CN113519703B - 动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂，三氧化二铝10‑20％、酿酒酵母细胞壁12‑15％、苯甲酸钠4‑12％、海藻粉5‑10％、益生菌1‑10％、黄曲霉毒素B1分解酶1‑5％、余量为蒙脱石。制法包括海藻粉超微粉碎；蒙脱石纳米技术加工和化学改性、提纯复配；益生菌、黄曲霉毒素B1分解酶包膜、喷雾干燥；过筛混合。霉菌毒素轻微污染，添加0.5～1千克/吨饲料；严重污染，添加1～2千克/吨饲料。配方组成科学合理，无药残毒副作用，具有强力防霉脱毒功能，吸附和清除各种霉菌毒素、不吸收和破坏饲料养分，提高饲料利用率；改善免疫系统，保肝护肾、修复肠道粘膜，降低霉菌毒素引起的毒害作用，提高动物繁殖、生长性能。
Description
技术领域
本发明涉及动物养殖的技术领域，特别是涉及一种动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂，以及制备方法和应用。
背景技术
霉菌毒素是常见而危险的真菌次级代谢产物，可在食物链的每个环节污染动物饲料。其污染开始于田间，随后在收获、干燥和储存过程中由霉菌自然分泌产生并逐步蓄积。近年来，全球饲料原料霉菌毒素污染的频率和畜禽霉菌毒素中毒的严重性逐年增加。霉菌毒素通常使动物的生产性能下降，抑制免疫机能，导致动物患病，出现坏死性、出血性皮炎，采食量下降，生长抑制，日增重差，口腔溃疡和脚部皮肤色素脱失，进而通过动物的肉、奶和内脏进入人类的食品链中，危害人类的健康。目前在饲料中发现的霉菌毒素达200多种，常见霉菌毒素有黄曲霉毒素(AF)、赭曲霉毒素A(OTA)、单端孢菌毒素、玉米赤霉烯酮(ZON)、烟曲霉毒素(FUM)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和串珠镰刀菌素，调查资料表明：我国霉变饲料整体情况十分严重，常见的霉变饲料中大都含有2种或超过2种霉菌毒素，这些霉菌毒素的相互作用对动物的生长性能和健康造成严重危害，因而对饲料中的霉菌进行抑制和对动物进行保肝护肾是解决饲料霉菌污染、保护动物健康的关键。
目前市场上采用的脱霉剂大部分是简单地添加矿物粘附剂，而粘附和吸附的作用是不同的，吸附与黏附有本质的区别，吸附一般解释为“高强度的结合”，而黏附为靠巨大的表面积粘着部分毒素，而不是结合，这些毒素在肠道蠕动过程中会游离出来，被吸收进入血液，从而产生毒害作用；或者直接添加益生菌、酶，但是由于益生菌和酶储存条件非常严格，往往直接添加后在运输过程中就会导致菌酶失活。
发明内容
基于此，本发明提供了一种动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂以及制备方法，本发明配方组成科学合理，在现有技术基础上通过改进生产工艺，使得产品更易储存和运输，使用方便，无药物残留以及毒副作用，具有强力防霉脱毒功能，高效吸附和清除各种霉菌毒素，且不吸收和破坏饲料养分，提高饲料利用率；改善免疫系统，保肝护肾、修复肠道粘膜，进一步降低霉菌毒素引起的毒害作用，提高动物的繁殖、生长性能。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂，其特征在于由以下按照质量百分比的原料组成：三氧化二铝10-20％、酿酒酵母细胞壁12-15％、苯甲酸钠4-12％、海藻粉5-10％、益生菌1-10％、黄曲霉毒素B1分解酶1-5％、余量为蒙脱石。
所述三氧化二铝含量≥90％wt、比表面积≥280m2/g的饲料添加剂。
所述益生菌选自凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌。
所述益生菌选自凝结芽孢杆菌50亿CFU/g和植物乳杆菌50亿CFU/g。
所述黄曲霉毒素B1分解酶在pH6.0和30℃条件下酶活力：1000,000U/g。
所述益生菌、黄曲霉毒素B1分解酶经过包膜、喷雾干燥、过筛等步骤。
所述海藻粉蛋白含量≥17.0％wt、海藻多糖≥30.0％wt。
所述海藻粉为超微粉碎后粒度为38-74微米的海藻超微粉。
