CN113508143A - 醛改性的透明质酸，其制备方法以及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种改性的透明质酸衍生物，其中至少一个N‑乙酰基‑D‑葡糖胺单元的‑CH2‑OH基团被改性成具有结构‑CH2‑O‑CH2‑CHO的醛基，其制备方法和应用。

Description

醛改性的透明质酸，其制备方法以及其应用
技术领域
本发明涉及一种改性的透明质酸衍生物，其制备方法以及其用途。新型改性的透明质酸衍生物的特征在于至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基。
背景技术
如今，可注射填充物用于许多治疗和美学应用中以增加软组织的体积。在美学医疗中，真皮填充物越来越多地用于面部和身体的选定区域的年轻化。它们允许增强面部特征(例如，脸颊和嘴唇)、减少皱纹(例如，鼻唇沟)和皱褶，并且可恢复一些随着年龄增长发生的皮肤和下层组织的体积和弹性的丢失。这使皮肤看起来更光滑更饱满，并且因此提供更年轻的外貌。
已知用于软组织填充物的各种各样的材料。这些材料中的大多数具有短暂的效果(约三至十八个月)，因为它们(例如，胶原蛋白、透明质酸(HA)、聚L-乳酸(PLLA))在体内被吸收。还有一些永久性(即不可吸收的)填充物，如基于聚甲基丙烯酸甲酯珠粒(PMMA微球)的FDA批准的填充物材料。这些已知的软组织填充物中的几种含有利多卡因(lidocaine)(一种局部麻醉剂)，其被添加以减少与注射有关的疼痛或不适。
如今，全世界软组织填充物中最常用的材料为透明质酸(HA)。这是由于其出色的形成体积的能力和有利的安全形象。HA为存在于例如真皮的细胞外基质中的天然存在的葡糖胺聚糖，并且由β-D-(1→3)葡糖醛酸(GlcUA)和β-D-(1→4)-N-乙酰基葡糖胺(GIcNAc)的交替残基构成。HA在凝胶形态下能够与水组合并且溶胀，从而产生平滑/填充效果。在大多数情况下，用于真皮填充物的HA被交联的，使其在体内的寿命更长(长达十八个月)。
Figure BDA0003107557550000011
用于将多糖(例如，HA)分子的聚合物链共价键合在一起以形成具有分子间和分子内交联的填充物材料基质的各种交联方法为本领域已知的。广泛使用的方法为用化学试剂进行化学交联。这些试剂通常与多糖的羟基和/或羧基官能团反应。常用的交联剂包括但不限于二乙烯砜(DVS)、二官能或多官能环氧化物(例如，1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE))、1,2-双(2,3-环氧丙氧基)乙烯(EGDGE)和1,2,7,8-二环氧辛烷(DEO))、基于PEG的交联剂(例如季戊四醇四缩水甘油醚(PETGE))、双碳二亚胺(BCDI)(例如亚苯基双-(乙基)-碳二亚胺和1,6-六亚甲基双-(乙基碳二亚胺)、二胺或多胺交联剂(例如六亚甲基二胺(HMDA)和3-[3-(3-氨基丙氧基)-2,2-双(3-氨基-丙氧基甲基)-丙氧基]-丙胺(4AA))、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS)、1-(2,3-环氧丙基)-2,3-环氧环己烷、环氧氯丙烷、醛(例如甲醛和戊二醛)和酰肼(二价、三价和多价酰肼化合物，例如己二酸二酰肼(ADH))。
已采用用于交联可注射多糖水凝胶的其它方法包括甲基丙烯酸酯化聚合物的光化学交联(
Figure BDA0003107557550000021
等人,《国际人工器官杂志(Int.J.Artif.Organs)》2011,34:93-102)、迈克尔加成交联(Shu等人,《生物大分子(Biomacromolecules)》2002,3:1304-1311)、席夫碱反应交联(Tan等人,《生物材料(Biomaterials)》2009,30:2499-2506)、使用像巯基烯反应或叠氮化物-炔烃环加成的反应的“点击”化学方法(Hoyle等人,《化学学会评论(Chem.Soc.Rev.)》2010,39:1355-1387；van Dijk等人,《结合物化学(Bioconjug.Chem.)》2009,20:2001-2016)。用于扩充软组织的基于多糖的光交联填充物在本领域中也是已知的(参见，例如，US2011/069475)。另外，本领域已研究酸性多糖的羧基官能团与同一或不同多糖分子的羟基的酯化，由此形成“内部”分子间和/或分子内酯基交联(称为“自交联聚合物”或“ACP”)。此外，US 2006/0084759描述一种酪胺改性和交联HA水凝胶材料，其中交联是经由可在体内执行的过氧化物酶介导的二酪胺键合而实现的。
用于制备交联填充物的最常用的方法是借助于BDDE执行交联。然而，BDDE以及其降解产物为小分子量化合物，其具有毒理学危害，并且因此需要从最终产物中彻底去除。真皮填充物中BDDE含量的上限(对于大多数市场而言)低于2ppm。因此，必须确保几乎所有的BDDE分子(以及其降解产物)都已从产物中去除。因此，用于制备BDDE-交联填充物的方法的重要但也是非常耗时的部分为其在交联后的纯化。广泛使用的纯化技术为透析。然而，尽管透析在去除不期望的有毒杂质(即BDDE以及其降解产物)方面非常有效，但它非常耗时，即通常需要几天时间。因此，BDDE-交联填充物的生产由许多非常复杂的工艺步骤组成，这些工艺步骤需要很长时间，主要是几天，这显著地增加最终产物的成本。同样，由于透析主要是手动进行的，因此它是造成凝胶污染的潜在来源。因此，人们高度寻求用于制备克服上述缺点的交联填充物的方法。
同样，常规的预形成的水凝胶经常具有如下缺点：它们是高粘性的，这阻碍它们通过细针的注射。解决该问题的一种方法是使用原位凝胶化水凝胶组合物。这些组合物以液体形式而不是以预形成的凝胶形式注射到组织中，并且在注射部位处交联以形成原位交联凝胶。解决该问题的另一种方法是向交联水凝胶添加润滑相(例如未交联的多糖，例如HA)，这降低注射力。然而，当要注射的水凝胶具有相当低的粘度时，已经表明不一定需要润滑相。
许多原位形成的凝胶使用醛改性的多糖(例如，HA)衍生物，其与另一种多糖(例如，HA)衍生物原位交联以形成交联凝胶。同样，使用在与另一种互补多糖(例如HA)衍生物反应时形成交联凝胶的醛改性的多糖(例如HA)衍生物克服上述关于BDDE交联的问题，因为不需要BDDE。因此，醛改性的多糖(例如，HA)衍生物为制备不含BDDE的交联填充物的有前途的候选者。
在这方面，可参考WO 00/016818，其公开通过将HA的醛(或胺)官能化衍生物(例如，己二酸二肼基-HA)与同型或异型双官能交联剂(例如，双官能N-羟基琥珀酰亚胺酯交联剂，如(SPA)1-PEG)交联而原位形成水凝胶。另外，WO 2011/100469公开一种交联HA水凝胶，其用作通过使带有醛官能团的氧化HA(oxi-HA)与二酰肼交联剂例如己二酸二酰肼(ADH)反应而制造的玻璃质取代生物材料。WO 2009/108100公开通过将醛改性的HA和酰肼改性的聚乙烯醇(PVAH)交联剂混合以形成展现出多个羟基的交联结构而原位制备的基于HA的水凝胶。
另外，WO 2011/069475公开用于通过使用TEMPO(2,2,6,6-四甲基哌啶氧基)/共氧化剂系统将在葡糖胺重复单元的C6处的伯羟基氧化而制备含有醛基的醛-HA衍生物的方法，以及所述醛-HA衍生物用于通过与二胺化合物(例如己二胺)或胺-HA(例如己二胺取代的HA)反应而制备交联HA水凝胶的用途。此外，WO 2017/063749公开第一透明质酸衍生物和第二透明质酸衍生物的用途，其中第一透明质酸衍生物用酰肼部分官能化，并且第二透明质酸衍生物用醛部分官能化，以在目标部位处原位形成交联水凝胶。第二醛官能化透明质酸衍生物可通过将伯羟基(-CH2OH)基团氧化成醛(-CHO)基而制得。
此外，非专利文献还公开使用醛改性的多糖衍生物的原位形成的凝胶。举例来说，Dahlmann等人(《生物材料》2013,34:940-951)描述用于心肌组织工程的充分定义的原位可交联藻酸盐和HA水凝胶。通过在人I型胶原蛋白和新生大鼠心脏细胞(NRHC)存在下使醛和酰肼官能化藻酸盐与HA反应制备水凝胶，以产生腙交联的基于水凝胶的生物人工心脏组织。另外，Ossipov等人(《生物大分子》2010,11:2247-2254)公开使用具有可与水溶液中HA的羧酸根残基进行酰胺型反应的中间二价保护基团的特定对称二官能试剂合成酰肼官能化HA。酰肼官能化HA可用于通过与醛HA衍生物混合而原位形成腙HA水凝胶。
Varghese等人(《美国化学学会志(J.Am.Chem.Soc.)》2009,131:8781-8783)报道用酰肼基和能够共价键合双膦酸酯(BP；一种抗破骨细胞和抗肿瘤的小分子药物)的氨基亚甲基双膦酸酯基双重官能化的HA衍生物。所述双重官能化HA与醛官能化HA的混合导致原位形成可注射HA水凝胶，以用于在植入部位处BP药物的控制释放。Oommen等人(《先进功能材料(Adv.Funct.Mater)》2013,323:1273-1280)描述通过将HA-醛衍生物与碳二酰肼(CDH)官能化HA衍生物混合以获得具有腙键的HA水凝胶而制备的HA水凝胶。另外描述在治疗蛋白(例如重组人生长因子BMP-2)存在下的原位HA水凝胶形成得到用于体内应用的能够为骨组织再生递送生长因子的水凝胶。
然而，通常施用的将醛官能团添加到透明质酸中的方法示出许多缺点。举例来说，借助于未官能化透明质酸的高碘酸盐氧化引入醛基通常导致多糖主链的环状糖环断裂，这降低透明质酸的整体稳定性并且为多糖主链增加不期望的柔韧性。具体地，用于将醛官能团引入透明质酸的常用反应，例如用高碘酸钠氧化，需要长的反应时间和/或就不期望氧化成羧酸基而言难以控制。
此外，不存在适用于每种应用或每名患者的通用填充物。举例来说，对于不同的应用需要具有不同刚度/硬度(通常借助于弹性模量表达)的凝胶。鉴于在面部肌肉移动期间出现相对较高的动态力，通常期望具有较高刚度的凝胶以校正如鼻唇沟和木偶纹的区域。相比之下，刚度较低的凝胶更适合于抗变形能力不重要或解剖结构不需要刚度但体积和柔软度很重要的区域，例如在嘴唇中(参见例如Kablik等人,《皮肤外科(Dermatol Surg)》,2009,35,302-312)。
然而，由醛改性的多糖(例如，HA)衍生物和互补多糖(例如，HA)衍生物(原位交联，即在注射两种互补多糖衍生物之后；或体外交联，即在注射之前)制备的水凝胶的特性(例如刚度)在很大程度上取决于特定改性多糖(例如，改性的透明质酸)的特性，特别是其分子量和改性程度。例如，具有非常低的醛改性度(即，非常低的醛基数)的醛改性的透明质酸将具有相对少量的交联形成，因此，所得凝胶将相当柔软。因此，不同醛改性的透明质酸用于不同的应用。虽然导致“较软的”水凝胶的醛改性的透明质酸(例如，具有低改性度的醛改性的透明质酸)可用于唇填充物，但是导致“较硬的”水凝胶的醛改性的透明质酸(例如，具有高改性度的醛改性的透明质酸)可用于鼻唇沟或木偶线的填充物。
因此，通常高度寻求用于生产用于在体外或原位形成交联凝胶的改性的透明质酸(例如醛改性的透明质酸)的方法，其允许改性(微调)所得醛改性的透明质酸的特性。特别地，期望的方法允许容易地改性所得醛改性的透明质酸的特性，而不显著地改性整个合成方法，即保持大多数参数恒定，而仅改变容易修改的参数，例如起始材料浓度、氧化剂的量和反应时间。使用这类方法，相同或相似的实验装置可用于生产展现出不同特性(例如，不同改性度和分子量)的不同醛改性的透明质酸。
