CN113504089A - 一种用于提取西红柿中过敏原的提取液及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于提取西红柿中过敏原的提取液及提取方法。所述提取液包括以下原料组分：pH值为7.0～8.0的PBS缓冲液、0.5～1.5mM的EDTA、3～8mM的L‑半胱氨酸、1X蛋白酶抑制剂、占所述的提取液的总质量的0.05％～0.2％的果胶酶。本发明的提取液能够从西红柿中提取出更多不同分子量的致敏原蛋白，尤其是小分子量的致敏原蛋白，获得的西红柿过敏原提取液透明度高、过敏原以外的杂质含量低，能够直接用于体外检测试剂盒，具有较高的生物学活性及阳性检出率，本底干净。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种用于提取西红柿中过敏原的提取液及提取方法。
背景技术
食物过敏是指当食用某种或某些食物时，产生的一种不良反应。常引起皮肤、消化道、呼吸道及心血管系统功能障碍或组织损伤，从而引发一系列的临床症状，严重的食物过敏反应甚至会危及生命和导致死亡。最常见的食入性过敏原为虾、芝麻、西红柿、芒果等。
西红柿体内蛋白质(过敏原)含量极低，加之富含糖类、多酚、果胶、蛋白酶、有机酸、色素及其他大量干扰物质，对过敏原的提取效果及使用性能影响很大，通过现有方法提取的西红柿过敏原无法直接用于体外检测试剂盒等。现有体外检测试剂盒使用的过敏原试剂通常为国外进口过敏原，采购成本高，货期较长，经电泳检测发现外购过敏原的有效条带含量少，并且缺少小分子量的过敏原组分，可能造成漏检。
目前未见针对西红柿过敏原而设计的专用提取液，新鲜水果中过敏原的提取通常采用PBS缓冲液，处理体系规模大，得到的过敏原粗提物浓度极低、含量少，尤其是小分子量的过敏原的提取率更低，用于检测时，检测结果准确度不高；提取液中可溶性固形物很难通过0.22μm滤膜，过滤操作费时费力，过滤后提取液有些许浑浊且无法通过离心等操作去除悬浮物质，透明度稍差，影响使用性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够从西红柿中提取出更多不同分子量的致敏原蛋白，尤其是小分子量(6～50kDa)的致敏原蛋白的提取液及提取方法，使用该提取液或提取方法获得的西红柿过敏原提取液透明度高、除过敏原以外的杂质含量低，能够直接用于体外检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面提供一种用于提取西红柿中过敏原的提取液，所述提取液包括以下原料组分：pH值为7.0～8.0的PBS缓冲液、0.5～1.5mM的EDTA、3～8mM的L-半胱氨酸、0.5～1.5mM蛋白酶抑制剂、占所述的提取液的总质量的0.05％～0.2％的果胶酶。
优选地，所述提取液包括以下原料组分：pH值为7.2～7.8的PBS缓冲液、0.8～1.2mM的EDTA、4～6mM的L-半胱氨酸、0.8～1.2mM蛋白酶抑制剂、占所述提取液的总质量的0.08％～0.15％的果胶酶。
优选地，所述PBS缓冲液的浓度为0.008～0.02mM，pH值为7.3～7.5。
优选地，所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟(PMSF)。
可将所述蛋白酶抑制剂配置成100mM浓度保存于-20℃条件下)。
本发明第二方面提供一种西红柿过敏原的提取方法，所述提取方法采用所述的提取液。
优选地，所述提取方法包括以下步骤：
(1)、将西红柿匀浆使用丙酮抽提2～4次，收集果肉残渣；
(2)、将步骤(1)中所得果肉残渣干燥得到西红柿干粉；
(3)、采用权利要求1至3中任一项所述的提取液对步骤(2)中所得西红柿干粉进行过敏原提取，提取结束后收集上清液；
(4)、步骤(3)中所得上清液经过滤、浓缩得到西红柿过敏原。
进一步优选地，所述提取方法还包括采用Bradford试剂盒测定步骤(4)中所得西红柿过敏原的浓度；采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对步骤(4)中所得西红柿过敏原进行组分分析鉴定。