所述的蒙脱石采用“超细提纯技术”和“纳米杂化插层技术”加工而成，由二层共顶联接的硅氧四面体片夹一层共棱联接的铝(镁)氧(氢氧)八面体片，构成2：1型含结晶水的T-0-T周期性层状排列结构硅酸盐矿物。其结构支柱的八面体中Al3+被Mg、Fe2+、Fe3+等的同晶置换，造成八面体畸变，进而迫使四面体片作出旋转、伸长、歪扭等形式来予以调正，直至出现断键，使多面体核心阳离子裸露，并在层间产生强弱不同的永久性负电荷，其吸附力≥40g/100g，吸蓝量≥41g/100g，吸氨量≥100mmol/100g。
一种动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂的制备方法，由以下按照质量百分比的原料组成：三氧化二铝10-20％、酿酒酵母细胞壁12-15％、苯甲酸钠4-12％、海藻粉5-10％、益生菌1-10％、黄曲霉毒素B1分解酶1-5％、余量为蒙脱石，制备步骤如下：
步骤1，称取处方量的海藻粉，投入超微粉碎机中，通过控制分级叶轮转速为2500-4500r/min、进风量设置为4-5档、温度设置为40-60℃，超微粉碎后，通过旋风分离器筛选、经关风机落入200目-400目气流筛，由气流筛成品口落入收集料桶，收集到超微粉碎后粒度为38-74微米的海藻粉，组成体系1；
步骤2，称取处方量的益生菌、黄曲霉毒素B1分解酶，加入5-10wt％脱脂奶粉、1-5wt％海藻糖及0.2-0.5wt％海藻酸钠作为保护剂，溶解、混合均匀，使用离心式喷雾干燥设备，进风温度90-110℃，出风温度70-100℃，包被、喷雾干燥完成后，得体系2；
步骤3，将处方量三氧化二铝、酿酒酵母细胞壁、苯甲酸钠分别粉碎后过40目筛，得体系3；
步骤4，将体系1、2、3和蒙脱石一起投入混合机内，混合均匀，即得所述动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂。
当霉菌毒素轻微污染时，每吨饲料添加0.5～1千克本发明的动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂；当霉菌毒素严重污染时，每吨饲料添加1～2千克本发明的所述动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂。
采用上述方案后，本发明的有益效果是：
(1)本品含有的三氧化二铝，是一种多孔性、高分散度的固体物质，有很大的表面积，可以将霉菌毒素吸附在多孔的结构中，与蒙脱石(吸附力≥40g/100g)共同作用，高效吸附多数的霉菌毒素。
(2)本品含有的酵母细胞壁中的甘露寡糖具有和上皮细胞受体类似的结构，能够竞争性地与有害菌结合，由于有害菌不具有β-糖苷酶，不能利用甘露聚糖作为能量来源，而有益菌具有这种酶，因此酵母细胞壁具有调节肠道菌群平衡，维护肠道完整性的作用。甘露寡糖和β-葡聚糖都具有提高肠道免疫力的作用，能够有效保护肠道健康。并且存在于酵母细胞外壁的功能性碳水化合物可结合多种霉菌毒素，通过氢键和范德华力叠合作用与多种毒素形成多糖-毒素复合物，防止毒素被肠道吸收。
(3)本品含有的苯甲酸钠，亲油性较大，易穿透细胞膜进入细胞体内，干扰细胞膜的通透性，抑制细胞膜对氨基酸的吸收，进入细胞体内电离酸化细胞内的碱储，并抑制细胞的呼吸酶系的活性，阻止乙酰辅酶A缩合反应，从而在使用过程中会使霉菌和部分细菌的生长繁殖受到一定的抑制作用。
(4)本品含有的凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在有氧及无氧的环境下都可生长，能适应低氧的肠道环境，对酸和胆汁有较高的耐受性，能够进行乳酸发酵，产生的L-乳酸能降低肠道pH值，抑制有害菌，并能促进双歧杆菌等有益菌的生长和繁殖。凝结芽孢杆菌能够形成芽孢，与其他不产乳酸的芽孢杆菌相比有利于恢复胃肠道的微生态平衡。含有的植物乳杆菌是一种厌氧菌(兼性好氧)，在繁殖过程中能产出特有的乳酸杆菌素，乳酸杆菌素是一种生物型的防腐剂，与其他乳酸菌的区别在于植物乳杆菌的活菌数比较高，能大量的产酸，其产出的酸性物质能降解重金属。同时所述益生菌采用包被技术，可以更好地解决产品储存和运输过程当中益生菌的保存，使得益生菌不那么快失活、影响产品效果，保证了到达肠道后有效益生菌的数量、对抗腐生菌从，平衡消化道寄生菌群，降低霉菌毒素对肠道损害；提高动物非特异性免疫功能，增强动物抗病力。屎肠球菌是条件致病菌，使用于饲料添加剂中存在安全隐患；双歧杆菌是严格厌氧菌，如果肠道中有一点氧气存在，那么会影响双歧杆菌在肠道的定植，从而影响其发挥作用；另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，在厌氧条件下是无法生长的；地衣芽孢杆菌是好氧菌，虽能在厌氧条件下生长，但是生长速度极其缓慢，因为本发明选择凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌配伍，在凝结芽孢杆菌消耗掉氧气之后使得机体内部处于无氧环境，促进植物乳杆菌这个兼性厌氧菌生长等，又可以和植物乳杆菌协同配合一起产生L-乳酸、乙酸等。