发明目的
鉴于以上所述，本发明的目的是提供一种通用并且方便的方法，以用于生产适合于在体外或原位形成基于交联透明质酸的水凝胶的醛改性的透明质酸。此外，本发明的目的是提供特别适合于美学应用的这类醛改性的透明质酸。本发明的另一个目的是提供特别适合于美学应用的由醛改性的透明质酸制备的水凝胶。
发明内容
通过提供新型改性的透明质酸衍生物(在本文中也被称为“醛改性的透明质酸衍生物”或“醛改性的透明质酸”)和其制备方法来解决上述目的。新改性的透明质酸衍生物的至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基，并且当其与第二多醣衍生物反应时可用于在体外和原位形成交联水凝胶，所述第二多糖衍生物包含能够与新改性的透明质酸衍生物的一个或多个醛基形成共价键的一个或多个亲核官能团。
两种官能化多糖衍生物(即新改性的透明质酸衍生物和第二多糖衍生物)可以液体形式共注射，从而即使通过细针也使得能够以低挤出力共注射。期望地，原位凝胶形成不产生任何有害的副产物。唯一的副产物为水，其容易被形成的水凝胶和/或周围组织吸收。另外，就组织整合、皮肤改善、组织成形能力和丰体能力而言，原位形成的水凝胶具有期望的特性。
同样，令人惊讶地发现，新的醛改性的透明质酸衍生物适合于经由与第二互补多糖衍生物，优选地也是透明质酸衍生物反应而在体外制备交联凝胶。特别地，已经发现，这类制备的凝胶的特性不仅可借助于单个衍生物的特性(例如改性度和分子量)来控制，而且还可通过调节用于交联的介质中的相应多糖衍生物的浓度来控制。
有利的是，具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基刚好足够长以提供交联的良好空间可用性，但足够短以不向交联凝胶添加太多柔韧性。这使得新改性的透明质酸衍生物特别适合于覆盖广泛刚度范围的凝胶的原位形成。举例来说，使用具有高改性度(即大量醛基)的新改性的透明质酸衍生物导致形成大量(由于大量空间上可用的醛基)相对较短的交联，从而导致形成相对较硬的凝胶。
本发明的改性的透明质酸衍生物可由甘油改性的透明质酸制备，其特征在于借助于将所述-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH基团氧化成具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基，至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成下式-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH的部分。这种制备新改性的透明质酸衍生物的新颖方法避免通常用于制备醛改性的透明质酸衍生物的方法的缺点，如反应时间长、透明质酸的分子量显著降低或不期望氧化成羧酸基。
已经表明，通过使用这种方法，仅通过改变如起始材料浓度、氧化剂的量和反应时间的基本参数就可容易地调节新改性的透明质酸衍生物的特性。举例来说，通过变化起始材料浓度、氧化剂的量和/或反应时间，可以微调所得新改性的透明质酸衍生物的改性度和/或分子量。
在第一方面，本发明涉及改性的透明质酸衍生物，其中至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基。优选地，改性的透明质酸衍生物包含具有以下结构的至少一个二糖单元
Figure BDA0003107557550000061
中Ac表示-C(O)CH3并且R选自氢、碱金属离子(优选地Na)或碱土金属离子。
在第二方面，本发明涉及用于制备本发明的改性的HA衍生物的方法。方法包含以下步骤：a)提供甘油改性的透明质酸，其特征在于至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成具有下式-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH的部分；b)将甘油改性的透明质酸溶解在水性介质中以获得溶解的甘油改性的透明质酸；c)使所述溶解的甘油改性的透明质酸与氧化剂，优选地高碘酸盐，更优选地高碘酸钠反应，以将所述-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH基团的至少一部分转化成具有式-CH2-O-CH2-CHO的醛基，从而获得醛改性的透明质酸衍生物。
在第三方面，本发明涉及通过本发明的方法获得的改性的透明质酸衍生物。
在第四方面，本发明涉及本发明的改性的透明质酸衍生物或通过本发明的方法获得的改性的透明质酸衍生物用于在美学应用中原位形成交联水凝胶的用途。
在第五方面，本发明涉及本发明的改性的透明质酸衍生物或通过本发明的方法获得的改性的透明质酸衍生物用于形成预形成的交联水凝胶的用途。
在第六方面，本发明涉及本发明的改性的透明质酸衍生物或通过本发明的方法获得的改性的透明质酸衍生物，其用于原位形成用于治疗应用的交联水凝胶。
改性的透明质酸衍生物通常与第二多糖衍生物一起使用，所述第二多糖衍生物包含能够与改性的透明质酸衍生物的一个或多个醛基形成共价键的一个或多个亲核官能团，其中第二多糖优选地为透明质酸衍生物，并且所述亲核官能团优选地为酰肼官能团，并且其中第二多糖更优选地为包含至少一个具有以下结构的二糖单元的透明质酸衍生物：
Figure BDA0003107557550000071
其中“Ac”如上文所定义。
在第七方面，本发明涉及交联水凝胶，其包含以下结构单元：
Figure BDA0003107557550000072
其中“Ac”和R如上文所定义。
在第八方面，本发明涉及通过使本发明的醛改性的HA衍生物或通过本发明的方法获得的改性的透明质酸衍生物与第二多糖衍生物接触而获得的交联水凝胶，所述第二多糖衍生物包含能够与改性的HA衍生物的一个或多个醛基形成共价键的一个或多个亲核官能团，如本文所定义。
在第九方面，本发明涉及制备交联水凝胶的方法，优选地美学方法，所述方法包含以下步骤：a)提供包含本发明的改性的透明质酸衍生物或通过本发明的方法获得的改性的透明质酸衍生物的第一前体溶液，和与其分开的包含如本文所定义的第二多糖衍生物的第二前体溶液；b)将第一前体溶液和第二前体溶液混合成原位可交联混合物；和c)将原位可交联混合物注射到患者体内的目标部位上，以在目标部位处形成交联凝胶。
在第十方面，本发明涉及用于制备交联水凝胶，优选地预形成的交联水凝胶的方法。
在第十一方面，本发明涉及用于原位形成交联水凝胶的试剂盒，其包含(i)含有包含本发明的改性的透明质酸衍生物或通过本发明的方法获得的改性的透明质酸衍生物的第一前体溶液的第一容器，和(ii)含有包含如本文所定义的第二多醣衍生物的第二前体溶液的第二容器，以及任选地(iii)使用说明书。
在附属权利要求中阐明本发明的特定实施例。
附图说明
为了更全面地理解本发明，参考以下描述和附图，其中：
图1示出用于确定分子量的示例性色谱图。
图2示出酪氨酸标记的醛改性的透明质酸衍生物的示例性1H NMR光谱。
图3示出在40℃下储存的凝胶1和2的储能模量(G')。
图4示出在40℃下储存的凝胶1和2的损耗因子(tanδ)。
具体实施方式
本发明基于令人惊奇的发现，即醛改性的透明质酸可容易地由甘油改性的透明质酸制备。特别地，已经发现由甘油改性的透明质酸制备醛改性的透明质酸没有示出典型地在制备醛改性的透明质酸中出现的缺点，如分子量显著降低、反应时间长和不期望副反应(例如氧化成羧酸)。更甚至已经发现，仅通过修改如起始材料浓度、氧化剂的量和反应时间的基本参数就可容易地修改(微调)所得醛改性的透明质酸衍生物的特性。
特别地，已经发现，通过变化起始材料浓度(即，甘油改性的透明质酸的浓度)、氧化剂的量和反应时间可微调所得醛改性的透明质酸衍生物的改性度和分子量。这是特别有利的，因为所得醛改性的透明质酸衍生物的改性度和分子量直接影响所述醛改性的透明质酸衍生物的凝胶性能。因此，可仅借助于一种通用的合成方法来制备具有不同特性并且因此导致具有不同特性例如硬度的交联凝胶的醛改性的透明质酸衍生物。
此外，已经发现，本发明的改性的透明质酸衍生物特别适合于原位和在体外形成交联水凝胶，即它示出良好的交联特性。特别地，已经发现，本发明的改性的透明质酸衍生物与第二多糖衍生物示出良好的交联特性，所述第二多糖衍生物包含能够与改性的透明质酸衍生物的一个或多个醛基形成共价键的一个或多个亲核官能团。在此方面，已经发现本发明的改性的透明质酸衍生物和所述第二多糖衍生物快速并且有效地交联以形成共价交联水凝胶，例如在体内的目标部位处。不需要添加剂、不需要催化剂、不需要pH转换、不需要UV照射也不需要任何其它外部刺激(或“触发”)来引发交联反应。特别地，不使用或不需要交联剂。由交联反应产生的唯一副产物典型地为水，如果在原位发生交联，那么水容易被水凝胶和/或周围组织吸收。
如本文所用，术语“甘油改性的透明质酸”是指透明质酸，其特征在于至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成具有下式-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH的部分。甘油改性的透明质酸可商购自法国的“htl生物技术”(“htl biotech”,France)，或者可根据以下反应方案通过将缩水甘油接枝到透明质酸上来制备：
Figure BDA0003107557550000091
优选地，除了与GIcNac单元的C6碳键合的-OH基团外，没有其它基团借助于与缩水甘油的反应而被改性。优选地，甘油改性的透明质酸每100个存在于透明质酸中的N-乙酰基-D-葡糖胺单元含有1至100，优选地2至50，更优选地5至20，并且最优选地10至20个-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH基团。已经表明所述改性度特别适合于随后制备具有期望(醛)改性度的本发明的醛改性的透明质酸衍生物，以借助于与互补第二多醣衍生物，优选地透明质酸衍生物的反应来制备用于美学应用的交联水凝胶。应指出，在本发明的意义内，透明质酸的其它官能团，即其它-OH基团和-COOH基团，特别是其它(仲)-OH基团可被甘油改性，尽管程度小得多。然而，在本发明内，含有甘油的部分优选地仅、基本上仅或主要存在于GIcNac单元的C6碳上。
如本文所用，术语“原位”意指在给药部位处，即在患者体内。因此，为了“原位”(即在给药部位处)形成水凝胶，通常将本发明的改性的透明质酸衍生物与第二多糖衍生物共注射，所述第二多糖衍生物包含能够与本发明的改性的透明质酸衍生物的一个或多个醛基形成共价键的一个或多个亲核官能团，或者以其他方式将这些化合物一起施用于患者体内的特定部位(目标部位)，例如出于美学原因需要组织扩充的部位，并且允许在共注射部位处进行共价交联。在本发明内，术语“原位”和“体内”可互换使用。在本发明的意义上，“患者”可为例如出于美容、美学或治疗目的需要“医治”特定病症、状态或疾病的任何个体或受试者，例如哺乳动物，并且优选地人类。因此，应理解，如本文所用的术语“医治”不仅是指治疗/医学医治，而且包括例如美容和美学医治。
