CN113501888B - 一种类鼻疽菌多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

一种类鼻疽菌多糖及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种类鼻疽菌多糖，含有聚合交联的五糖重复单元[3‑(a‑D‑Manp‑1→3‑a‑D‑Manp)4‑2Me‑a‑L‑6dTalp‑1→]。本发明还提供了该类鼻疽菌多糖的制备方法及其应用。该多糖能够作为抗原与类鼻疽病人的血清发生特异性结合，而与健康捐赠者血清不发生反应，证明该多糖抗原能够识别类鼻疽病人血清中的特异性抗体，可用于制备类鼻疽菌感染诊断或防治的药物。

Description

一种类鼻疽菌多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程和生物医药技术领域，特别涉及一种类鼻疽菌多糖及其制备方法和应用。
背景技术
类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei，BP)简称类鼻疽菌，属兼性胞内革兰氏阴性菌，可存在于水源、土壤中，主要引起一种以肝、肺等脏器多发性脓肿为特点的类鼻疽疾病。该病主要分布在东南亚和澳大利亚北部，我国的海南、广东、台湾、香港等沿海城市和地区逐渐成为流行区。人和动物可通过皮肤擦伤、吸入或摄入等方式感染该菌，其临床表现多样，包括无症状感染、亚临床感染、重症败血症等，死亡率达40％左右，且复发率也较高(5％-28％)，并且由于其具有易传播、致病强，耐药广、无疫苗等特点，被WHO列为B类生物恐怖剂。
类鼻疽菌能够表达多种毒力因子，除III型分泌系统(typeIIIsecretion system，T3SS)、Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system，T6SS)和VirAG双组分调节系统外，其表面还存在丰富的多糖成分，如脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、荚膜多糖(capsularpolysaccharides，CPS)和胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)等也被证实是重要的毒力因子和保护性抗原，在类鼻疽菌致病以及免疫调节过程中发挥着重要的作用。现有技术文献的报道，是来自美国或泰国的类鼻疽临床分离株可表达多种不同的LPS抗原和CPS抗原，但截至目前，我国尚无关于类鼻疽菌临床分离株表面多糖的相关报道，对其多糖抗原类型及其生物学功能尚不清楚，因此，当前我国亟需建立分离类鼻疽菌表面多糖的方法，以促进进一步的研究。
发明内容
本发明提供了一种类鼻疽菌多糖的提取、纯化方法，并获得了类鼻疽临床菌株的多糖，利用多种化学分析法和仪器分析法对其结构进行了表征，并对其免疫学性质进行了初步研究。本发明，同时还鉴定出一种由五糖重复单元构成的多糖抗原可作为类鼻疽的血清学诊断和候选疫苗抗原方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明首先基于类鼻疽菌的国内标准株提取纯化提供了一种分子量分布均一、结构新颖的类鼻疽菌多糖，其含有聚合交联的五糖重复单元[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)4-2Me-a-L-6dTalp-1→]。
经纯化鉴定后，确定该胞外多糖的结构式为：
[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)4-2Me-a-L-6dTalp-1→]n，n＝100～700。
本发明进一步提供了类鼻疽菌多糖的制备方法，包括：
1)制备类鼻疽菌粗多糖，将所述类鼻疽菌粗多糖复溶于一级水中，获得粗多糖重溶液，然后将所述粗多糖重溶液通过离子交换层析柱线性梯度洗脱纯化，基于洗脱峰收集多糖洗脱液，再将所收集的多糖洗脱液经透析和冻干获得第一次纯化的多糖产物；
2)将所述第一次纯化的多糖产物复溶于一级水中，获得溶液，将所述第一次纯化的多糖产物溶液经分子筛层析进行纯化，基于洗脱峰收集对应的洗脱液，获得单组分多糖洗脱液，再将所述单组分多糖洗脱液透析和冻干，即得纯化的类鼻疽菌多糖。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤1)中，所述离子交换层析柱线性梯度洗脱是利用0～1.5M NaCl溶液进行线性梯度洗脱；