(5)天然海藻粉中蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素和矿物质等大量营养物质可提高动物免疫系统，抵抗疾病。同时起到保肝护肾、修复肠道粘膜的作用，加强排毒功能，降低霉菌毒素引起的毒害作用。本发明采用超微粉碎的工艺，使得海藻粉的粒度控制在38-74微米，特定的粒度大小可以提高靶向性，使得海藻粉在肝肾中更易吸收，提高饲料利用和转化率。
(6)本品含有的黄曲霉毒素B1分解酶在pH6.0和30℃条件下酶活力：1000,000U/g，进入动物肠道后可以高效降解饲料中含有的霉菌毒素，减少对动物机体的伤害。
(7)本品采用的制备工艺对益生菌和黄曲霉毒素B1分解酶进行了包膜、喷雾干燥处理，有利于对热不稳定的益生菌和黄曲霉毒素B1分解酶有良好的保护作用，更有利于储存，也有利于益生菌和黄曲霉毒素B1分解酶能够顺利到达肠道发挥作用。
综上，本发明的一种动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂具有高效、强力防霉脱毒功能，高效吸附和清除各种霉菌毒素，且不吸收和破坏饲料养分，提高饲料利用率；改善免疫系统，保肝护肾、修复肠道粘膜，进一步降低霉菌毒素引起的毒害作用；改善饲料适口性，提高动物的繁殖、生产性能，具备高强度、可选择性、光谱吸附能力，能够更好地吸附霉菌毒素。
附图说明
图1是实施例与对比例厌氧发酵培养12h、24h后测定pH测试结果图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
对比例1-26、实施例1-8组分配方如表1-1～表1-7：
表1-1
表1-2
表1-3
表1-4
表1-5
表1-6
表1-7
制备工艺：
对比例1-5采用(a)在70-85℃在烘干蒙脱石原料至含水率为3-5％后，粉碎至400-500目，得原料粉；(b)对所得到的原料粉进行前处理，步骤如下：将浓度为50-80％的钠盐溶液加入到原料粉中，在温度为70-90℃的条件下处理3-5小时，过滤，得到处理液；(c)处理液中再加入粒径为0.2mm的沸石，在搅拌设备中，搅拌处理1小时，搅拌速度为200-300转/分钟，然后浓缩、喷雾干燥后得到处理粉；(d)向处理粉中加入水和原料粉重量的0.08％的分散剂，与原料粉搅拌混匀，制得固含量为20％的浆液；(e)所述浆液过300-500目筛，得第一滤液；(f)第一滤液送入超细设备中进行超细剥片，剥片后再经过分级设备离心机中去除固体颗粒，得到第二滤液；(g)对第二滤液用高温高压条件下超声灭菌，在对其进行酸处理后，浓缩、喷雾干燥，得到蒙脱石脱霉剂。
对比例14采用如下步骤：步骤1，称取处方量三氧化二铝、酿酒酵母细胞壁、苯甲酸钠分别粉碎后过40目筛，得体系1；
步骤2，称取处方量的海藻粉，处方量的益生菌(凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌)、蒙脱石一起投入混合机内，混合均匀，即得。
对比例6-13、15-25采用如下步骤：步骤1，称取处方量三氧化二铝、酿酒酵母细胞壁、苯甲酸钠分别粉碎后过40目筛，得体系1；步骤2，称取处方量的益生菌(凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、双歧杆菌)加入5-10wt％脱脂奶粉、1-5wt％海藻糖及0.2-0.5wt％海藻酸钠作为保护剂，溶解、混合均匀，使用离心式喷雾干燥设备，进风温度110-150℃，出风温度80-100℃，包被、喷雾干燥完成后，得体系2；步骤3，将体系1、2和处方量海藻粉蒙脱石一起投入混合机内，混合均匀，即得所述动物用高效处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂。