如本文所用，术语“体外”意指在人体或动物体外。同样地，如本文所用的术语“预形成的水凝胶”、“预形成的凝胶”等是指在人体或动物体外形成的水凝胶。因此，应理解，术语“预形成的”和“体外”均描述水凝胶在注射之前在人体或动物体外形成。因此，“体外”制备的凝胶为“预形成的”凝胶，即在人体或动物体外形成的凝胶。
如本文所用，术语“人工容器”是指不是人体或动物体或其一部分的任何容器。优选地，人工容器由非生物材料，优选地玻璃或塑料材料，更优选地玻璃制造。
在本发明的上下文内，术语“共注射”通常意指将本发明的改性的透明质酸衍生物和所述第二多糖衍生物作为单一液体组合物(例如溶液)一起注射到患者体内的目标部位。如本文所用，术语“可注射的”或“注射”指示原位水凝胶形成组合物可从注射器或注射器系统分配。特别地，术语“共注射”优选地意指本发明的改性的透明质酸衍生物和所述第二多糖衍生物在从针尖离开并且进入患者体内的目标部位之前被混合，特别是均匀地混合，并且然后作为混合物注射到患者体内的目标部位。在本发明内，术语“注射”或“共注射”可以是指皮内、皮间或皮下注射或表皮下注射。另外，如本文所用的术语“针”旨在包含或同义于“插管”或适合于注射的任何其它针状物体。
如本文所用的术语“水凝胶”或“凝胶”意指由共价交联聚合物链组成的水溶胀的三维网络。优选地，交联(或“凝胶化”)水凝胶为内聚的。在本发明的含义内的术语“内聚的”或“内聚性”被定义为材料(例如，水凝胶)由于其分子彼此的亲和力而不分解的能力。内聚性为凝胶植入物(例如，本文所述的原位凝胶化水凝胶)的关键特征，并且被认为对于保持凝胶的固相和流体相完整并且因此对于凝胶完整性而言是必需的。在本发明的上下文中，多糖水凝胶，特别是基于HA的水凝胶的内聚性可使用Gavard-Sundaram内聚性量表来确定(Sundaram等人,《整形与再造外科学(Plast.Reconstr.Surg.)》136:678-686,2015)。
如本文所用的术语“自发”或“自发地”旨在是指以下事实：本发明的改性的透明质酸衍生物的醛基和第二多糖衍生物的亲核基团在没有任何外部刺激(也被称为“触发”)像热或UV光的情况下形成共价键。特别地，已经发现水凝胶可在体内条件下，即在共注射到患者体内的目标部位之后，在没有任何外部刺激(也被称为“触发”)像热或UV光的情况下自发形成，导致在目标部位处原位形成交联多糖水凝胶。
在本发明内，原位(或体内)形成的水凝胶通常适合于、用作和/或充当软组织填充物。如本文所用的术语“软组织填充物”通常是指被设计成填充腔和/或增加软组织不足区域的体积的材料。这包括，例如，扩充、填充或替换软组织。在本文中，术语“软组织”通常是指连接、支撑或围绕身体的其它结构和器官的组织。软组织包括例如肌肉、肌腱(将肌肉连接到骨骼的纤维带)、纤维组织、脂肪、血管、神经和滑膜组织(关节周围的组织)。在本发明的上下文中，软组织填充物优选地为真皮填充物。
在第一方面，本发明涉及改性的透明质酸衍生物，其中至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基。
如上所述，已经发现此改性的透明质酸衍生物示出良好的交联特性。不希望受任何特定理论的束缚，据信良好的交联特性归因于借助于本发明的方法引入的醛基的空间特性，即至少一个GIcNAc单元的-CH2-OH基团被改性成具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基。特别地，据信所述醛基刚好足够长以提供交联的良好空间可用性，但足够短以不向交联凝胶添加太多柔韧性。
优选地，改性的透明质酸衍生物不含除醛基，优选地存在于GIcNAc单元的C6碳原子上并且具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基以外的其它化学改性。
优选地，本发明的改性的透明质酸衍生物的改性度为1.0％至20.0％，更优选地1.0％至15.0％，甚至更优选地1.0％至10.0％，甚至更优选地1.5％至10.0％，甚至更优选地1.5％至8.0％，甚至更优选地1.8％至7.0％，甚至更优选地2.0％至6.9％。改性度(MoD)被定义为-CH2-O-CH2-CHO基团的数目除以存在于改性的透明质酸衍生物中的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的总数。举例来说，MoD为15.0％意指改性的透明质酸衍生物每100个N-乙酰基-D-葡糖胺单元含有15个-CH2-O-CH2-CHO基团。MoD为37.0％意指改性的透明质酸衍生物每100个N-乙酰基-D-葡糖胺单元含有37个-CH2-O-CH2-CHO基团等。已经发现，这种相当低的改性度特别适合于制备用于其中需要相对较低粘度的水凝胶的美学应用的水凝胶。同样，这类低粘度水凝胶仍然可通过细针注射，这允许在体外制备水凝胶(即形成预形成的水凝胶)，其特性可在注射前彻底确定和检查，然而，如果水凝胶为原位制备的，那么这为不可能的。
由于由本发明的改性的透明质酸衍生物形成的水凝胶的硬度(或刚度；例如，如由弹性模量所指示)取决于在所述水凝胶中形成的交联的数目和密度，并且在所述水凝胶中形成的交联的数目和密度直接取决于本发明的改性的透明质酸衍生物的改性度，改性度直接影响由本发明的改性的透明质酸衍生物形成的水凝胶的硬度。因此，改性度为本发明的改性的透明质酸衍生物的重要特征。
改性度(MoD)可经由光谱和/或光谱分析方法如1H NMR、UV/Vis和IR、滴定、HPLC、SEC、粘度等来确定。适宜地，改性度借助于1H NMR来确定。在实例部分中给出用于确定MoD的示例性方法。
分子量(也称为摩尔质量)为改性的透明质酸衍生物的另一个重要特征，其直接影响由此形成的凝胶的特性。优选地，改性的透明质酸衍生物的重均分子量为0.1至2.5MDa，更优选地0.2至1.5MDa，甚至更优选地0.4至1.3MDa，甚至更优选地0.6至1.1MDa。
本文中表达多糖(例如HA)的“分子量”、“摩尔质量”、“平均分子量(meanmolecular weight)”、“平均摩尔质量(mean molar mass)”、“平均分子量(averagemolecular weight)”和“平均摩尔质量(average molar mass)”的所有数字均应理解为指示以道尔顿(Da)为单位的重均分子量(或质均分子量或重均摩尔重量)或Mw(w为重量)。质均摩尔质量(Mw)被定义为如下：Mw＝ΣiNiMi 2/ΣiNiMi，其中，Ni为摩尔质量Mi的分子数。
本文中可应用各种方法来确定HA的分子量，如特性粘度测量(例如，《欧洲药典7.0(European Pharmacopoeia 7.0)》-透明质酸专论号1472，01/2011)、毛细管电泳法(CE)(例如，根据Kinoshita等人,《生物医学色谱法(Biomed.Chromatogr.)》,2002,16:141-45)、凝胶渗透色谱法(GPC)(例如，根据Kim等人,《食品化学(Food Chem.)》,2008,109:63-770)，以及多角度激光散射联合尺寸排阻色谱法(SEC-MALLS)(例如，根据Hokputsa等人,《欧洲生物物理学杂志和生物物理学快报(Eur.Biophys.J.Biophys.Lett.)》,2003,32:450-456)。
在本发明的框架内，HA聚合物的重均分子量(Mw)优选地通过凝胶渗透色谱法(GPC)或经由Mark-Houwink方程的粘度测定法来确定。GPC技术涉及在高达几兆帕(MPa)的压力下，通过填充聚合物颗粒的基质洗脱聚合物溶液。如本领域技术人员所公知的，使用低分散度标准将保留时间与摩尔质量相关联。
在本发明的上下文中，尽管通常将其称为粘均摩尔质量或Mv的事实，但是也可借助于Mark-Houwink方程来确定质均摩尔质量(Mw)。Mark-Houwink方程给出特性粘度(η)和分子量M之间的关系，并且允许根据特性粘度的数据确定聚合物的分子量，并且反之亦然。在本发明的上下文内，特性粘度优选地根据欧洲药典7.0(透明质酸专论号1472，01/2011)中定义的程序测量。在本发明的框架内，平均分子量优选地为粘均分子量(Mn)，其可使用Mark-Houwink方程由特性粘度计算：
[η]＝K x Mη a，
其中[η]＝特性粘度，单位为m3/kg，Mη＝粘均分子量，K＝2.26x10-5，并且a＝0.796，其中，如上所述，特性粘度优选地根据欧洲药典7.0(透明质酸专论号1472，01/2011)中定义的程序测量。
分子量的确定也以实例部分举例说明。
优选地，改性的透明质酸衍生物包含具有以下结构的至少一个二糖单元
Figure BDA0003107557550000131
其中“Ac”表示-C(O)CH3并且R选自氢、碱金属离子(优选地Na)或碱土金属离子。应理解，代替以质子化形式(即R＝H)存在，羧酸基还可以去质子化形式(即R＝负电荷)存在，而不存在任何特定的抗衡离子来平衡负电荷。例如，在平衡负电荷的抗衡离子被溶剂化并且位于去质子化羧酸的随机附近的溶液中，发生这种情况。
改性的透明质酸衍生物可另外包含具有以下结构的至少一个二糖单元
Figure BDA0003107557550000132
其中“Ac”如上文所定义并且R1、R2、R3和R4独立地选自H和-CH2-CHO，并且R5选自氢、碱金属离子(优选地Na)、碱土金属离子和-CH2-CHO，条件是R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为-CH2-CHO，并且如果R1为-CH2-CHO，那么R2、R3、R4和R5中的至少一个为-CH2-CHO。
优选地，存在于GIcNAc单元的C6碳原子上的醛基的数目(即，R1＝-CH2-CHO)除以存在于改性的透明质酸衍生物中的醛基(包括存在于GIcNAc单元的C6碳原子上的醛基)的总数为0.60至1，优选地0.65至1，更优选地0.70至1，甚至更优选地0.75至1，甚至更优选地0.80至1，甚至更优选地0.85至1，甚至更优选地0.90至1，甚至更优选地0.95至1，甚至更优选地0.97至1，甚至更优选地0.98至1，甚至更优选地0.99至1，最优选地1。
在第二方面，本发明涉及用于制备本发明的改性的透明质酸衍生物的方法。方法包含以下步骤：a)提供甘油改性的透明质酸，其特征在于至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成具有下式-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH的部分；b)将甘油改性的透明质酸溶解在水性介质中以获得溶解的甘油改性的透明质酸；c)使所述溶解的甘油改性的透明质酸与氧化剂反应，以将所述-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH基团的至少一部分转化成具有式-CH2-O-CH2-CHO的醛基，从而获得醛改性的透明质酸衍生物。
优选地，氧化剂为高碘酸盐或乙酸铅(IV)，优选地高碘酸盐。更优选地，氧化剂为高碘酸钠。
如上所述，已经发现本发明的方法没有示出典型地在制备醛改性的透明质酸中出现的缺点，如分子量显著降低、反应时间长和不期望副反应(例如氧化成羧酸)。举例来说，已经发现，即使使用高碘酸钠作为氧化剂，已知高碘酸钠使聚合物主链氧化从而导致聚合物主链断裂和透明质酸的分子量降低，但在本发明的方法中，不发生或很少发生聚合物主链氧化。