优选地，所述离子交换层析柱选自DEAE Sepharose Fast Flow或DEAE Cellulose或Q-Sepharose Fast Flow；
优选地，粗多糖重溶液浓度为5mg/mL～10mg/mL；
优选地，洗脱时使用的洗脱曲线是根据苯酚硫酸法绘制得到的。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤2)中，洗脱是通过以0.15M NaCl溶液为洗脱液，以0.15mL/min的流速的方法实现的；
优选地，所述第一次纯化的多糖产物溶液浓度为10mg/mL～20mg/mL；
优选地，所述分子筛层析选自Sepharose Cl-6B或Sephacryl S-400HR。
在根据本发明的一个实施方案中，所述类鼻菌粗多糖是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
a)将类鼻疽菌的灭活菌体以PBS缓冲液重悬，于37℃磁力搅拌1h，离心，取上清液，获得粗提液；优选地，将沉淀物再次以PBS缓冲液重悬，于37℃磁力搅拌1h，离心后，取重提上清液，并将重提上清液与初提上清液合并；所述类鼻疽菌为BPC006、BPC010、BPC018、BPC084、BPC158中的任一种；
b)向粗提液中加入核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶和蛋白溶解酶，以酶解粗提液中的核糖核酸、脱氧核糖核酸和蛋白质成分，将酶解后的粗提液加热至变性温度终止酶解，离心后取上清获得酶解液；
c)将所述酶解液转移至透析袋中进行透析处理后，经浓缩后冻干即得粗多糖。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤b)中所述脱氧核糖核酸酶为脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)；所述核糖核酸酶为核糖核酸酶A(RNaseA)；所述蛋白溶解酶为蛋白酶K(ProteinaseK)；
优选地，所述酶解是通过包括下述步骤的方法实现的：
先向粗提液中加入DNaseI和RNaseA，于37℃磁力搅拌2h，然后加入ProteinaseK，于60℃磁力搅拌3h，最后在80℃处理30min终止酶解；更优选地，核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶在酶解液中的终浓度分别为50μg/mL。
在根据本发明的一个实施方案中，步骤a)中所述类鼻疽菌的灭活菌体是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
将培养类鼻疽菌的菌液以8000rpm离心5min，弃上清，向菌体沉淀中加入PBS缓冲液重悬菌体，重悬菌液再次离心，弃上清，最后向菌体沉淀中加入PBS缓冲液，充分混匀后于70℃以上温度下水浴处理至少30min，使菌体灭活。
本发明还提供了上述类鼻菌多糖在制备用于诊断、预防或治疗类鼻疽菌感染的制剂中的应用。
本发明进一步提供了用于预防或治疗类鼻疽菌感染的药物组合物，其包含上述的类鼻菌多糖；
优选地，所述药物组合物还包含非特异性免疫增强剂，所述非特异性免疫增强剂选自氢氧化铝、明矾、磷酸铝、双链多聚肌苷酸、胞苷酸、双链多聚腺苷酸、花生油乳化佐剂、矿物油、植物油、羊毛脂、弗氏不完全佐剂或弗氏完全佐剂中的一种或多种；优选为弗氏完全佐剂。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
本发明首次基于我国的类鼻疽菌标准株及临床分离株分离获得了类鼻疽菌多糖，并提供了类鼻疽菌多糖的纯化方法，鉴定出含有聚合交联的五糖重复单元[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)4-2Me-a-L-6dTalp-1→]的多糖抗原。该多糖能够作为抗原与类鼻疽病人的血清发生特异性结合，而与健康捐赠者血清不发生反应，证明该多糖抗原能够识别类鼻疽病人血清中的特异性抗体，可用于制备类鼻疽菌感染诊断或防治的药物。
附图说明
图1为本申请BPC006-BPPI经离子交换层析纯化后的洗脱曲线图；