对比例26采用如下步骤：步骤1，称取处方量的海藻粉，投入超微粉碎机中，通过控制分级叶轮转速为2500-4500r/min、进风量设置为4-5档、温度设置为40-60℃，超微粉碎后，通过旋风分离器筛选、经关风机落入200目-400目气流筛，由气流筛成品口落入收集料桶，收集到超微粉碎后粒度为38-74微米的海藻粉，组成体系1；
步骤2，称取处方量的益生菌，加入5-10wt％脱脂奶粉、1-5wt％海藻糖及0.2-0.5wt％海藻酸钠作为保护剂，溶解、混合均匀，使用离心式喷雾干燥设备，进风温度90-110℃，出风温度70-100℃，包被、喷雾干燥完成后，得体系2；
步骤3，将处方量三氧化二铝、酿酒酵母细胞壁、苯甲酸钠分别粉碎后过40目筛，得体系3；
步骤4，将体系1、2、3和蒙脱石一起投入混合机内，混合均匀，即得所述动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂。
本发明实施例1-8的一种动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂采用如下步骤：步骤1，称取处方量的海藻粉，投入超微粉碎机中，通过控制分级叶轮转速为2500-4500r/min、进风量设置为4-5档、温度设置为40-60℃，超微粉碎后，通过旋风分离器筛选、经关风机落入200目-400目气流筛，由气流筛成品口落入收集料桶，收集到超微粉碎后粒度为38-74微米的海藻粉，组成体系1；
步骤2，称取处方量的益生菌、黄曲霉毒素B1分解酶，加入5-10wt％脱脂奶粉、1-5wt％海藻糖及0.2-0.5wt％海藻酸钠作为保护剂，溶解、混合均匀，使用离心式喷雾干燥设备，进风温度90-110℃，出风温度70-100℃，包被、喷雾干燥完成后，得体系2；
步骤3，将处方量三氧化二铝、酿酒酵母细胞壁、苯甲酸钠分别粉碎后过40目筛，得体系3；
步骤4，将体系1、2、3和蒙脱石一起投入混合机内，混合均匀，即得所述动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂。
试验一：本发明所涉及动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂在常温条件下的活菌数变化情况
试验动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂：采用对比例6-25、实施例1-7方法配制。
试验条件：常温25℃，湿度40％条件下纯铝袋密封储存。
1、测试植物乳杆菌、屎肠球菌活菌数
按GB/T 34224-2017生物产品中功能性微生物检测执行。
2、测试地芽孢芽孢杆菌活菌数
按NY/T 1461-2007标准5.5执行。
3、测试枯草芽孢杆菌活菌数
按GB/T 26428-2010执行。
4、双歧杆菌
按GB 4789.34-2016食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌检验执行。
5、测试凝结芽孢杆菌活菌数参照标准：GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验。
试验材料和设备：
(1)生理盐水121℃灭菌15min～20min。
(2)MRS培养基：将蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、K2HPO4·7H2O 2.0g、醋酸钠·3H20 5.0g、柠檬酸三铵2.0g、MgSO4·7H20 0.2g、MnSO4·7H20 0.05g、琼脂粉15.0g加入到1000mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.2±0.2，分装后121℃灭菌15min～20min。
(3)冰箱：2℃～5℃
(4)恒温培养箱：36℃±1℃
(5)均质器及无菌均质袋或旋涡混合器
(6)水浴锅
(7)移液枪：100μL与1000μL
(8)天平：感量0.01g
(9)无菌锥形瓶：500mL、250mL
(10)微生物实验室常规灭菌及培养设备
操作步骤：
(1)样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序。
(2)以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL无菌生理盐水的锥形瓶中，旋涡震荡2～5min，制成1：10样品匀液。