进一步优选地，步骤(1)具体为：将所述西红柿匀浆加入丙酮中，于0℃～6℃下搅拌浸提0.3～1h，抽滤去除上层有机相，重复丙酮抽提2～4次，收集果肉残渣；
所述丙酮的总体积为所述西红柿匀浆体积的2.5～5倍；
所述丙酮在-30℃～-10℃下预冷，进一步优选在-25℃～-15℃下预冷。
进一步优选地，步骤(3)具体为：将步骤(2)所得西红柿干粉加入所述提取液中，于0～4℃下搅拌提取4～10h，离心收集上清液。
再进一步优选地，所述西红柿丙酮粉和所述提取液的投料比为1/40～1/20(g/mL)，更进一步优选为1/35～1/25(g/mL)。
进一步优选地，步骤(4)中所述过滤具体为将所述上清液首先通过0.45μm滤膜，然后通过0.22μm滤膜。
进一步优选地，步骤(4)中所述浓缩采用超滤浓缩，使用的超滤管截留分子量为2500～4000Da，离心条件为3000～5000r、0～4℃。
本发明第三方面提供一种采用所述的提取方法制备的西红柿过敏原在制备过敏原检测试剂中的应用。
发明人针对西红柿匀浆的成分，设计了专用于西红柿中过敏原提取的提取液配方，同时摸索了使用该提取液的提取工艺，相比现有的提取液及提取方法，能够从西红柿中提取出更多不同分子量的致敏原蛋白，尤其是小分子量(6～50kDa)的致敏原蛋白，且西红柿过敏原提取液透明度高、除过敏原以外的杂质含量低，能够直接用于体外检测试剂盒。此外，提取液原料易得、配制方便，提取工艺简单、易操作，从而降低了西红柿中过敏原的制备成本，进而能够降低体外检测试剂盒的成本，值得推广利用。
本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明的提取液能够从西红柿中提取出更多不同分子量的致敏原蛋白，尤其是小分子量(6～50kDa)的致敏原蛋白，获得的西红柿过敏原提取液透明度高，本底干净、过敏原以外的杂质含量低，能够直接用于体外检测试剂盒，具有较高的生物学活性及阳性检出率，无假阳测值干扰。
附图说明
附图1为实施例和对比例提取的西红柿过敏原的SDS-PAGE电泳图；Marker：一系列已知分子量的蛋白质混合物，用于指示分子量大小及位置、A：实施例1提取的西红柿过敏原；B：对比例1提取的西红柿过敏原；C：对比例2提取的西红柿过敏原；D：外购的西红柿过敏原。
附图2为根据BSA标准品测值获得的标准曲线。
附图3膜条包被过敏原检测原理示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明中具体实施例中，所使用的原料均可通过市售获得。丙酮使用前于-20℃下预冷，蛋白酶抑制剂配置成100mM浓度保存于-20℃条件下。
实施例1：
1.新鲜西红柿90g，用匀浆机均质成西红柿匀浆。
2.西红柿匀浆加入1倍体积丙酮，充分搅拌1h，抽滤去除上层有机相，重复丙酮抽提过程共3次，收集西红柿果肉残渣。
3.果肉残渣置于通风橱中常温晾干，得到西红柿丙酮粉0.8g。
4.将0.8g西红柿丙酮粉加入24mL提取液(0.01mM PBS(pH 7.4)、1mM EDTA、5mM L-半胱氨酸、1mM蛋白酶抑制剂PMSF、0.1％的果胶酶)；4℃搅拌约6h。
5.提取结束，离心收集上清。
6.将上清液依次通过0.45μm和0.22μm的滤膜过滤。过滤后的滤液无色、透明、澄清。
7.将过滤后的上清液进行超滤浓缩处理，超滤管截留分子量为3000Da，离心条件为4000r、4℃，获得西红柿过敏原浓缩液15mL。
8.采用Bradford试剂盒测定西红柿过敏原蛋白浓度。
根据Bradford试剂盒的说明书进行操作，BSA标准品测值见表1，根据BSA标准品测值获得标准曲线(横坐标为OD值，纵坐标为蛋白浓度)及换算公式，见图2，将待检蛋白的OD值代入公式，计算获得蛋白浓度，结果见表2。本实施例中，西红柿过敏原蛋白浓度为1.62mg/mL。
表1
| OD测值1 | OD测值2 | OD测值平均值 | BSA(mg/mL) |
| 0.164 | 0.166 | 0.165 | 0.0625 |
| 0.251 | 0.246 | 0.2485 | 0.125 |
| 0.392 | 0.395 | 0.3935 | 0.25 |
| 0.639 | 0.641 | 0.64 | 0.5 |