这种令人惊讶的行为的原因如下：高碘酸盐偏爱顺式二醇而不是反式二醇；为了用高碘酸盐氧化反式二醇，需要相对苛刻的条件和/或长的反应时间。当聚合物主链的羟基彼此反式取向时，甘油部分的-OH基团(例如-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH)可自由旋转。因此，甘油部分的邻二醇可很好地用于高碘酸盐氧化，并且氧化反应(即步骤c))可在温和条件下在相对较短的时间内执行，使得在聚合物主链处不发生氧化。举例来说，已经发现步骤c)的氧化反应可在少于一小时内，甚至在10分钟内进行。
此外，已经发现，仅通过修改例如起始材料浓度、氧化剂的量和反应时间的基本参数就可容易地修改(微调)第一方面的所得改性的透明质酸衍生物的特性。
优选地，本发明的方法另外包含以下步骤中的一个或多个：
d)优选地通过添加乙二醇来终止步骤c)的反应；
e)优选地通过在有机溶剂(优选地乙醇、异丙醇或其混合物)中沉淀改性的透明质酸衍生物，将沉淀物重新溶解在盐水中并且在所述有机溶剂中再沉淀改性的透明质酸衍生物来纯化改性的透明质酸衍生物；
f)干燥在步骤e)中获得的改性的透明质酸衍生物。
优选地，甘油改性的透明质酸的重均分子量为0.1至5.0MDa，更优选地1.0至3.0MDa，更优选地1.0至2.0MDa，甚至更优选地1.1至1.9，甚至更优选地1.2至1.8MDa，甚至更优选地1.3至1.7MDa，甚至更优选地1.4至1.6MDa。甘油改性的透明质酸的重均分子量还可为2.0至5.0MDa，或2.5至5.0MDa，或3.0至5.0MDa，或3.0至4.5MDa，或3.0至4.0MDa。
还优选地，甘油改性的透明质酸的改性度为5至25％，优选地10至20％。在这种情况下，改性度被定义为-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH基团的数目除以存在于甘油改性的透明质酸中的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的总数。举例来说，MoD为25.0％意指甘油改性的透明质酸每100个N-乙酰基-D-葡糖胺单元含有25个-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH基团。MoD为50.0％意指甘油改性的透明质酸每100个N-乙酰基-D-葡糖胺单元含有50个-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH基团等。已经表明所述改性度特别适合于制备具有期望(相当低)的醛改性度的醛改性的透明质酸衍生物，以制备用于美学应用的交联水凝胶。
优选地，步骤c)在4至35℃，更优选地15至35℃，甚至更优选地20至30℃，甚至更优选地20至25℃，甚至更优选地约21至23℃，甚至更优选地约22℃的温度下执行。已经表明，这些相当低的反应温度确保根据本发明获得的醛改性的透明质酸衍生物具有合适的改性度，以制备用于美学应用的水凝胶。
还优选的是，步骤c)执行5至120分钟，优选地5至65分钟，更优选地10至60分钟，甚至更优选地10至50分钟，甚至更优选地10至40分钟，甚至更优选地10至30分钟，甚至更优选10至20分钟的持续时间。已经表明，这些相当短的反应时间还确保根据本发明获得的醛改性的透明质酸衍生物具有“正确”改性度，以用于制备用于美学应用的水凝胶。
已经发现，(醛)改性度随着反应时间的增加而增加，并且制备的改性的透明质酸衍生物的分子量随着反应时间的增加而稍微降低。
另外，优选的是按甘油改性的透明质酸的二糖重复单元的摩尔量计，氧化剂(优选地高碘酸钠)以0.01至0.5摩尔当量，优选地0.01至0.3摩尔当量，更优选地0.04至0.3摩尔当量，甚至更优选地0.04至0.1摩尔当量的量存在。
已经发现(醛)改性度随着氧化剂的量的增加而增加，并且分子量随着氧化剂的量的增加而减少。
另外，优选的是按总反应体积计，甘油改性的透明质酸以2至50g/L，优选地2至40g/L，更优选地3至38g/L，更优选地4至36g/L的量存在。
已经发现(醛)改性度随着甘油改性的透明质酸的量的增加而增加，并且分子量随着甘油改性的透明质酸的量的增加而减少。
在第三方面，本发明涉及通过在第二方面所述的方法获得的改性的透明质酸衍生物。
同样在此方面，优选的是改性的透明质酸衍生物不含除醛基，优选地存在于GIcNac单元的C6碳原子上并且具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基以外的其它化学改性。
另外，优选的是通过在第二方面所述的方法获得的改性的透明质酸衍生物的改性度为1.0％至20.0％，更优选地1.0％至15.0％，甚至更优选地1.0％至10.0％，甚至更优选地1.5％至10.0％，甚至更优选地1.5％至8.0％，甚至更优选地1.8％至7.0％，甚至更优选地2.0％至6.9％。
另外，优选的是通过在第二方面所述的方法获得的改性的透明质酸衍生物的重均分子量为0.1至2.5MDa，优选地0.2至1.5MDa，更优选地0.4至1.3MDa，甚至更优选地0.6至1.1MDa。
另外，优选的是通过在第二方面所述的方法获得的改性的透明质酸衍生物包含至少一个具有以下结构的二糖单元
Figure BDA0003107557550000161
其中“Ac”如上文所定义并且R选自氢、碱金属离子(优选地Na)或碱土金属离子。再次，应理解，代替以质子化形式(即R＝H)存在，羧酸基还可以去质子化形式(即R＝负电荷)存在，而不存在任何特定的抗衡离子来平衡负电荷。
另外，通过在第二方面所述的方法获得的改性的透明质酸衍生物可另外包含至少一个具有以下结构的二糖单元
Figure BDA0003107557550000162
其中“Ac”如上文所定义并且R1、R2、R3和R4独立地选自H和-CH2-CHO，并且R5选自氢、碱金属离子(优选地Na)、碱土金属离子和-CH2-CHO，条件是R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为-CH2-CHO，并且如果R1为-CH2-CHO，那么R2、R3、R4和R5中的至少一个为-CH2-CHO。
另外，同样在此方面，优选的是存在于GIcNAc单元的C6碳原子上的醛基的数目(即，R1＝-CH2-CHO)除以存在于改性的透明质酸衍生物中的醛基(包括存在于GIcNAc单元的C6碳原子上的醛基)的总数为0.60至1，优选地0.65至1，更优选地0.70至1，甚至更优选地0.75至1，甚至更优选地0.80至1，甚至更优选地0.85至1，甚至更优选地0.90至1，甚至更优选地0.95至1，甚至更优选地0.97至1，甚至更优选地0.98至1，甚至更优选地0.99至1，最优选地1。
在第四方面，本发明涉及本发明的改性的透明质酸衍生物用于在美学应用中原位形成交联水凝胶的用途。
本发明的美学应用为非治疗性的。优选地，本发明的美学应用为非手术的。
优选地，在第一和第三方面所述的改性的透明质酸衍生物用于原位形成交联水凝胶，以用于医治皮肤的皱纹和细纹，包括眉间纹、鼻唇沟、下巴皱褶、木偶纹、下巴松弛、颊部连合、口周纹和鱼尾纹、皮肤凹陷、疤痕、太阳穴、眉毛的皮下支撑、颧颊脂肪垫、泪沟、鼻子、嘴唇、脸颊、下巴、口周区、眶下区和面部不对称。
在第五方面，本发明涉及本发明的(醛)改性的透明质酸衍生物或通过本发明的方法获得的改性的透明质酸衍生物用于形成预形成的交联水凝胶的用途。
优选地借助于使本发明的(醛)改性的透明质酸衍生物与第二多糖衍生物反应形成水凝胶，所述第二多糖衍生物包含一个或多个能够与一个或多个醛基形成共价的亲核官能团。与常用的基于BDDE的生产方法相比，使用本发明的(醛)改性的透明质酸衍生物制备交联水凝胶具有多种优点。首先，由于不使用有毒化学物质，并且优选地仅生产水作为副产物，因此必须花费较少的时间来纯化获得的水凝胶，并且因此，整个生产要简单得多并且更快。另外，由于纯化为潜在的污染源，因此可基本上降低污染的风险。
另外，由于美学应用需要相当低粘度的水凝胶，因此已经发现制备的预形成的水凝胶通过细针示出良好的可注射性。然而，如果应该减小注射力，那么可添加未交联的多糖，优选地透明质酸作为润滑相。
水凝胶优选地在缓冲介质，优选地生理缓冲液，更优选地磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液或乙酸盐缓冲液，甚至更优选地磷酸盐缓冲液中形成。优选地，缓冲液存在于人工容器中。
在第六方面，本发明涉及本发明的改性的透明质酸衍生物，其用于原位形成交联水凝胶以用于治疗应用，优选地用于医治压力性尿失禁、阴道干燥、膀胱-输尿管反流、声带功能不全和声带内移。
优选地，并且这适用于使用由根据本发明的醛改性的透明质酸衍生物制备的水凝胶的所有方面，改性的透明质酸衍生物与第二多糖衍生物一起使用，所述第二多糖衍生物包含一个或多个能够与改性的HA衍生物的一个或多个醛基形成共价键的亲核官能团。
优选地，并且这适用于使用第二多糖衍生物的所有方面，第二多糖衍生物由天然多糖或半合成多糖衍生。合适的多糖的具体实例包括纤维素、葡聚糖、淀粉、藻酸盐、透明质酸、果胶、壳多糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素、肝素前体等。
特别优选的是第二多糖衍生物为透明质酸衍生物。在这种情况下，亲核官能团优选地经由D-葡糖醛酸部分的羧酸基附接到透明质酸主链。
优选地，能够与改性的HA衍生物的一个或多个醛基形成共价键的亲核官能团为氨基、氨基氧基、肼基甲酸盐或酰肼部分，并且优选地为酰肼部分。
如本文所用的术语“酰肼部分”包括碳原子总数通常不超过15、10、5、4、3或2个的酰肼官能团和酰肼封端的基团或残基。酰肼部分优选地为酰肼(即[多糖]-C(O)-NH-NH2)或二酰肼部分，特别地以下通式的二酰肼部分
[多糖]-C(＝O)-NH-NH-R1-C(＝O)-NH-NH2
其中R1＝共价键、C(＝O)、C(＝O)-O-R2、(C＝O)-R2，其中R2＝直链或支链C1、C2、C3、C4、C5或C6烷基或烯基。特别优选的是用于本文的为碳二酰肼(CDH)。如果将CDH用作酰肼部分并且与多糖的羧基偶联，那么所得改性的多糖具有以下侧酰肼封端部分：多糖-C(＝O)-R，其中R为-NH-NH-C(＝O)-NH-NH2。
优选地，第二多糖衍生物的亲核官能团经由衍生第二多糖衍生物的多糖的游离羧酸基附接到多糖主链。羧酸基的改性可通过本领域已知的任何方法使用水溶性偶联剂进行。举例来说，合适的方法涉及使用标准碳二亚胺化学方法，如使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)作为偶联剂，以将酰肼封端的部分与羧基偶联以形成对应的多醣酰基酰肼(参见，例如，WO 95/15168)。其它可用的偶联剂为三嗪化合物，如4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM；参见，例如，WO 2016/097211)、活性酯(如N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)和四甲基铵盐(例如HATU)。
优选地，第二多糖为包含至少一个具有以下结构的二糖单元的透明质酸衍生物：