(3)用1mL无菌移液枪吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL无菌生理盐水的试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液)，旋涡震荡使混合均匀，制成1：100的样品匀液。
(4)另取1mL无菌枪头按上述操作顺序依次做10倍递增样品匀液，每递增稀释一次，即换一次1mL灭菌枪头。
(5)选择合适的稀释度，放置80℃±1℃水浴恒温10min，时间到后快速冷却至室温，每个稀释度吸取0.1mL样品匀液分别置于2个MRS琼脂平板，使用L型涂布棒进行表面涂布，快速涂匀。36℃±1℃，倒置厌氧培养48h士2h后计数平板上的所有菌落数。
(6)菌落计数
注：可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。
选取菌落数在30CFU～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生产的平板作为该稀释度的菌落数：若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
(7)结果的表述
若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)中菌落总数结果；若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算：
式中：
N—样品中菌落数；
∑C—平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；
n1—第一稀释度(低稀释倍数)平板个数；
n2—第二稀释度(高稀释倍数)平板个数；
d—稀释因子(第一稀释度)。
若所有稀释度的平板上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
菌落数的报告
菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约，取前2位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。
称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。
结果与报告
根据菌落数计数结果出具报告，报告单位以CFU/g(mL)表示。
测试各试验动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂在常温储存条件下第0个月、1个月、6个月、12个月的活菌数情况结果如表2-1～表2-3。
表2-1(单位：×106CFU/g)
表2-2(单位：×106CFU/g)
表2-3(单位：×106CFU/g)
由表2-1至表2-3可以看出包被后的益生菌均能达到一个比较好的保存效果，因而采用益生菌包被技术是有益的。
试验二：本发明所涉及动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂产酸能力的比较
采用对比例10、11、14-25和实施例1-8配制的饲料添加剂进行测试。
试验设计及方法：
以MRS培养基作为检测培养基，按1％接种量，于37℃恒温摇床震荡，厌氧发酵培养12h、24h后分别测定pH，测试结果如表3和附图1所示。
表3
初始培养基pH为7.1
| 培养12h后pH | 培养24h后pH | |
| 对照组 | 7.1 | 7.0 |
| 对比例10 | 4.6 | 4.5 |
| 对比例11 | 4.5 | 4.4 |
| 对比例14 | 5.0 | 4.9 |
| 对比例15 | 6.9 | 6.9 |
| 对比例16 | 4.8 | 4.7 |
| 对比例17 | 4.5 | 4.4 |
| 对比例18 | 4.6 | 4.5 |
| 对比例19 | 4.9 | 4.6 |
| 对比例20 | 4.6 | 4.3 |
| 对比例21 | 4.7 | 4.6 |
| 对比例22 | 4.7 | 4.6 |
| 对比例23 | 4.6 | 4.5 |
| 对比例24 | 4.7 | 4.5 |
| 对比例25 | 4.3 | 3.9 |
| 实施例1 | 4.7 | 4.5 |
| 实施例2 | 4.6 | 4.2 |