| 0.91 | 0.888 | 0.899 | 0.75 |
| 1.107 | 1.098 | 1.1025 | 1 |
| 1.505 | 1.474 | 1.4895 | 1.5 |
表2
9.SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)方法进行西红柿过敏原组分分析鉴定。电泳结果见图1(A)。
图1显示，实施例1(A)的条带最丰富，对比例1(B)次之，对比例2(C)的条带明显减少，说明实施例1的提取物种过敏原蛋白的种类最多，尤其是小分子量的过敏原蛋白(6～50kDa)。
图1(D)显示，外购西红柿过敏原的条带缺失严重，不适合作为血清样本西红柿过敏原检测试剂。
10.采用本实施例的西红柿过敏原检测血清样本的阴阳性符合度。
采用膜条包被过敏原检测血清样本，根据产品开发的市场要求规定，检测结果与Phaida金标准比对，阳性符合率需达到85％及以上。待检的血清样本通过phadia赋值，使用膜条包被制备的西红柿过敏原进行血清检测，与phadia同为阳性的血清个数除以phadia检测的总阳性血清数量为阳性符合率。
膜条包被过敏原检测血清样本：
检测原理见图2，将制备的西红柿过敏原通过划膜仪(点样仪)以条带装平行印制于硝化纤维膜上，经过封闭剂处理后，封闭纤维膜上的非特异位点，从而阻止非特异性反应的发生。检测时，膜条与稀释的血清样本共同温育使血清中的抗体与膜条上的抗原(西红柿过敏原)结合。利用酶标记抗人IgG检测此结合抗体。加入底物后，结合抗体上标记的酶催化底物反应，并在抗原包被的位置(检测线)产生可见的条带。根据条带是否显色，可判断受试者的抗体特性，如果明显显色判定为该抗体阳性，如果不显色则判定为阴性。
本实施例中，膜条包被过敏原检测血清样本测试结果与phadia金标准测值结果见表3。
表3
表3显示，Phadia检测阳性血清样本18个，这18个阳性血清样本中有17个使用膜条包被过敏原检测为阳性，有1个使用膜条包被过敏原检测为阴性，阳性符合率为94.44％；Phadia检测阴性血清样本7个，这7个阳性血清样本使用膜条包被过敏原均检测为阴性，阴性符合率为87.50％，出现1个假阴性。满足市场要求，因此实施例1的西红柿过敏原可作为快速检测试剂盒的试剂。
对比例1：
基本同实施例1，区别仅在于提取液的配方不同，配方为：0.01mM PBS(pH 7.4)、2mM EDTA、5mM L-半胱氨酸、1X蛋白酶抑制剂、0.1％的果胶酶。
采用Bradford试剂盒测定西红柿过敏原蛋白浓度，西红柿过敏原蛋白浓度见表2，本对比例中，西红柿过敏原蛋白浓度为1.35mg/mL。
SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)方法进行西红柿过敏原组分分析鉴定，电泳结果见图1(B)。由于提取液组分的配比不合适，提取的西红柿过敏原蛋白条带减少，主要是小分子量过敏原含量减少。
采用本对比例的西红柿过敏原检测血清样本的阴阳性符合度，结果见表4。
表4
表4显示，Phadia检测阳性血清样本18个，这18个阳性血清样本中有13个使用膜条包被过敏原检测为阳性，有5个使用膜条包被过敏原检测为阴性，阳性符合率为72.22％；Phadia检测阴性血清样本7个，这7个阳性血清样本中有6个使用膜条包被过敏原检测为阴性，有1个使用膜条包被过敏原检测为阳性，阴性符合率为85.71％，出现1个假阳性、5个假阴性。不能满足市场要求。
对比例2：
1.将180g新鲜西红柿匀浆，离心后倒去上清液，收集果肉沉淀32g。
2.加入提取液160mL，配方为0.01mM PBS(pH 7.4)、1mM蛋白酶抑制剂PMSF、0.1％的果胶酶，4℃搅拌约6h。
3.提取结束，离心收集上清。
4.将上清液依次通过0.45μm和0.22μm的滤膜过滤。
过滤后的滤液呈现微微的乳黄色且稍微有些浑浊，透明度相比实施例1和对比例1较差，通过离心等操作没有明显改善。
5.将过滤后的上清液进行超滤浓缩处理，超滤管截留分子量为3000Da，离心条件为4000r、4℃，获得西红柿过敏原浓缩液32mL。
6.采用Bradford试剂盒测定西红柿过敏原蛋白浓度，西红柿过敏原蛋白浓度见表2，本对比例中，西红柿过敏原蛋白浓度为0.8mg/mL。