Figure BDA0003107557550000191
其中“Ac”如上文所定义。
当彼此接触时，在将改性的透明质酸衍生物和第二多糖衍生物共注射到受试者体内的目标部位上时，改性的透明质酸衍生物的醛基和第二多糖衍生物的亲核官能团自发形成共价键，从而在目标部位处形成交联水凝胶。可替代地，在体外接触时，改性的透明质酸衍生物的醛基和第二多糖衍生物的亲核官能团自发形成共价键。在这种情况下，改性的透明质酸衍生物和第二多糖优选地存在于如上文所定义的缓冲液中，其中缓冲液优选地存在于人工容器中。
在第七方面，本发明涉及交联水凝胶，其包含以下结构单元：
Figure BDA0003107557550000192
其中“Ac”表示-C(O)CH3并且R选自氢、碱金属离子(优选地Na)和碱土金属离子。
根据优选实施例，交联水凝胶为预形成的交联水凝胶。优选地，所述预形成的水凝胶存在于即用型递送系统中，如预填充的注射器中。优选地，所述预形成的交联水凝胶为无菌的，并且准备好被注射到患者体内，优选地用于美学应用。优选地通过湿热对水凝胶进行灭菌(例如高压灭菌)。优选地，首先将水凝胶填充到递送系统(例如注射器)中，并且然后将所得的即用型递送系统(如预填充的注射器)进行灭菌。优选地，所述预形成的交联水凝胶另外包含未交联的多糖，优选地透明质酸，作为润滑相。润滑相降低美学应用中常用的通过细针的注射力，并且确保水凝胶(尽管以交联形式存在)可通过细针注射。优选地，按多糖的总量计，未交联的多糖以1％至30wt％，更优选地5wt％至20wt％，甚至更优选地7wt％至15wt％，甚至更优选地8wt％至12wt％，甚至更优选地9wt％至11wt％，甚至更优选地约10wt％的量存在。还优选地，所述预形成的交联水凝胶另外包含局部麻醉剂，优选地利多卡因、多元醇(polyalcohols)(也称为多元醇(polyols))、维生素、碱金属和碱土金属盐、金属、抗氧化剂、氨基酸和陶瓷颗粒麻醉剂，优选利多卡因。优选地，按多醣的总重量计，局部麻醉剂以0.05wt％至2wt％，更优选地0.1wt％至1wt％，甚至更优选地0.1wt％至0.8wt％，甚至更优选地0.1wt％至0.6wt％，甚至更优选地0.1wt％至0.4wt％，甚至更优选地0.2wt％至0.4wt％，甚至更优选地约0.3wt％的量存在。优选地，多元醇以0.5wt％至5.0wt％，更优选地1.0wt％至3.0wt％，甚至更优选地1.5wt％至2.5wt％，甚至更优选地1.8wt％至2.2wt％，甚至更优选地约2.0wt％的量存在。多元醇优选地为甘露醇。
在第八方面，本发明涉及通过使本发明的改性的透明质酸衍生物与如上文所定义的第二多糖衍生物接触而获得的交联水凝胶，其中交联水凝胶优选地包含以下结构单元：
Figure BDA0003107557550000201
其中“Ac”表示-C(O)CH3并且R选自氢、碱金属离子(优选地Na)和碱土金属离子。
优选地，在第七和第八方面所述的交联水凝胶在1Hz下的储能模量为50至1000Pa，更优选地50至500Pa，甚至更优选地50至300Pa，甚至更优选地50至150Pa或150至300Pa。储能模量可借助于使用0.1至10Hz的频率扫描在25℃下在1Pa的振荡应力下进行的流变测量来确定。
根据一个实施例，接触是在原位即在患者体内执行。根据另一实施例，接触在体外，即在人体或动物体外，优选地在如上文所定义的缓冲介质中执行。优选地，缓冲介质位于人工容器中。
在第九方面，本发明涉及制备交联水凝胶的方法，优选地美学方法。方法包含以下步骤：a)提供包含本发明的改性的透明质酸衍生物的第一前体溶液，和与其分开的包含如上所述的第二多糖衍生物的第二前体溶液；b)将第一前体溶液和第二前体溶液混合成原位可交联混合物；和c)将原位可交联混合物注射到患者体内的目标部位上，以在目标部位处形成交联凝胶。
优选地，在步骤a)中提供的第一前体溶液和第二前体溶液为无菌的。
如本文所用的术语“已灭菌的”或“无菌”旨在是指热灭菌，特别是湿热灭菌(例如蒸汽灭菌)，并且优选地指代高压灭菌。高压灭菌可在120℃至132℃的温度下进行0.3分钟至20分钟，或在121℃至130℃下进行0.5分钟至10分钟，例如在121℃下进行0.5分钟至2分钟。
在步骤b)中获得的原位可交联混合物可易于通过细针以低注射力注射，并且提供例如皮肤改善、皮肤成形或良好的丰体效果。这有利地允许使用细针，这继而增强患者的舒适度(减少在注射时的疼痛，降低背压)，并且另外使得从业人员能够准确和安全地(无血管堵塞)将水凝胶注射到期望的目标部位，如皮肤的各层。
混合和注射可使用如下文所述的双筒注射器或任何其它合适的注射器系统来实现，其中第一和第二前体溶液在同时挤出和伴随的混合以及原位可交联混合物通过针(或插管)注射到患者体内之前在物理上分开。因此，共注射应尽可能快以避免原位可交联混合物沉积在体内目标部位处之前的初步交联。另一方面，凝胶化时间应相当短，以避免原位可交联混合物扩散到周围组织中。
因此，优选地，在步骤a)中第一和第二前体溶液存在于多筒注射器(优选地双筒注射器)的不同筒中，并且在从所述多筒注射器挤出期间发生步骤b)的混合。
如本文所用的术语“多筒注射器”旨在意指包含至少两个分开的筒并且可具有两个或更多个活塞的注射器。如本文所用的术语“双筒注射器系统”旨在意指任何系统或装置，通常为包含两个分开的筒并且可具有一个或两个活塞的注射器。另外，多筒(例如双筒)注射器系统通常包含端盖帽或针或插管(带或不带针护罩)，以便密封注射器系统的一个或多个端部。筒通常具有用于容纳足够的第一和第二前体溶液的储存容量。筒可由玻璃、塑料或任何其它合适的材料制造，并且可具有不同的几何形状、内径、材料组成、清晰度等。另外，多筒注射器系统可为其中一个注射器具有两个整体连接的注射器(即，两个整体连接的筒和用于从筒中分配内容物的单活塞或双活塞组件)形式的双筒注射器系统。而且，注射器系统可包括两个可拆卸地连接的筒和两个或一个可拆卸地连接的活塞。
另外，第一前体溶液和/或第二前体溶液可包含额外的物质，如细胞(包括干细胞和脂肪细胞)、脂肪、脂质、生长因子、细胞因子、药物和生物活性物质。更具体地，第一前体溶液和/或第二前体溶液可包含局部麻醉剂、多元醇(polyalcohols)(也称为多元醇(polyols))、维生素、碱金属和碱土金属盐、金属、抗氧化剂、氨基酸和陶瓷颗粒。
在本发明的上下文内，鉴于局部麻醉剂减轻注射时疼痛的能力，特别期望添加局部麻醉剂。示例性的局部麻醉剂包括但不限于氨布卡因(ambucaine)、阿莫拉酮(amolanone)、阿米洛卡因(amylocaine)、丁氧普鲁卡因(benoxinate)、苯佐卡因(benzocaine)、贝托卡因(betoxycaine)、苯柳胺酯(biphenamine)、布比卡因(bupivacaine)、布大卡因(butacaine)、氨苯丁酯(butamben)、布坦卡因(butanilicaine)、丁胺卡因(butethamine)、丁托西卡因(butoxycaine)、卡替卡因(carticaine)、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、可卡乙碱(cocaethylene)、可卡因(cocaine)、环美卡因(cyclomethycaine)、狄布卡因(dibucaine)、奎尼卡因(dimethisoquin)、二甲卡因(dimethocaine)、地哌冬(diperodon)、双环维林(dicyclomine)、脱水芽子碱(ecgonidine)、芽子碱(ecgonine)、乙基氯、依替卡因(etidocaine)、β-优卡因(beta-eucaine)、尤普罗辛(euprocin)、非那可明(fenalcomine)、福莫卡因(formocaine)、海克卡因(hexylcaine)、羟丁卡因(hydroxytetracaine)、对氨基苯甲酸异丁酯、甲磺酸亮卡因、左沙屈尔(levoxadrol)、利多卡因、马比佛卡因(mepivacaine)、美普卡因(meprylcaine)、美布卡因(metabutoxycaine)、甲基氯、麦替卡因(myrtecaine)、纳依卡因(naepaine)、辛卡因(octacaine)、奥索卡因(orthocaine)、奥昔卡因(oxethazaine)、对乙氧卡因(parethoxycaine)、非那卡因(phenacaine)、苯酚、哌罗卡因(piperocaine)、匹多卡因(piridocaine)、聚多卡醇(polidocanol)、普莫卡因(pramoxine)、丙胺卡因(prilocaine)、普鲁卡因(procaine)、丙泮卡因(propanocaine)、丙美卡因(proparacaine)、丙哌卡因(propipocaine)、丙氧卡因(propoxycaine)，假可卡因(pseudococaine)、吡咯卡因(pyrrocaine)、罗哌卡因(ropivacaine)、水杨醇、丁卡因(tetracaine)、托利卡因(tolycaine)、三甲卡因(trimecaine)、佐拉敏(zolamine)和其盐。
优选地，麻醉剂为利多卡因，如利多卡因HCl形式。第一和/或第二前体溶液的利多卡因浓度可为例如0.05wt％至8.0wt％、0.1wt％至4.0wt％、0.2wt％至3.0wt％、0.3wt％至2.0wt％，或0.4wt％至1.0wt％。
用于本文的合适的多元醇包括但不限于甘油、甘露醇、山梨醇、丙二醇、赤藓糖醇、木糖醇、麦芽糖醇和乳糖醇。特别适用于本文的是甘露醇和甘油。此外，多元醇优选地为二醇，任选地与一种或多种上述多元醇化合物，特别是甘露醇组合。合适的维生素包括维生素C、维生素E和B族的维生素(即B2、B3、B5、B6、B7、B9和B12维生素中的一者或多者。可存在维生素以刺激和维持细胞代谢，从而促进胶原蛋白的产生。这里特别优选使用的是维生素C、维生素E和维生素B6。用于软组织填充物组合物中的优选的盐为锌盐。陶瓷颗粒优选地是羟基磷灰石颗粒，例如羟基磷灰石钙(CaHA)颗粒。
可替代地，第一前体溶液由改性的透明质酸衍生物组成和/或第二前体溶液由第二多糖衍生物组成。
同样，第一前体溶液可由改性的透明质酸衍生物和水性缓冲溶液组成，和/或第二前体溶液可由第二多糖衍生物和水性缓冲溶液组成。
存在于第一前体溶液中的改性的透明质酸衍生物的量可为0.1wt％至5.0wt％，优选地0.5wt％至4.0wt％，更优选地1.0wt％至3.0wt％，并且最优选地1.5wt％至2.5wt％，并且存在于第二前体溶液中的第二多醣衍生物的量可为0.1wt％至5.0wt％，更优选地0.5wt％至4.0wt％，更优选地1.0wt％至3.0wt％，并且最优选地1.5wt％至2.5wt％。此外，共注射的改性的透明质酸衍生物和第二多糖衍生物的重量比优选地为15:85至85:15，更优选地30:70至70:30，并且最优选地40:60至60:40或50:50(改性的透明质酸衍生物:第二多糖衍生物)。
第一和第二前体溶液典型地具有0.001帕·秒至5.0帕·秒，特别是0.005帕·秒至3.0帕·秒，优选地0.01帕·秒至2.0帕·秒，更优选地0.1帕·秒至1.8帕·秒的低复数粘度，如在1Hz和25℃下通过振荡流变学测量确定的。此外，第一和第二前体溶液的特征在于低挤出力均可为0.01N至15N，优选地0.1N至10N，更优选地0.5N至7.5N，并且最优选地0.01N至50N或1.0N至5.0N，如使用标准的1.0ml玻璃注射器(BD Hypak SCF，1ml长的RF-PRTC，ISO 11040，内径为6.35mm)通过30G针(TSK实验室)在约0.21毫米/秒的挤出速率下所测量的。