| 实施例3 | 4.5 | 4.0 |
| 实施例4 | 4.3 | 3.9 |
| 实施例5 | 4.5 | 4.0 |
| 实施例6 | 4.3 | 3.9 |
| 实施例7 | 4.2 | 3.8 |
| 实施例8 | 4.2 | 3.7 |
产酸能力高的话可以提高消化酶活性，促进有益菌生长，为胃产胃酸降低消化负担，提高动物机体的消化能力，由表3和附图1可以看出对比例15产酸能力最弱，几乎没有对培养基pH造成影响，说明枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌不产酸，或者说产酸能力很弱，与其他产酸益生菌配伍后也没有发挥其他有益作用；而凝结芽孢杆菌和植物乳杆菌配伍的有包被的实施例1-8产酸效果均比未包被的对比例15效果要好。
试验三：本发明所涉及动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂在模拟猪胃液中菌存活率
采用实施例1-8配制的饲料添加剂进行测试。
猪胃液配制方法：0.2gNaCl与0.35g猪胃蛋白酶溶解于适量蒸馏水中，用1mol/L盐酸调节pH值为2.0、3.0、4.0，用100mL容量瓶定容至刻度。将所述饲料添加剂活化后的培养液离心，取菌沉淀稀释至活菌数约100CFU/mL，分别按1‰接种量加入不同pH值的人工胃酸液体中，37℃水浴恒温处理时间为0.5、1、2、4、6h后，稀释涂板，37℃下培养24h后，计算菌存活率。测试结果如表4。
表4(单位：％)
由表4可知，在pH值2.0条件下，实施例的活菌数经过6h后存活率为15-28％；在pH值3.0的条件下，经过0.5h后存活率超过99％，1h后仍有很高的存活率，为98.3-98.8％，6h后存活率还有40.8％以上；pH值4.0条件下，2h前存活率可达到98.0％以上，经过4h存活率还可达到95％以上，6h后存活率达到64.6％-68.4％。这说明实施例1-8在没有营养的条件下能在胃蛋白酶及酸性pH值2.5共同作用情况下大部分菌体还能有良好的存活率，能顺利通过胃消化进入肠道发挥作用。
试验四：本发明所涉及动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂对几种常见霉菌毒素的吸附和解吸效果的测试
采用对比例1-5、对比例26-29和实施例1、3、7配制的饲料添加剂进行测试。
试验用霉菌毒素为：黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、呕吐毒素(DON)、烟曲霉毒素B1(FumB1)。
试验仪器：恒温震荡水浴锅、电子天平、台式离心机、全自动酶标仪。
试验试剂：AFB1、ZEN、DON、FumB1标准品(美国Sigma公司)；霉菌毒素ELISA试剂盒(意大利Tecna公司)；甲醇(色谱纯)，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸均为分析纯。
试验设计及方法：
(1)霉菌毒素缓冲液的配制：
柠檬酸缓冲液：80.03％的0.1mol/L柠檬酸溶液与19.7％的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液混合，调节至pH为3.0(模拟胃酸环境pH)。磷酸氢钠缓冲液：65.3％的0.067mol/L磷酸二氢钠溶液和34.7％的0.067mol/L磷酸氢二钠溶液混合，调节至pH为6.5(模拟肠道环境pH)。以柠檬酸缓冲液和磷酸氢钠缓冲液为基础，配制这两种pH值的霉菌毒素缓冲液。黄曲霉毒素B1缓冲液、玉米赤霉烯酮缓冲液、呕吐毒素缓冲液以及烟曲霉毒素缓冲液浓度分别为50μg/L，500g/L，1000μg/L，2000μg/L。
(2)吸附试验：取10mL上述霉菌毒素缓冲液，加入0.2％(即0.0200g)的霉菌毒素吸附剂，漩涡震荡15s，37℃，180rpm的恒温震荡水浴锅中处理60min，反应结束后，在5000rpm离心机中离心10min，收集上清液，用ELISA试剂盒测定上清液中霉菌毒素的含量，计算吸附率Y(％)。
式中：C0-反应前霉菌毒素的浓度(μg/L)；C-反应后霉菌毒素的浓度(μg/L)。
