thr Lys Val Thr Glu Glu Val Val Ala
530 535 540
Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu
545 550 555 560
Ser Glu Leu Asn Glu Val Thr Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys
565 570 575
Met Asp Leu Val Gln Thr Ser Glu Val Met Gln Glu Ser Leu Tyr Pro
580 585 590
Ala Ala Gln Leu Cys Pro Ser Phe Glu Glu Ser Glu Ala Thr Pro Ser
595 600 605
Pro Val Leu Pro Asp Ile Val Met Glu Ala Pro Leu Asn Ser Ala Val
610 615 620
Pro Ser Ala Gly Ala Ser Val Ile Gln Pro Ser Ser Ser Pro Leu Glu
625 630 635 640
Ala Ser Ser Val Asn Tyr Glu Ser Ile Lys His Glu Pro Glu Asn Pro
645 650 655
Pro Pro Tyr Glu Glu Ala Met Ser Val Ser Leu Lys Lys Val Ser Gly
660 665 670
Ile Lys Glu Glu Ile Lys Glu Pro Glu Asn Ile Asn Ala Ala Leu Gln
675 680 685
Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu
690 695 700
Thr Lys Leu Ser Ala Glu Pro Ala Pro Asp Phe Ser Asp Tyr Ser Glu
705 710 715 720
Met Ala Lys Val Glu Gln Pro Val Pro Asp His Ser Glu Leu Val Glu
725 730 735
Asp Ser Ser Pro Asp Ser Glu Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser
740 745 750
Ile Pro Asp Val Pro Gln Lys Gln Asp Glu Thr Val Met Leu Val Lys
755 760 765
Glu Ser Leu Thr Glu Thr Ser Phe Glu Ser Met Ile Glu Tyr Glu Asn
770 775 780
Lys Glu Lys Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Gly Lys Pro Tyr Leu
785 790 795 800
Glu Ser Phe Lys Leu Ser Leu Asp Asn Thr Lys Asp Thr Leu Leu Pro
805 810 815
Asp Glu Val Ser Thr Leu Ser Lys Lys Glu Lys Ile Pro Leu Gln Met
820 825 830
Glu Glu Leu Ser Thr Ala Val Tyr Ser Asn Asp Asp Leu Phe Ile Ser
835 840 845
Lys Glu Ala Gln Ile Arg Glu Thr Glu Thr Phe Ser Asp Ser Ser Pro
850 855 860
Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Leu Ile Ser Ser Lys Thr Asp
865 870 875 880
Ser Phe Ser Lys Leu Ala Arg Glu Tyr Thr Asp Leu Glu Val Ser His
885 890 895
Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ala Pro Asp Gly Ala Gly Ser Leu Pro Cys
900 905 910
Thr Glu Leu Pro His Asp Leu Ser Leu Lys Asn Ile Gln Pro Lys Val
915 920 925
Glu Glu Lys Ile Ser Phe Ser Asp Asp Phe Ser Lys Asn Gly Ser Ala
930 935 940
Thr Ser Lys Val Leu Leu Leu Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Ala Thr
945 950 955 960
Gln Ala Glu Ile Glu Ser Ile Val Lys Pro Lys Val Leu Val Lys Glu
965 970 975
Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp Arg Ser Pro
980 985 990
Ser Ala Ile Phe Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val Val Asp Leu
995 1000 1005
Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe Gly Ala Ser
1010 1015 1020
Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val Ser Val Thr
1025 1030 1035 1040
Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser Phe Arg Ile
1045 1050 1055
Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly His Pro
1060 1065 1070
Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val
1075 1080 1085
Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr Ile Lys
1090 1095 1100
Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys
1105 1110 1115 1120
Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala Leu Phe Asn
1125 1130 1135
Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe Ser Val Pro
1140 1145 1150
Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Ala Gln Ile Asp His Tyr Leu Gly Leu
1155 1160 1165
Ala Asn Lys Asn Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln Ala Lys Ile
1170 1175 1180
Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Glu
1185 1190
<210> 2
<211> 1163
<212> PRT
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 2