图2为本申请BPC006-BPPI-b经分子筛层析纯化后的洗脱曲线图；
图3为本申请BPC006-BPPI-b1的高效凝胶渗透色谱图；
图4为本申请BPC006-BPPI-b1的紫外全波长吸收光谱图；
图5为本申请BPC006-BPPI-b1的NMR谱图；其中，A为1H NMR；B为13C-NMR；C为TOCSY；D为HSQC；E为NOESY；F为HMBC；
图6为本申请检测抗BPC006-BPPI-b1多糖血清效价图；
图7为本申请BPC006-BPPI-b1多糖抗原与类鼻疽病人血清反应情况图；
图8为本申请Anti-BPC006-BPPI-b1(抗血清)与不同类鼻疽临床菌株交叉反应情况；
图9为本申请类鼻疽菌多糖的结构模式图。
具体实施方式
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1类鼻疽菌多糖的提取
1、菌体培养和灭活
将-80℃保存的类鼻疽菌BPC006(国内标准株)(类鼻疽菌来源于三亚人民医院，从患者血液、痰液、脓液和尿液中分离培养得到，经申请人鉴定为类鼻疽菌，测序结果已上传至NCBI数据库)采用三线法复苏于LB固体平板，在恒温培养箱培养48h后，挑取单菌落于400mL LB液体培养基中过夜增菌培养，次日，将菌液离心(8000rpm，5min)弃上清，向菌体沉淀中加入PBS缓冲液(0.01M，pH 7.4)重悬菌体后再次离心(8000rpm，5min)弃上清，最后向菌体沉淀中加入10mL PBS缓冲液，充分混匀后于70℃水浴处理30min使菌体灭活(取少量菌液涂布LB固体平板，培养48h乃至更长时间，发现平板上无细菌生长，说明菌体灭活处理成功)。
2、粗多糖提取
1)将灭活处理后的菌液转移至小烧杯中，同时加入10mL PBS缓冲液于37℃磁力搅拌1h，离心(12000rpm，10min)收集上清液，同时向菌体沉淀中加入20mL PBS缓冲液重悬菌体沉淀后于37℃磁力搅拌1h，离心(12000rpm，10min)收集上清液，最后，将两次所得的上清液合并(约40mL)进行后续的酶解处理步骤。
2)酶解：
首先向上述粗提液中加入DNaseI(美国Sigma)和RNaseA(美国Sigma)使其终浓度为50μg/mL，于37℃磁力搅拌2h，再加入ProteinaseK(美国Sigma)于60℃磁力搅拌3h，最后在80℃处理30min后冷却至室温进行离心(15000rpm，10min)处理。
3)透析：
将上清转移至透析袋(截留分子量为3500Da)(北京索莱宝)进行透析处理后，收集袋内液体经浓缩、冻干处理后得粗多糖(命名为BPC006-BPPI)。
实施例2类鼻疽菌多糖的纯化
首先称取上一步提取的粗多糖样品BPC006-BPPI溶于一级水(除气泡)中使其终浓度为7mg/mL，充分混匀离心(12000rpm，5min)后收集上清液利用离子交换层析柱(DEAESepharose Fast Flow)(美国GE公司)根据电荷差异对样品进行纯化，利用0～1.5M NaCl溶液进行线性梯度洗脱，收集洗脱液。根据苯酚硫酸法(400μL样品+400μL 6％苯酚溶液+2mL浓硫酸→A490)绘制洗脱曲线，收集各组分相应的洗脱峰，分别为BPC006-BPPI-a和BPC006-BPPI-b(图1)，洗脱液经透析、减压浓缩后冻干备用。
接着称取主要的多糖组分BPC006-BPPI-b溶于一级水中使其终浓度为10mg/mL，经离心收集上清液利用分子筛层析(Sepharose Cl-6B)(美国GE公司)根据分子量的差异进行纯化，利用0.15M NaCl溶液过夜洗脱，流速设定为0.15mL/min，收集洗脱液。采用苯酚-硫酸法测定并绘制洗脱曲线，收集主要的洗脱峰BPC006-BPPI-b1(图2)，经透析、浓缩后冻干备用，得到类鼻疽菌多糖BPC006-BPPI-b1，其类鼻疽菌多糖的结构模式图如图9所示。
进一步称取1～2mg洗脱峰处收集的多糖样品BPC006-BPPI-b1溶于NaCl溶液中，充分混匀后，离心取上清用0.45μm滤膜过滤后上TSK-gel G-4000PWXL(7.8×300mm，TOSOH，Japan)色谱柱，结合示差折射率检测器(RAD-10A)，测定纯化多糖抗原的均一性和分子量分布，结果表明只出现一个对称分布的色谱峰(图3)，说明纯化后的成分相对均一，经计算其分子量大小约为640kDa。同时，通过紫外全波长扫描(TU-1901，北京普析)，其结果发现在260nm、280nm处无特征性的紫外吸收峰，说明纯化后的多糖组分中不含核酸、蛋白等干扰成分。经苯酚-硫酸法测定，其糖含量为96.3％(图4)。