(3)解吸试验：吸附试验完成后，倒出离心管中的上清液，在剩余物中加入10mL70％甲醇水溶液对霉菌毒素进行提取，在37℃、180rpm恒温震荡水浴锅中处理30min，处理结束后，在5000rpm下离心10min，收集上清液，用ELISA试剂盒对上清液中毒素进行含量检测，计算各霉菌毒素解吸率W(％)。
式中：m0-解吸前复合物中毒素的含量(ng)；m-解吸上清液中毒素的含量(ng)。
数据分析：
pH＝3.0和pH＝6.5条件下霉菌毒素吸附剂的吸附效果如表5-1和表5-2所示。
表5-1pH＝3.0下各实施例对不同霉菌毒素吸附率和解吸率情况(单位：％)
表5-2pH＝6.5下各实施例对不同霉菌毒素吸附率和解吸率情况(单位：％)
由表5-1、表5-2可以看出实施例1、3、7均比对比例对各霉菌毒素的吸附率更高，解吸率更低，对霉菌毒素有良好的吸附效果，同时由对比例26和实施例对比来看，增加了黄曲霉毒素B1分解酶的实施例吸附霉菌毒素效果更好。
试验五：本发明所涉及动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂在猪场的应用
试验动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂：采用实施例1、3、7方法配制。
试验动物：某猪场250头健康状况、体重基本相同的育肥猪。
试验设计及方法：
用随机分组法分成4组试验组和对照组，每组50头。对照组按照原饲养条件饲养，试验组按照如下方法使用：
霉菌毒素轻微污染时，每吨饲料添加0.5～1千克本发明的饲料添加剂；
霉菌毒素严重污染时，每吨饲料添加1～2千克本发明的饲料添加剂。
其余饲养条件均同对照组。
试验期为90天。
计算方法：采食量(g/头·天)＝试验期采食饲料总量(g)/保育猪数量(头)/试验天数(d)；
日增重(g/头·天)＝平均增重(g/头)/试验天数(d)；
腹泻率(％)＝(腹泻猪头数×腹泻天数)/(试验猪头数×试验天数)×100％。
料肉比＝采食量/日增重
在提高育肥猪采食量、日增重、降低料肉比、腹泻率试验结果如表6。
表6
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由表6可以得出，本发明的饲料添加剂添加到育肥猪饲料中可以有效提高育肥猪日增重，在降低料肉比、腹泻率方面有显著效果。
试验六：本发明所涉及动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂对猪肝肾损伤的有益影响
试验动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂：采用对比例3、7、9、12、13、26实施例4、8方法配制。
试验动物：选择某猪场10～30日龄的具有由霉菌毒素引起的明显肝肾损伤症状的仔猪240头。
由霉菌毒素明显肝肾损伤的猪只临床表现为猪呕吐、眼结膜充血与炎症、产生泪斑，皮肤出血或发白、猝死病例增多，剖检可见肝脏、肾脏苍白，肾脏肿胀，输尿管有白色尿酸盐沉积。
试验设计及方法：
试验分组：用随机分组法分成8组试验组和对照组，每组30头。
对照组按照原饲养条件喂养，试验组按照饲料日粮中添加0.2％所述饲料添加剂拌匀饲喂，猪只自由采食，连续饲喂7天、15天、30天后分别观察。
判断标准：
试验期间，每天早晚两次仔细观察各组病猪的精神状态、食欲、眼结膜情况，是否产生泪斑，皮肤毛色程度及死亡率，试验结束后3天每组随机选取1头剖杀、观察肝脏、肾脏、输尿管组织切片情况。
显效：观察期后，仔猪精神、吃料正常，眼结膜正常，毛色发亮，无皮肤出血或发白现象，症状完全消失；剖检后肝脏、肾脏、输尿管组织切片情况均正常。
有效：观察期后，仔猪精神、吃料正常，眼结膜充血好转，泪斑少见、皮肤出血或发白现象改善，症状有所消失；剖检后肝脏、肾脏、输尿管组织切片情况有好转。
无效：仔猪症状无好转，甚至病情加重。
试验结果如表7所示。
表7
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由表7可以看出连续饲喂30天后，对比例3、7、9、12、13有效率为40％-57％，对比例26的有效率稍高点为70％，而实施例4、8总有效率为93％、97％，比对比例对于猪肝肾损伤有较好的恢复效果。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂，其特征在于由以下按照质量百分比的原料组成：三氧化二铝10-20％、酿酒酵母细胞壁12-15％、苯甲酸钠4-12％、海藻粉5-10％、益生菌2-10％、黄曲霉毒素B1分解酶1-4％、余量为蒙脱石；