当如上所述进行测量时，原位可交联混合物的复数粘度优选地为0.1帕·秒至100帕·秒，或0.1帕·秒至75帕·秒，或1.0帕·秒至75帕·秒，更优选为1帕·秒至50帕·秒或5帕·秒至50帕·秒。此外，当如上所述进行测量时，组合物的注射力优选地为0.01N至20N或0.01至10N，更优选地0.1N至10N，并且最优选地1.0N至5.0N。
进入患者体内的原位可交联混合物，即两种前体溶液的混合物，优选地含有总量为0.1wt％至5.0wt％的改性的透明质酸衍生物和第二多糖衍生物。
根据本发明，存在于液体组合物中的酰肼和醛官能化HA衍生物的总量优选地为0.1wt％至5.0wt％，特别是0.5wt％至4.0wt％，更优选地1.0wt％至3.0wt％，并且最优选地1.5wt％至2.5wt％。此外，酰肼官能化HA衍生物与醛官能化HA衍生物的改性比率优选地为15:85至75:25，更优选地25:75至60:40，特别优选地40:60至60:40，并且最优选地50:50。
注射的原位可交联混合物快速和有效地原位交联，从而在体内目标部位处形成共价交联水凝胶。不需要添加剂、不需要催化剂、不需要pH转换、不需要UV照射也不需要任何其它外部刺激(或“触发”)来引发交联反应。特别地，不使用或不需要交联剂。由交联反应产生的唯一副产物典型地为水，其容易被水凝胶和/或周围组织吸收。
此外，原位形成的交联水凝胶展现出良好的机械、化学和流变特性，以用作软组织填充物材料。特别地，其具有很高的形成体积的能力。同样，本发明的原位交联水凝胶具有长期的体内停留时间，同时仍是可生物降解的。另外，可期望的是其包括麻醉剂(例如利多卡因)和各种其它组分(例如细胞(包括干细胞和脂肪细胞)、脂肪、脂质、生长因子和维生素)。因此，本发明的原位可交联组合物特别适合用作美学目的的真皮填充物。
在第十方面，本发明涉及制备交联水凝胶的方法。应理解，方法在人体或动物体外执行。或者换句话说：通过所述方法制备的交联水凝胶为预形成的交联水凝胶。所述方法包含以下步骤：
步骤a)：提供如上文所定义的缓冲液。
步骤b)：向缓冲液中添加根据本发明(或根据本发明的方法制备)的改性的透明质酸衍生物并且添加如上文所定义的第二多糖衍生物。可以任何可能的顺序向缓冲液中同时或连续添加改性的透明质酸衍生物和第二多糖衍生物。任选地，可在步骤b)中向缓冲液中添加未交联的多糖，优选地透明质酸。未交联的多糖也可与改性的透明质酸衍生物和第二多糖衍生物中的任何一种同时或随后添加。
步骤c)：在缓冲液中使改性的透明质酸衍生物和第二多糖衍生物交联，从而制备交联凝胶。
步骤d)：任选地添加如上文所定义的未交联的多糖。
步骤e)：任选地对在步骤c)或d)中获得的水凝胶进行筛分和脱气。
步骤f)：任选地将在步骤c)、d)或e)中获得的水凝胶填充在容器，优选地注射器，更优选地即用型注射器中。
步骤g)：任选地对在步骤f)中获得的包含凝胶的容器进行灭菌。
优选地，步骤d)为方法的一部分。同样优选地，步骤e)、f)和g)为方法的一部分。更优选地，步骤d)、e)、f)和g)为方法的一部分。
与制备交联水凝胶的基于BDDE的方法相比，制备交联水凝胶的本发明的方法具有高度优势。特别地，本发明的方法显著地更简单并且更不易出错。这是因为，虽然用于制备水凝胶的基于BDDE的方法包含以下一般步骤：
1.HA溶解
2.添加BDDE
3.在高温下的交联反应
4.中和
5.填充到透析管中
6.针对缓冲液(例如PBS)进行透析
7.调节凝胶浓度和添加添加剂(例如润滑相、利多卡因等)
8.筛分和脱气
9.填充到注射器中
10.灭菌
本发明的方法仅包含以下一般步骤：
1.将两种组分溶解在缓冲液中
2.添加润滑相(如果有的话)
3.等待(仅在室温下进行交联反应)
4.筛分和脱气
5.填充到注射器中
6.灭菌。
因此，本发明的方法包含显著较少的工艺步骤数目，这使得本发明的步骤更简单、更快并且因此更便宜。此外，由于在本发明的方法中可避免借助于透析的相对容易出错的纯化，所以本发明的方法示出显著降低的污染风险。此外，由于在本发明的方法中不需要有害的BDDE，所以本发明的方法带来较少的健康和环境风险。
已经发现，可借助于改性的透明质酸衍生物(以及第二多糖衍生物)的改性度来微调凝胶的特性，特别是流变特性。此外，可借助于调节缓冲液中的聚合物浓度来微调凝胶的特性，特别是流变特性。通常，高聚合物浓度导致制备的交联水凝胶的高储能模量(G')。优选地，缓冲液中的本发明的改性的透明质酸衍生物的浓度为1g/L至40g/L，更优选地2g/L至30g/L，甚至更优选地5g/L至25g/L，甚至更优选地10g/L至25g/L，甚至更优选地12g/L至25g/L，甚至更优选地15g/L至25g/L。优选地，缓冲液中的第二多糖衍生物的浓度为1g/L至40g/L，更优选地2g/L至30g/L，甚至更优选地5g/L至25g/L，甚至更优选地10g/L至25g/L，甚至更优选地12g/L至25g/L，甚至更优选地15g/L至25g/L。
优选地，步骤c)中的交联执行1小时至24小时，更优选地2小时至20小时，甚至更优选地2小时至18小时，甚至更优选地2小时至16小时，甚至更优选地3小时至16小时，甚至更优选地4小时至15小时，甚至更优选地4小时至14小时，甚至更优选地5小时至12小时，甚至更优选地6小时至10小时，甚至更优选地7小时至9小时，甚至更优选地约8小时。
优选地，步骤c)中的交联在20℃至35℃，更优选地20℃至30℃，甚至更优选地20℃至25℃的温度下执行。
根据优选实施例，在步骤b)中添加未交联的多糖。根据另一个优选实施例，在步骤d)中添加未交联的多糖。根据另一个优选实施例，在步骤b)和d)中添加未交联的多糖。优选地，在步骤b)和/或步骤d)中添加未交联的多糖，使得其以按多糖的总量计1wt％至30wt％，更优选地5wt％至20wt％，甚至更优选地7wt％至15wt％，甚至更优选地8wt％至12wt％，甚至更优选地9wt％至11wt％，甚至更优选地约10wt％的最终浓度存在。
在第十一方面，本发明涉及用于原位形成交联水凝胶的试剂盒，其包含(i)含有如上所述的第一前体溶液的第一容器和(ii)含有如上所述的第二前体溶液的第二容器。
应理解，上述第一和第二前体溶液的各种实施例也适用于此方面。这包括例如第一和第二前体溶液优选地存在于多筒注射器，优选地双筒注射器的不同筒中。在不同筒中包含第一和第二前体溶液的多筒注射器的系统也可表示为“递送系统”。
试剂盒可另外包含使用说明书。
术语“容器”不受特别限制并且包括例如玻璃或塑料瓶、小瓶、卡普尔或任何其它密封容器。
“使用说明书”优选地为用于美学或治疗应用的说明书，特别是出于美学或治疗应用的目的替换或填充生物组织或增加生物组织的体积，如本文所定义或特别优选的是用作美学用途的真皮填充物的说明。
现在将通过以下非限制性实例另外说明本发明。
实例
化学物质
本发明的上下文中使用的化学物质获自以下供应商并且无需另外纯化即可使用：
Figure BDA0003107557550000271
设备
在本发明的上下文中使用以下实验室设备：
设备 描述
纯化水系统 ELIX 20
多样的实验室设备 天平、烧杯、搅拌器、移液管
真空烤箱 Memmert VO400
流变仪 Anton Paar Physica MCR 302流变仪
高压釜 Systec HX 150
合成本发明的醛改性的透明质酸衍生物的一般程序
称重甘油改性的HA(以粉末或纤维形式)，添加所需量的溶剂(纯化水或缓冲液)，并且搅拌混合物以便获得均匀的聚合物溶液。此后，添加氧化剂(高碘酸钠)，并且将溶液剧烈搅拌期望的时间量。为了终止反应，添加淬灭剂(例如邻二醇(1,2-二醇)，优选地乙二醇)，随后添加NaCI。通过将反应混合物倒入有机溶剂(例如乙醇或异丙醇)中进行纯化。收集沉淀物并且再次溶解在盐水中，随后在有机溶剂(例如乙醇)中进行第二次沉淀。收集产物，用有机溶剂(例如乙醇)冲洗，并且在真空下干燥一段时间(例如过夜)。
表征
1.分子量
通过使用尺寸排阻色谱法结合多角度光散射检测器、折射率检测器和粘度计来确定材料的分子量。通过在25℃下于4小时的时段内将2mg干燥的改性的HA溶解在10mL PBS缓冲液中来制备样品，得到0.2mg/mL的浓度。将样品溶液通过0.45μm过滤器过滤到1.8mL小瓶中进行色谱分析。之后，将50μL的此溶液注射到系统中(洗脱液PBS缓冲液，流速0.7毫升/分钟，柱温35℃)。示例性色谱在图1中示出。
2.改性度
通过使用1H NMR测量本发明的醛改性的透明质酸衍生物的改性度。即，首先将制备的醛改性的透明质酸衍生物用酪氨酸酰肼标记：将66mg的醛改性的透明质酸衍生物溶解在15mL水中，随后添加88mg的酪氨酸酰肼。反应进行20小时，并且然后添加150mg NaCI。反应混合物在75mL乙醇中沉淀。收集沉淀物并且将其溶解在盐水溶液(含150mg NaCI的15mL水)中。再次在乙醇中进行沉淀。收集固体并且在真空下干燥。此后，通过在40℃下用300单位的透明质酸酶消化20mg的材料过夜来处理标记的醛改性的透明质酸衍生物以用于1HNMR测量。此后，通过比较大约6.9ppm处的峰面积(酪氨酸酰肼的芳香族质子)和大约2.0ppm处的峰面积(聚合物主链中的-CH3质子)来确定MoD。酪氨酸标记的醛改性的透明质酸衍生物的示例性1H NMR光谱在图2中示出。
实例1(起始材料(甘油改性的HA)的浓度对醛改性的透明质酸衍生物的分子量和 MoD的影响)
根据上述一般程序执行反应。反应时间保持恒定在10分钟，施加0.1当量的NalO4并且反应在22℃下进行。甘油改性的HA的浓度不同。
在下表中示出甘油改性的HA对制备的材料的特性的影响：
实例 c(甘油改性的HA)/g L<sup>-1</sup> MoD/％ Mw/MDa
1.1 4 2.1 1.1
1.2 12 4.5 0.9
1.3 24 5.7 0.7
1.4 36 6.1 0.6
实例1.1
称重1.49g甘油改性的HA(干燥失重(LoD)为6.2％)，随后添加315g水，并且将混合物在22℃下搅拌16小时以获得均匀溶液。此后，添加溶解在35g水中的0.074g(0.35mmol)的高碘酸钠，并且将混合物在22℃下剧烈搅拌10分钟。为了终止氧化，快速添加3.9mL(69mmol)的乙二醇。此后，在搅拌下添加1.75g NaCI，直到获得均匀的混合物，并且溶液在1.75L的乙醇中沉淀。收集聚合物，将其置于新鲜皿中，添加1.75g NaCI，并且将其溶解在350mL水中。将均匀的混合物倒入1.75L的新鲜乙醇中，收集固体并且将产物在真空下干燥以获得白色纤维。材料特性：MoD为2.1％(mol/mol)，Mw为1.1MDa
实例1.4
称重13.4g甘油改性的HA(LoD为6.2％)，随后添加315g水，并且将混合物在22℃下搅拌16小时以获得均匀溶液。此后，添加溶解在35g水中的0.663g(3.1mmol)的高碘酸钠，并且将混合物在22℃下剧烈搅拌10分钟。为了终止氧化，快速添加34.7mL(620mmol)的乙二醇。此后，添加2800mL水和16g NaCI，搅拌直到获得均匀的混合物，并且将溶液在16lL的乙醇中沉淀。收集聚合物，将其置于新鲜皿中，添加16g NaCI，并且将其溶解在3000mL水中。将均匀的混合物倒入16L的新鲜乙醇中，收集固体并且将产物在真空下干燥以获得白色纤维。材料特性：MoD为6.1％(mol/mol)，Mw为0.6MDa