实施例3类鼻疽菌多糖的GC-MS分析
准确称取1mg BPC006-BPPI-b1多糖组分于干净的样品瓶中，加入1mL 2mol/L醇制标准滴定液(厦门海标科技有限公司)后充N2封管，在80℃进行甲醇解反应8h，待样品恢复至室温后用空气泵反复吹干，加入1mL 2mol/L三氟乙酸(TFA)(阿拉丁生化科技有限公司)，在120℃进行水解反应1h，待样品恢复至室温后反复加入无水乙醇蒸除残余的TFA。加入1mL20mg/mL的NaBH4(天津市科密欧化学试剂厂)溶液，在室温下搅拌还原8h，接着加入50μL50％乙酸调节pH至整个体系呈中性，然后加入阳离子交换树脂(上海麦克林生化科技有限公司)除去整个体系中的钠离子，室温下搅拌处理2h，过滤(除去树脂)，向滤液中反复加入无水甲醇用空气泵吹干以去除多余的硼酸。向样品中分别加入0.5mL无水吡啶(广东化学试剂开发中心)和乙酸酐(成都科隆化学品厂)，充N2封管，在100℃乙酰化反应2h，冷却至室温后反复加无水乙醇用空气泵吹干以去除多余的残留试剂。加入800μL二氯甲烷(成都科隆化学品厂)萃取样品瓶中的产物，萃取液过滤后进行GC-MS(Agilent Technologies 7890B-5977B，美国安捷伦)上机分析。仪器设置梯度升温程序为：80℃持续1min；5℃/min升温至210℃持续1min；10℃/min升温至260℃持续4min。
经GC-MS分析、整理数据后，发现BPC006-BPPI-b1主要由Man、6-deoxy-Hep，6-deoxy-Me-Tal，6-deoxy-Tal和Hep组成，其摩尔比为12.1：5.8：1.3：1.0：1.5，此外，还含有痕量Tal和Glc。
实施例4类鼻疽菌多糖的甲基化分析
1)称取10mg纯化后的多糖组分BPC006-BPPI-b1，加入1mL DMSO，充N2封管，室温下磁力搅拌30min使之充分溶解。
2)NaOH-DMSO混悬液的制备：取100μL NaOH溶液(50％)、200μL甲醇和6mL二甲亚砜(DMSO)(美国Sigma)，经混匀、离心、弃上清处理后，沉淀用6mL DMSO重悬再次离心处理(重复此步骤3次)，最后取2mL DMSO重悬后的液体于4℃保存。
3)取NaOH-DMSO混悬液加到样品溶液中，充N2封管，室温下磁力搅拌1h，然后在避光条件下逐滴加入2mL碘甲烷(美国Sigma)，冰浴条件下准确反应30min，再加入3mL蒸馏水终止反应，最后用自来水、一级水分别透析24h后再浓缩冻干。
4)重复步骤3)，加入等体积的二氯甲烷剧烈搅拌30min，待静置分层后，水层在上，二氯甲烷层在下，甲基化后的多糖易溶于二氯甲烷层，收集下层溶液置于干净的小瓶中(重复该步骤三次)，合并所得萃取液。再用蒸馏水反萃取二氯甲烷层三次，弃去水层(重复该步骤三次)，将最后所得的萃取液用空气泵吹干，加入1mL蒸馏水溶解甲基化后的产物，冻干备用。
5)甲基化后的BPC006-BPPI-b1产物进行红外光谱(美国安捷伦)分析，检测甲基化后的产物在3400cm-1处是否有明显的羟基吸收峰(多糖需两次甲基化，低分子量的寡糖一次甲基化后不透析，反应结束后直接萃取，一次甲基化后可以进行红外检测，若甲基化完全，则不需要进行第二次甲基化)。
6)甲基化多糖的水解、还原和乙酰化：向上述干燥的甲基化糖样中加入2mL混合酸(HCOOH：CF3COOH：H2O＝3：1：2)，充N2密封，100℃水解6h，然后用无水乙醇蒸除混合酸至pH＝7。加入35mg/mL NaBH4溶液1mL(现用现配)室温搅拌还原12h，加入约100μL 50％冰乙酸中和至中性，加入适量强酸型阳离子交换树脂，磁力搅拌2h，过滤(以除去树脂)，向滤液中加入甲醇蒸除硼酸。加乙酸酐、无水吡啶各0.5mL，N2密封，100℃反应2h，反复加无水乙醇蒸除乙酸酐，用800μL二氯甲烷溶解样品瓶中的产物后用滤器过滤后进行GC-MS上机分析。
红外光谱结果显示甲基化后的BPC006-BPPI-b1在3400cm-1处的羟基吸收峰消失，说明多糖被完全甲基化。接着，甲基化产物经混合酸水解、还原和乙酰化修饰后，进行GC-MS分析，结果如表1所示。BPC006-BPPI-b1中糖链的连接方式主要为1,3-连接的Manp(51.3％)、1,3-连接的6-deoxy-Hepp(24.7％)和1,3-连接的6-deoxy-Talp(12.4％)，此外，还存在少量的1,3-连接的Hepp(7.4％)和非还原末端Manp(4.1％)。