所述海藻粉为超微粉碎后粒度为38-74微米的海藻超微粉；
所述益生菌选自凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌；
所述益生菌经过包膜、喷雾干燥、过筛处理；
所述的蒙脱石采用超细提纯技术和纳米杂化插层技术加工而成，其吸附力≥40g/100g，吸蓝量≥41g/100g，吸氨量≥100mmol/100g。
2.根据权利要求1所述的动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂，其特征在于：所述三氧化二铝含量≥90％wt、比表面积≥280m2/g。
3.根据权利要求1所述的动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂，其特征在于：所述益生菌选自凝结芽孢杆菌50亿CFU/g、植物乳杆菌50亿CFU/g。
4.根据权利要求1所述的动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂，其特征在于：所述黄曲霉毒素B1分解酶在pH6.0和30℃条件下酶活力：1000,000U/g；
所述黄曲霉毒素B1分解酶经过包膜、喷雾干燥、过筛处理。
5.根据权利要求1所述的动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂，其特征在于：所述海藻粉蛋白含量≥17.0％wt、海藻多糖≥30.0％wt。
6.动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：由以下按照质量百分比的原料组成：三氧化二铝10-20％、酿酒酵母细胞壁12-15％、苯甲酸钠4-12％、海藻粉5-10％、益生菌2-10％、黄曲霉毒素B1分解酶1-4％、余量为蒙脱石；
所述益生菌选自凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌；
所述益生菌经过包膜、喷雾干燥、过筛处理；
所述的蒙脱石采用超细提纯技术和纳米杂化插层技术加工而成，其吸附力≥40g/100g，吸蓝量≥41g/100g，吸氨量≥100mmol/100g；
制备步骤如下：
步骤1，称取处方量的海藻粉，投入超微粉碎机中，超微粉碎后，通过旋风分离器筛选、经关风机落入气流筛，由气流筛成品口落入收集料桶，收集到超微粉碎后粒度为38-74微米的海藻粉，组成体系1；
步骤2,称取处方量的益生菌、黄曲霉毒素B1分解酶,加入5-10wt％脱脂奶粉、1-5wt％海藻糖及0.2-0.5wt％海藻酸钠作为保护剂，溶解、混合均匀，使用离心式喷雾干燥设备，包被、喷雾干燥完成后，得体系2；
步骤3，将处方量三氧化二铝、酿酒酵母细胞壁、苯甲酸钠分别粉碎后过40目筛,得体系3；
步骤4，将体系1、2、3和蒙脱石一起投入混合机内,混合均匀,即得所述动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂。
7.如权利要求6所述的动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述益生菌选自凝结芽孢杆菌50亿CFU/g、植物乳杆菌50亿CFU/g。
8.如权利要求6所述的动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂的制备方法，其特征在于：所述步骤1,超微粉碎机中，通过控制分级叶轮转速为2500-4500r/min、进风量设置为4-5档、温度设置为40-60℃；气流筛为200目-400目；
所述步骤2，离心式喷雾干燥设备的进风温度90-110℃，出风温度70-100℃。
9.由权利要求6-8中任意一项所述的方法制备得到的动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂。
10.权利要求1-5和9中任意一项所述的动物用处理霉菌毒素和保肝护肾的饲料添加剂在处理霉菌毒素中的应用；
当霉菌毒素轻微污染时，每吨饲料添加0.5～1千克；
当霉菌毒素严重污染时，每吨饲料添加1～2千克。
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