实例2(氧化剂(高碘酸钠)的量对醛改性的透明质酸衍生物的分子量和MoD的影 响)
根据上述一般程序执行反应。反应中甘油改性的HA的浓度保持恒定在12g/L，反应时间为10分钟，并且反应在室温下进行。唯一变化的参数为高碘酸钠的量。下表给出制备的材料的特性(示出的是按甘油改性的透明质酸的二糖重复单元的摩尔量计的NalO4的当量)：
实例 NalO<sub>4</sub>当量 MoD/％ Mw/MDa
2.1 0.05 2.9 1.0
2.2 0.1 4.5 0.9
2.3 0.15 5.9 0.8
2.4 0.2 6.8 0.6
实例2.1
称重4.48g甘油改性的HA(LoD为6.2％)，随后添加315g水，并且将混合物在22℃下搅拌16小时以获得均匀溶液。此后，添加溶解在35g水中的0.11g(0.51mmol)的高碘酸钠，并且将混合物在22℃下剧烈搅拌10分钟。为了终止氧化，添加11.6mL(207mmol)的乙二醇。此后，添加700mL水和5.25g NaCI，搅拌直到获得均匀的混合物，并且将溶液在5L的乙醇中沉淀。收集聚合物，将其置于新鲜皿中，添加5.25g NaCI，并且将其溶解在1000mL水中。将均匀的混合物倒入5L的新鲜乙醇中，收集固体并且将产物在真空下干燥以获得白色纤维。材料特性：MoD为2.9％(mol/mol)，Mw为1.0MDa
实例2.4
称重4.48g甘油改性的HA(LoD为6.2％)，随后添加315g水，并且将混合物在22℃下搅拌16小时以获得均匀溶液。此后，添加溶解在35g水中的0.44g(2.1mmol)的高碘酸钠，并且将混合物在22℃下剧烈搅拌10分钟。为了终止氧化，添加11.6mL(207mmol)的乙二醇。此后，添加700mL水和5.25g NaCI，搅拌直到获得均匀的混合物，并且将溶液在5L的乙醇中沉淀。收集聚合物，将其置于新鲜皿中，添加5.25g NaCI，并且将其溶解在1000mL水中。将均匀的混合物倒入5L的新鲜乙醇中，收集固体并且将产物在真空下干燥以获得白色纤维。材料特性：MoD为6.8％(mol/mol)，Mw为0.6MDa
实例3(反应时间对醛改性的透明质酸衍生物的分子量和MoD的影响)
根据上述一般程序执行反应。反应中甘油改性的HA的浓度保持恒定在12g/L，使用0.1当量的NalO4，并且反应在22℃下进行。唯一变化的参数为反应时间。下表中给定制备的材料的特性。
实例 反应时间/分钟 MoD/％ Mw/MDa
3.1 10 4.5 0.9
3.2 15 5.7 0.7
3.3 20 5.9 0.8
3.4 60 6.1 0.7
实例3.4
称量4.93g甘油改性的HA(LoD为6.2％)，随后添加345g水，并且将混合物在22℃下搅拌16小时以获得均匀溶液。此后，添加溶解在39g水中的0.22g(1.0mmol)的高碘酸钠，并且将混合物在22℃下剧烈搅拌60分钟。为了终止氧化，添加12.7mL(227mmol)的乙二醇。此后，添加770mL水和6g NaCI，搅拌直到获得均匀的混合物，并且将溶液在6L的乙醇中沉淀。收集聚合物，将其置于新鲜皿中，添加6g NaCI，并且将其溶解在1100mL水中。将均匀的混合物倒入6L的新鲜乙醇中，收集固体并且将产物在真空下干燥以获得白色纤维。材料特性：MoD为6.1％(mol/mol)，Mw为0.7MDa
实例4：醛改性的透明质酸衍生物在制备原位水凝胶中的应用
带有醛基的透明质酸可用于制备可原位交联的水凝胶。即，带有醛基(亲电子基团)的透明质酸钠盐可与带有亲核基团(例如酰肼基团)的多糖共价反应以形成原位交联凝胶。根据醛改性的透明质酸衍生物的改性度和分子量，可获得具有不同流变特性的凝胶。
为了检查制备的醛改性的透明质酸衍生物的凝胶性能，将材料溶解在水或缓冲液中，填充于玻璃注射器中并且灭菌。类似地，将酰肼改性的透明质酸钠盐也溶解在水或缓冲液中，填充于注射器中并且灭菌。此后，将两种溶液的内容物混合，并且使聚合物彼此交联(化学反应)。即，一种聚合物的酰肼基与另一种材料的醛基反应，并且凝胶通过形成腙键而形成(参见以下方案)。制备的凝胶在混合24小时后通过测量其流变特性来表征。储能模量(G')是在25℃下使用配备有锥板几何形状的流变仪(50mm直径，0.1°角，CP50-1，间隙尺寸0.1mm)测量的。使用0.1至10Hz的频率扫描在1Pa的应力下振荡样品，其中指示的值为1Hz。
Figure BDA0003107557550000311
实例4.1：
将醛改性的透明质酸衍生物(来自实例1.1的材料：MoD＝2.1％，Mw＝1.1MDa)溶解在3mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中，填充于玻璃注射器中并且进行蒸汽灭菌(127℃，6.5分钟)。将酰肼改性的透明质酸钠盐(MoD＝2.1％，Mw＝1.3MDa)溶解在3mM磷酸盐缓冲液(缓冲液中含有0.6wt％利多卡因并且pH为7)中，填充于玻璃注射器中并且进行蒸汽灭菌(127℃，6.5分钟)。此后，在空的玻璃注射器中称量0.6g的醛改性的透明质酸衍生物溶液，随后添加0.6g的酰肼改性的透明质酸钠盐溶液。注射器用活塞塞封闭，经由鲁尔锁连接器连接到空注射器，并且将内含物从一个注射器推到另一个注射器40次。此后，将具有内容物的注射器封闭，并且使交联在22℃下进行24小时。此后，测量凝胶的流变特性。凝胶的储能模量达到68Pa。
实例4.2：
将醛改性的透明质酸衍生物(来自实例2.1的材料：MoD＝2.9％，Mw＝1.0MDa)溶解在3mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中，填充于玻璃注射器中并且进行蒸汽灭菌(127℃，6.5分钟)。将酰肼改性的透明质酸钠盐(MoD＝2.1％，Mw＝1.3MDa)溶解在3mM磷酸盐缓冲液(缓冲液中含有0.6wt％利多卡因并且pH为7)中，填充于玻璃注射器中并且进行蒸汽灭菌(127℃，6.5分钟)。此后，在空的玻璃注射器中称量0.6g的醛改性的透明质酸衍生物溶液，随后添加0.6g的酰肼改性的透明质酸钠盐溶液。注射器用活塞塞封闭，经由鲁尔锁连接器连接到空注射器，并且将内含物从一个注射器推到另一个注射器40次。此后，将具有内容物的注射器封闭，并且使交联在22℃下进行24小时。此后，测量凝胶的流变特性。凝胶的储能模量达到164Pa。
实例4.3：
将醛改性的透明质酸衍生物(来自实例2.4的材料：MoD＝6.8％，Mw＝0.6MDa)溶解在3mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中，填充于玻璃注射器中并且进行蒸汽灭菌(127℃，6.5分钟)。将酰肼改性的透明质酸钠盐(MoD＝2.1％，Mw＝1.3MDa)溶解在3mM磷酸盐缓冲液(缓冲液中含有0.6wt％利多卡因并且pH为7)中，填充于玻璃注射器中并且进行蒸汽灭菌(127℃，6.5分钟)。此后，在空的玻璃注射器中称量0.6g的醛改性的透明质酸衍生物溶液，随后添加0.6g的酰肼改性的透明质酸钠盐溶液。注射器用活塞塞封闭，经由鲁尔锁连接器连接到空注射器，并且将内含物从一个注射器推到另一个注射器40次。此后，将具有内容物的注射器封闭，并且使交联在22℃下进行24小时。此后，测量凝胶的流变特性。凝胶的储能模量达到277Pa。
实例5(在氧化反应中使用甘油改性的HA的重要性)
已知可通过用高碘酸钠氧化将醛基引入碳水化合物的结构中。然而，此合成所需的反应时间很长，并且反应导致聚合物分子量的显著降低，因为在聚合物主链上发生氧化。为了避免这种情况，甘油改性的HA可用于氧化，因为未处理的甘油单元比HA主链的羟基更易于氧化。为了证实这一点，在相同条件下将天然HA和甘油改性的HA氧化，并且测试其性能。反应条件为：聚合物浓度：12g/L；反应温度：22℃和0.1当量高碘酸钠(关于透明质酸重复单元的数目)。下表中给定氧化的天然HA和氧化的甘油改性的HA的凝胶性能：
HA 反应时间/分钟 G'/Pa
甘油改性的HA 10 138.0
天然HA 10 0.3
甘油改性的HA 60 304.1
天然HA 60 0.2
结果表明，在用于甘油改性的HA氧化的温和条件下，天然HA不可产生在与酰肼改性的透明质酸溶液混合时可形成凝胶的材料。
实例6(预形成的水凝胶的制备)
制备两种浓度不同的凝胶[10mg/mL(实例6.1)；20mg/mL(实例6.2)]。
实例6.1
在Kenwood碗中称重2.5g酰肼改性的HA(平均分子量为1.5MDa，改性度为2.1％)和2.5g醛改性的HA(根据本发明制备；平均分子量为1.1MDa，改性度为4.3％)，随后添加450mL的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7，含有2wt％的甘露醇和0.3wt％的利多卡因)。将混合物搅拌8小时，然后在10mM磷酸盐缓冲液中添加50mL浓度为10mg/mL的含有非交联的HA的溶液，并且然后将所得产物填充到注射器中并且在127℃下灭菌6.5分钟。通过测量流变特性(灭菌前后)、挤出力(灭菌后)、pH和重量莫耳渗透浓度来表征凝胶。下表中示出获得的数据：
Figure BDA0003107557550000331
实例6.2
在Kenwood碗中称重5.0g酰肼改性的HA(平均分子量为1.5MDa，改性度为2.1％)和5.0g醛改性的HA(根据本发明制备；平均分子量为1.1MDa，改性度为4.3％)，随后添加450mL的10mM磷酸盐缓冲液(pH 7，含有2wt％的甘露醇和0.3wt％的利多卡因)。将混合物搅拌8小时，然后在10mM磷酸盐缓冲液中添加50mL浓度为20mg/mL的含有非交联的HA的溶液，并且然后将所得产物填充到注射器中并且在127℃下灭菌6.5分钟。通过测量流变特性(灭菌前后)、挤出力(灭菌后)、pH和重量莫耳渗透浓度来表征凝胶。下表中示出获得的数据：
Figure BDA0003107557550000341
如在实例6.1和6.2中可看出，可通过简单地修改聚合物浓度来微调所获得的水凝胶的特性。
实例7(根据本发明方法制备的凝胶的热稳定性)
为了测试根据本发明方法制备的预形成的凝胶的热稳定性，制备两种配制物并且将其置于40℃的烘箱中。在不同的时间点(0、3、6、9和12周)研究凝胶的流变特性。
凝胶1：
将0.45g酰肼改性的HA(分子量为1.8MDa，改性度为3.7％)溶解在含有0.6wt％利多卡因的盐水溶液中的注射器中。在第二注射器中，将0.45g醛改性的HA(根据本发明制备；分子量为1.2MDa，改性度为3.7％)溶解在30mL的25mM PBS缓冲液(其含有1.25g甘露醇)中。
经由鲁尔锁连接器连接含有HA酰肼溶液和HA醛溶液的注射器，并且充分混合其内容物。此后，将均匀的混合物填充于玻璃BD注射器中，并且在127℃下灭菌6.5分钟。将含有凝胶的注射器置于40℃下的烘箱中。
凝胶2：