Met Glu Asp Ile Asp Gln Ser Ser Leu Val Ser Ser Ser Thr Asp Ser
1 5 10 15
Pro Pro Arg Pro Pro Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Thr Glu Pro
20 25 30
Glu Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp
35 40 45
Glu Asp Leu Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly
50 55 60
Leu Ser Ala Ala Ala Val Pro Pro Ala Ala Ala Ala Pro Leu Leu Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Asp Ser Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Pro Ala Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Glu Arg Ser Pro
100 105 110
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Leu Pro Pro Ala Ala Ala Val Leu Pro Ser
115 120 125
Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Ala Gly Ala Ser Pro Leu Ala Glu Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr
145 150 155 160
Pro Ala Ala Pro Lys Arg Arg Gly Ser Gly Ser Val Asp Glu Thr Leu
165 170 175
Phe Ala Leu Pro Ala Ala Ser Glu Pro Val Ile Pro Ser Ser Ala Glu
180 185 190
Lys Ile Met Asp Leu Met Glu Gln Pro Gly Asn Thr Val Ser Ser Gly
195 200 205
Gln Glu Asp Phe Pro Ser Val Leu Leu Glu Thr Ala Ala Ser Leu Pro
210 215 220
Ser Leu Ser Pro Leu Ser Thr Val Ser Phe Lys Glu His Gly Tyr Leu
225 230 235 240
Gly Asn Leu Ser Ala Val Ser Ser Ser Glu Gly Thr Ile Glu Glu Thr
245 250 255
Leu Asn Glu Ala Ser Lys Glu Leu Pro Glu Arg Ala Thr Asn Pro Phe
260 265 270
Val Asn Arg Asp Leu Ala Glu Phe Ser Glu Leu Glu Tyr Ser Glu Met
275 280 285
Gly Ser Ser Phe Lys Gly Ser Pro Lys Gly Glu Ser Ala Ile Leu Val
290 295 300
Glu Asn Thr Lys Glu Glu Val Ile Val Arg Ser Lys Asp Lys Glu Asp
305 310 315 320
Leu Val Cys Ser Ala Ala Leu His Ser Pro Gln Glu Ser Pro Val Gly
325 330 335
Lys Glu Asp Arg Val Val Ser Pro Glu Lys Thr Met Asp Ile Phe Asn
340 345 350
Glu Met Gln Met Ser Val Val Ala Pro Val Arg Glu Glu Tyr Ala Asp
355 360 365
Phe Lys Pro Phe Glu Gln Ala Trp Glu Val Lys Asp Thr Tyr Glu Gly
370 375 380
Ser Arg Asp Val Leu Ala Ala Arg Ala Asn Val Glu Ser Lys Val Asp
385 390 395 400
Arg Lys Cys Leu Glu Asp Ser Leu Glu Gln Lys Ser Leu Gly Lys Asp
405 410 415
Ser Glu Gly Arg Asn Glu Asp Ala Ser Phe Pro Ser Thr Pro Glu Pro
420 425 430
Val Lys Asp Ser Ser Arg Ala Tyr Ile Thr Cys Ala Ser Phe Thr Ser
435 440 445
Ala Thr Glu Ser Thr Thr Ala Asn Thr Phe Pro Leu Leu Glu Asp His
450 455 460
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465 470 475 480
Gln Ile Ile Thr Glu Lys Thr Ser Pro Lys Thr Ser Asn Pro Phe Leu
485 490 495
Val Ala Val Gln Asp Ser Glu Ala Asp Tyr Val Thr Thr Asp Thr Leu
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Ser Lys Val Thr Glu Ala Ala Val Ser Asn Met Pro Glu Gly Leu Thr
515 520 525
Pro Asp Leu Val Gln Glu Ala Cys Glu Ser Glu Leu Asn Glu Ala Thr
530 535 540
Gly Thr Lys Ile Ala Tyr Glu Thr Lys Val Asp Leu Val Gln Thr Ser
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Glu Ala Ile Gln Glu Ser Leu Tyr Pro Thr Ala Gln Leu Cys Pro Ser
565 570 575
Phe Glu Glu Ala Glu Ala Thr Pro Ser Pro Val Leu Pro Asp Ile Val
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595 600 605
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645 650 655
Pro Glu Ser Phe Asn Ala Ala Val Gln Glu Thr Glu Ala Pro Tyr Ile
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Ser Ile Ala Cys Asp Leu Ile Lys Glu Thr Lys Leu Ser Thr Glu Pro
675 680 685
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690 695 700
Val Pro Glu His Ala Glu Leu Val Glu Asp Ser Ser Pro Glu Ser Glu
705 710 715 720
Pro Val Asp Leu Phe Ser Asp Asp Ser Ile Pro Glu Val Pro Gln Thr
725 730 735