7.SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)方法进行西红柿过敏原组分分析鉴定，电泳结果见图1(C)。由于提取方法及提取液配方不合适，小分子量过敏原蛋白及大分子量过敏原蛋白含量都显著降低，很多过敏原蛋白甚至未出现条带，即西红柿过敏原蛋白缺失严重。
8.采用本对比例的西红柿过敏原检测血清样本的阴阳性符合度，结果见表5。
表5
表5显示，Phadia检测阳性血清样本18个，这18个阳性血清样本中有7个使用膜条包被过敏原检测为阳性，有11个使用膜条包被过敏原检测为阴性，阳性符合率为38.89％；Phadia检测阴性血清样本7个，这7个阳性血清样本中有7个使用膜条包被过敏原检测为阴性，阴性符合率为100％，出现11个假阴性。不能满足市场要求。由于本对比例提取的西红柿过敏原缺失小分量过敏原组分，导致阳性样本漏检严重。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于提取西红柿中过敏原的提取液，其特征在于，所述提取液包括以下原料组分：pH值为7.0～8.0的PBS缓冲液、0.5～1.5mM的EDTA、3～8mM的L-半胱氨酸、0.5～2mM蛋白酶抑制剂、占所述提取液的总质量的0.05％～0.2％的果胶酶。
2.根据权利要求1所述的提取液，其特征在于，所述提取液包括以下原料组分：pH值为7.2～7.8的PBS缓冲液、0.8～1.2mM的EDTA、4～6mM的L-半胱氨酸、0.8～1.2mM蛋白酶抑制剂、占所述提取液的总质量的0.08％～0.15％的果胶酶。
3.根据权利要求1或2所述的提取液，其特征在于，所述的PBS缓冲液的浓度为0.008～0.02mM，pH值为7.3～7.5；所述蛋白酶抑制剂为苯甲基磺酰氟。
4.一种西红柿过敏原的提取方法，其特征在于，所述提取方法采用权利要求1至3中任一项所述的提取液。
5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：
(1)、将西红柿匀浆使用丙酮抽提2～4次，收集果肉残渣；
(2)、将步骤(1)中所得果肉残渣干燥得到西红柿干粉；
(3)、采用权利要求1至3中任一项所述的提取液对步骤(2)中所得西红柿干粉进行过敏原提取，提取结束后收集上清液；
(4)、步骤(3)中所得上清液经过滤、浓缩得到西红柿过敏原。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述提取方法还包括采用Bradford试剂盒测定步骤(4)中所得西红柿过敏原的浓度；采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对步骤(4)中所得西红柿过敏原进行组分分析鉴定。
7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)具体为：将所述西红柿匀浆加入丙酮中，于0℃～6℃下搅拌浸提0.3～1h，抽滤去除上层有机相，重复丙酮抽提2～4次，收集果肉残渣；
所述丙酮的总体积为所述西红柿匀浆体积的2.5～5倍；所述丙酮在-30℃～-10℃下预冷。
8.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)具体为：将步骤(2)所得西红柿干粉加入所述提取液中，于0～4℃下搅拌提取4～10h，离心收集上清液。
9.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述过滤具体为将所述上清液首先通过0.45μm滤膜，然后通过0.22μm滤膜；所述浓缩采用超滤浓缩，使用的超滤管截留分子量为2500～4000Da，离心条件为3000～5000r、0～4℃。
10.采用权利要求4至9中任一项所述的提取方法制备的西红柿过敏原在制备过敏原检测试剂中的应用。
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2021
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