将0.45g酰肼改性的HA(分子量为1.8MDa，改性度为3.7％)溶解在含有0.6wt％利多卡因的盐水溶液中的注射器中。在第二注射器中，将0.45g醛改性的HA(根据本发明制备；分子量为1.2MDa，改性度为3.7％)溶解在30mL的3mM PBS缓冲液(其不含甘露醇)中。
经由鲁尔锁连接器连接含有HA酰肼溶液和HA醛溶液的注射器，并且充分混合其内容物。此后，将混合物填充于玻璃注射器中，并且在127℃下灭菌6.5分钟。将含有凝胶的注射器置于40℃下的烘箱中。
结果示出于图3和4中。如可见的，两种凝胶均示出相似并且良好的热稳定性。

Claims (22)

1.一种改性的透明质酸衍生物，其中至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成具有结构-CH2-O-CH2-CHO的醛基。
2.根据权利要求1所述的改性的透明质酸衍生物，其中改性度为1.0％至20.0％，优选地1.0％至15.0％，更优选地1.0％至10.0％，更优选地1.5％至10.0％，更优选地1.5％至8.0％，更优选地1.8％至7.0％，更优选地2.0％至6.9％，所述改性度被定义为-CH2-O-CH2-CHO基团的数目除以存在于所述改性的透明质酸衍生物中的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的总数，和/或其中所述改性的透明质酸衍生物的重均分子量为0.1至2.5MDa，优选地0.2至1.5MDa，更优选地0.4至1.3MDa，甚至更优选地0.6至1.1MDa。
3.根据权利要求1或2所述的改性的透明质酸衍生物，其包含至少一个具有以下结构的二糖单元
Figure FDA0003107557540000011
其中R选自氢、碱金属离子(优选地Na)和碱土金属离子，和
任选地另外包含至少一个具有以下结构的二糖单元
Figure FDA0003107557540000012
其中R1、R2、R3和R4独立地选自H和-CH2-CHO，并且R5选自氢、碱金属离子(优选地Na)、碱土金属离子和-CH2-CHO，条件是R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为-CH2-CHO，并且如果R1为-CH2-CHO，那么R2、R3、R4和R5中的至少一个为-CH2-CHO。
4.一种用于制备根据权利要求1至3中任一项所述的改性的透明质酸衍生物的方法，其包含以下步骤：
a)提供甘油改性的透明质酸，其特征在于至少一个N-乙酰基-D-葡糖胺单元的-CH2-OH基团被改性成具有下式-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH的部分；
b)将所述甘油改性的透明质酸溶解在水性介质中以获得溶解的甘油改性的透明质酸；
c)使所述溶解的甘油改性的透明质酸与氧化剂，优选地高碘酸盐，更优选地高碘酸钠反应，以将所述-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH基团的至少一部分转化成具有式-CH2-O-CH2-CHO的醛基，从而获得醛改性的透明质酸衍生物。
5.根据权利要求4所述的方法，其另外包含以下步骤中的一个或多个：
d)任选地终止步骤c)的反应，优选地通过添加邻二醇(1,2-二醇)，更优选地乙二醇来进行终止；
e)任选地纯化所述改性的透明质酸衍生物，优选地通过在有机溶剂(优选地乙醇、异丙醇或其混合物)中沉淀所述改性的透明质酸衍生物，将沉淀物重新溶解在盐水中并且在所述有机溶剂中再沉淀所述改性的透明质酸衍生物来进行纯化；
f)任选地干燥在步骤e)中获得的所述改性的透明质酸衍生物。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述甘油改性的透明质酸的重均分子量为0.1至5.0MDa，优选地1.0至3.0，更优选地1.0至2.0MDa，甚至更优选地1.1至1.9，甚至更优选1.2至1.8MDa，甚至更优选地1.3至1.7MDa，甚至更优选1.4至1.6MDa和/或改性度为5至25％，优选地10至20％，所述改性度被定义为-CH2-O-CH2-CHOH-CH2OH基团的数目除以存在于所述甘油改性的透明质酸中的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的总数
和/或其中
(i)步骤c)在4至35℃，优选地15至35℃，更优选地20至30℃，甚至更优选地20至25℃，甚至更优选地约21至23℃，甚至更优选地约22℃的温度下执行；和/或
(ii)步骤c)执行5至120分钟，优选地5至65分钟，更优选地10至60分钟，甚至更优选地10至50分钟，甚至更优选地10至40分钟，甚至更优选地10至30分钟，甚至更优选10至20分钟的持续时间；和/或
(iii)按所述甘油改性的透明质酸的二糖重复单元的摩尔量计，所述氧化剂以0.01至0.5摩尔当量，优选地0.01至0.3摩尔当量，更优选地0.04至0.3摩尔当量，甚至更优选地0.04至0.1的量存在；和/或
(iv)所述甘油改性的透明质酸以2至50g/L，优选地2至40g/L，更优选地3至38g/L，更优选地4至36g/L的量存在。
7.一种通过根据权利要求4至6中任一项所述的方法获得的改性的透明质酸衍生物，其中所述改性的透明质酸衍生物优选地
i)改性度为1.0％至20.0％，优选地1.0％至15.0％，更优选地1.0％至10.0％，更优选地1.5％至10.0％，更优选地1.5％至8.0％，更优选地1.8％至7.0％，更优选地2.0％至6.9％，所述改性度被定义为-CH2-O-CH2-CHO基团的数目除以存在于所述改性的透明质酸衍生物中的N-乙酰基-D-葡糖胺单元的总数，和/或
ii)重均分子量为0.1至2.5MDa，优选地0.2至1.5MDa，更优选地0.4至1.3MDa，甚至更优选地0.6至1.1MDa，和/或
iii)包含至少一个具有以下结构的二糖单元
Figure FDA0003107557540000031
其中R选自H、碱金属离子(优选地Na)和碱土金属离子，和
任选地另外包含至少一个具有以下结构的二糖单元
Figure FDA0003107557540000032
其中R1、R2、R3和R4独立地选自H和-CH2-CHO，并且R5选自氢、碱金属离子(优选地Na)、碱土金属盐和-CH2-CHO，条件是R1、R2、R3、R4和R5中的至少一个为-CH2-CHO，并且如果R1为-CH2-CHO，那么R2、R3、R4和R5中的至少一个为-CH2-CHO。
8.一种根据权利要求1至3和7中任一项所述的改性的透明质酸衍生物的用途，其用于在美学应用中原位形成交联水凝胶，优选地用于医治皮肤的皱纹和细纹，包括眉间纹、鼻唇沟、下巴皱褶、木偶纹、下巴松弛、颊部连合、口周纹和鱼尾纹、皮肤凹陷、疤痕、太阳穴、眉毛的皮下支撑、颧颊脂肪垫、泪沟、鼻子、嘴唇、脸颊、下巴、口周区、眶下区和面部不对称。
9.一种根据权利要求1至3和7中任一项所述的改性的透明质酸衍生物的用途，其用于形成预形成的交联水凝胶。
10.一种根据权利要求1至3和7中任一项所述的改性的透明质酸衍生物，其用于原位形成交联水凝胶以用于治疗应用，优选地用于医治压力性尿失禁、阴道干燥、膀胱-输尿管反流、声带功能不全和声带内移。
11.根据权利要求8至9中任一项所述的用途或根据权利要求10所述的供使用的改性的透明质酸衍生物，其中所述改性的透明质酸衍生物与第二多糖衍生物一起使用，所述第二多糖衍生物包含能够与所述改性的透明质酸衍生物的一个或多个醛基形成共价键的一个或多个亲核官能团，其中所述第二多糖优选地为透明质酸衍生物，并且所述亲核官能团优选地为酰肼官能团，并且其中所述第二多糖更优选地为包含至少一个具有以下结构的二糖单元的透明质酸衍生物：
Figure FDA0003107557540000041
12.根据权利要求11所述的用途或根据权利要求11所述的供使用的改性的透明质酸衍生物，其中
(i)在将所述改性的透明质酸衍生物和所述第二多糖衍生物共注射到受试者体内的目标部位上时，所述改性的HA衍生物的所述醛基和所述第二多糖衍生物的所述亲核官能团自发形成共价键，从而在所述目标部位处形成交联水凝胶，或
(ii)在使所述改性的透明质酸衍生物与所述第二多糖衍生物接触时，所述改性的HA衍生物的所述醛基和所述第二多糖衍生物的所述亲核官能团自发形成共价键，其中优选地所述改性的HA衍生物和所述第二多糖衍生物存在于缓冲介质，优选地生理缓冲介质中。
13.一种交联水凝胶，其包含以下结构单元：
Figure FDA0003107557540000051
其中“Ac”表示-C(O)CH3并且R选自氢、碱金属离子(优选地Na)和碱土金属离子。
14.根据权利要求13所述的交联水凝胶，其中所述交联水凝胶为预形成的交联水凝胶。
15.根据权利要求14所述的交联水凝胶，其中所述交联水凝胶另外包含未交联的多糖，优选地透明质酸，和/或其中所述交联水凝胶另外包含麻醉剂，优选地利多卡因。
16.一种通过使根据权利要求1至3和7中任一项所述的改性的透明质酸衍生物与根据权利要求11所定义的第二多糖衍生物接触而获得的交联水凝胶，其中所述交联水凝胶优选地包含以下结构单元：
Figure FDA0003107557540000061
其中“Ac”表示-C(O)CH3并且R选自氢、碱金属离子(优选地Na)和碱土金属离子。
17.根据权利要求16所述的交联水凝胶，其中所述接触原位执行。
18.根据权利要求16所述的交联水凝胶，其中所述接触在体外执行，其中所述接触优选地在缓冲液，优选地生理缓冲液中执行。
19.一种制备交联水凝胶的方法，优选地美学方法，所述方法包含以下步骤：
a)提供包含根据权利要求1至3和7中任一项所述的改性的透明质酸衍生物的第一前体溶液，和与其分开的包含根据权利要求11所定义的第二多糖衍生物的第二前体溶液；
b)将所述第一前体溶液和所述第二前体溶液混合成原位可交联混合物；和
c)将所述原位可交联混合物注射到患者体内的目标部位上，以在所述目标部位处形成交联凝胶。
20.根据权利要求19所述的方法，其中在步骤a)中所述第一前体溶液和所述第二前体溶液存在于多筒注射器的不同筒中，并且在从所述多筒注射器中挤出期间发生步骤b)的混合。
21.一种制备交联水凝胶的方法，所述方法包含以下步骤：
a)提供缓冲液，优选地生理缓冲液；
b)向所述缓冲液中添加根据权利要求1至3和7中任一项所述的改性的透明质酸衍生物并且添加根据权利要求11所定义的第二多糖衍生物，并且任选地向所述缓冲液中添加未交联的多糖，优选地透明质酸；
c)在所述缓冲液中使所述改性的透明质酸衍生物和所述第二多糖衍生物交联，从而制备交联水凝胶；
d)任选地向在步骤c)中获得的所述交联水凝胶中添加未交联的多糖；
e)任选地对在步骤c)或d)中获得的水凝胶进行筛分和脱气；
f)任选地将在步骤c)、d)或e)中获得的所述水凝胶填充在容器，优选地注射器，更优选地即用型注射器中；
g)任选地对在步骤f)中获得的包含所述凝胶的所述容器进行灭菌。
22.一种用于原位形成交联水凝胶的试剂盒，其包含(i)含有包含根据权利要求1至3和7中任一项所述的改性的透明质酸衍生物的第一前体溶液的第一容器，和(ii)含有包含根据权利要求11所定义的第二多糖衍生物的第二前体溶液的第二容器，以及任选地(iii)使用说明书。
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