Gln Glu Glu Ala Val Met Leu Met Lys Glu Ser Leu Thr Glu Val Ser
740 745 750
Glu Thr Val Ala Gln His Lys Glu Glu Arg Leu Ser Ala Ser Pro Gln
755 760 765
Glu Leu Gly Lys Pro Tyr Leu Glu Ser Phe Gln Pro Asn Leu His Ser
770 775 780
Thr Lys Asp Ala Ala Ser Asn Asp Ile Pro Thr Leu Thr Lys Lys Glu
785 790 795 800
Lys Ile Ser Leu Gln Met Glu Glu Phe Asn Thr Ala Ile Tyr Ser Asn
805 810 815
Asp Asp Leu Leu Ser Ser Lys Glu Asp Lys Ile Lys Glu Ser Glu Thr
820 825 830
Phe Ser Asp Ser Ser Pro Ile Glu Ile Ile Asp Glu Phe Pro Thr Phe
835 840 845
Val Ser Ala Lys Asp Asp Ser Pro Lys Leu Ala Lys Glu Tyr Thr Asp
850 855 860
Leu Glu Val Ser Asp Lys Ser Glu Ile Ala Asn Ile Gln Ser Gly Ala
865 870 875 880
Asp Ser Leu Pro Cys Leu Glu Leu Pro Cys Asp Leu Ser Phe Lys Asn
885 890 895
Ile Tyr Pro Lys Asp Glu Val His Val Ser Asp Glu Phe Ser Glu Asn
900 905 910
Arg Ser Ser Val Ser Lys Ala Ser Ile Ser Pro Ser Asn Val Ser Ala
915 920 925
Leu Glu Pro Gln Thr Glu Met Gly Ser Ile Val Lys Ser Lys Ser Leu
930 935 940
Thr Lys Glu Ala Glu Lys Lys Leu Pro Ser Asp Thr Glu Lys Glu Asp
945 950 955 960
Arg Ser Leu Ser Ala Val Leu Ser Ala Glu Leu Ser Lys Thr Ser Val
965 970 975
Val Asp Leu Leu Tyr Trp Arg Asp Ile Lys Lys Thr Gly Val Val Phe
980 985 990
Gly Ala Ser Leu Phe Leu Leu Leu Ser Leu Thr Val Phe Ser Ile Val
995 1000 1005
Ser Val Thr Ala Tyr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Ser Val Thr Ile Ser
1010 1015 1020
Phe Arg Ile Tyr Lys Gly Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu
1025 1030 1035 1040
Gly His Pro Phe Arg Ala Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu
1045 1050 1055
Glu Leu Val Gln Lys Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Ser
1060 1065 1070
Thr Ile Lys Glu Leu Arg Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp
1075 1080 1085
Ser Leu Lys Phe Ala Val Leu Met Trp Val Phe Thr Tyr Val Gly Ala
1090 1095 1100
Leu Phe Asn Gly Leu Thr Leu Leu Ile Leu Ala Leu Ile Ser Leu Phe
1105 1110 1115 1120
Ser Ile Pro Val Ile Tyr Glu Arg His Gln Val Gln Ile Asp His Tyr
1125 1130 1135
Leu Gly Leu Ala Asn Lys Ser Val Lys Asp Ala Met Ala Lys Ile Gln
1140 1145 1150
Ala Lys Ile Pro Gly Leu Lys Arg Lys Ala Asp
1155 1160

Claims (10)

1.功能片段，为SEQ ID No.1自N端第872-888位所示的氨基酸片段或SEQ ID No.2自N端第846-861位所示的氨基酸片段。
2.权利要求1所述功能片段在如下(a1)-(a12)任一种中的应用；
(a1)调控炎症性疼痛的发生；
(a2)促进炎症性疼痛的发生；
(a3)促进炎症性热痛觉敏化；
(a4)提高支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性；
(a5)调控神经元轴突生长；
(a6)抑制神经元轴突生长；
(a7)制备用于调控炎症性疼痛的发生的产品；
(a8)制备用于促进炎症性疼痛的发生的产品；
(a9)制备用于促进炎症性热痛觉敏化的产品；
(a10)制备用于提高支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性的产品；
(a11)制备用于调控神经元轴突生长的产品；
(a12)制备用于抑制神经元轴突生长的产品。
3.权利要求1所述功能片段的竞争性拮抗肽。
4.如权利要求3所述的竞争性拮抗肽，其特征在于：所述竞争性拮抗肽为SEQ ID No.1自N端第872-888位所示的氨基酸片段或SEQ ID No.2自N端第846-861所示的氨基酸片段。
5.权利要求1所述功能片段的抗体。
6.如权利要求4所述的抗体，其特征在于：所述抗体为将所述功能片段作为免疫原，免疫动物得到抗血清；将所述抗血清纯化得到的多克隆抗体。
7.权利要求3至6任一所述的拮抗肽或抗体在如下(b1)-(b12)任一种中的应用；
(b1)调控炎症性疼痛的发生；
(b2)抑制炎症性疼痛的发生；
(b3)缓解炎症性热痛觉敏化；
(b4)降低支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性；
(b5)调控神经元轴突生长；
(b6)恢复由于权利要求1所述的功能片段导致的神经元轴突生长抑制；
(b7)制备用于调控炎症性疼痛的发生的产品；
(b8)制备用于抑制炎症性疼痛的发生的产品；
(b9)制备用于缓解炎症性热痛觉敏化的产品；
(b10)制备用于降低支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性的产品；
(b11)制备用于调控神经元轴突生长的产品；
(b12)制备用于恢复由于权利要求1所述的功能片段导致的神经元轴突生长抑制的产品。
8.产品，其活性成分为权利要求3至6任一所述的拮抗肽或抗体；所述产品的用途为(b1)-(b6)中的任一种：
(b1)调控炎症性疼痛的发生；
(b2)抑制炎症性疼痛的发生；
(b3)缓解炎症性热痛觉敏化；
(b4)降低支配炎症部位的外周神经中TRPV1蛋白的表达量和/或活性；
(b5)调控神经元轴突生长；
(b6)恢复由于权利要求1所述的功能片段导致的神经元轴突生长抑制。
9.镇痛药，其活性成分为权利要求3至6任一所述的拮抗肽或抗体。
10.如权利要求9所述的镇痛药，其特征在于：所述镇痛药不影响基础痛阈。
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