表1GC-MS分析BPC006-BPPI-b1的连接方式
Figure BDA0003133845230000101
实施例5类鼻疽多糖的NMR分析
称取20mg冻干的多糖样品BPC006-BPPI-b1溶于重水(美国Sigma)中(99.8％)使其终浓度为40mg/mL，进行1H-NMR、13C-NMR、TOCSY、HSQC、NOESY、HMBC和DEPT135核磁谱(BrukerAvance 600MHz spectrometer，Germany)测定。
通过1D/2D NMR对BPC006-BPPI-b1组分的结构特征进行深入分析。1H-NMR谱(图5中的A)中显示了较复杂的异头质子信号，其中6-deoxy-Talp、Manp和6-deoxy-Hepp的异头质子信号峰分别出现在5.23ppm、5.19ppm和4.88ppm。通过H-1的化学位移(δ>5.0)和JH-1,H-2<3Hz可以推断出6-deoxy-Talp和Manp为α-构型，而依据出现在4.88ppm的异头质子信号峰(JH-1,H-2～7.3Hz)，推断6-deoxy-Hepp为β-构型。通过1H-NMR谱还可以观察到从1.18ppm到4.10ppm范围内的其它糖环结构和修饰基团信号峰，其中O-CH3、O-acetyl和脱氧糖残基的亚甲基高场信号峰分别出现在3.35ppm、2.08ppm和1.18ppm，位于5.26ppm处的低场信号峰表明6-deoxy-Hepp的H-2被取代。接着，通过二维TOCSY谱(图5中的C)进一步归属BPC006-BPPI-b1组分的其他质子信号峰，包括1,3-Manp残基上H1～H6的质子信号峰(如H-1/H-2信号峰出现在5.19/4.20ppm，H-1/H-5信号峰出现在5.19/3.92ppm，H-2/H-4信号峰出现在4.20/3.91ppm，H-2/H-6b信号峰出现在4.20/3.69ppm)。对于1,3-连接的6-deoxy-Hepp糖残基，可以观察到H1～H7所有质子之间的连接方式，根据6-deoxy-Hepp的H2与O-acetyl的质子(H-2/CH 3CO信号峰出现在5.26/2.08ppm)之间存在的耦合关系来明确O-acetyl的取代位置，TOCSY谱(图5中的C)结果显示6-deoxy-Hepp的O-2有O-acetyl取代。对于1,3-连接的6-deoxy-Talp糖残基,一些明显的信号峰被检测到(如H-1/H-2信号峰出现在5.23/3.68ppm，H-1/H-5信号峰出现在5.23/4.30ppm，H-5/H-6信号峰出现在4.30/1.18ppm)。
接着对糖残基的C信号进行分析，首先在13C-NMR谱(图5中的B)中可以明显观察到1,3-连接的Manp、6-deoxy-Hepp和6-deoxy-Talp的异头碳信号峰分别出现在97.58ppm、94.95ppm和100.39ppm。分别位于80.84ppm和77.66ppm低场信号峰提示1,3-连接的Manp和6-deoxy-Hepp的C-3位被其他基团取代6-deoxy-Talp的C-6(methyl)信号峰出现在14.29ppm，O-CH3的碳信号峰出现在55.46ppm，O-acetyl的碳信号峰出现在19.10ppm(CH3CO)和172.38ppm(CH3 CO)。1,3-连接的Manp、6-deoxy-Talp和6-deoxy-Hepp的H-1/C-1～H-6/C-6和H-1/C-1～H-7/C-7通过HSQC依次进行归属(图5-D，表2)。综合以上分析结果，可以推测BPC006-BPPI-b1主要由α-1,3-Manp、α-1,3-6-deoxy-Talp和β-1,3-6-deoxy-Hepp构成。
为了明确重复单元中各种糖残基连接次序，继而进行了HMBC谱的分析(图5中的F，表4)，结果表明存在如下的耦合关系：(α-1,3-Manp)H-1/(α-1,3-Manp)C-3；(α-1,3-Manp)H-3/(α-1,3-Manp)C-1；(β-1,3-6-deoxy-Hepp)H-1/(β-1,3-6-deoxy-Hepp)C-3；(β-1,3-6-deoxy-Hepp)H-2/(OAc)C；(OAc)H/C；(α-1,3-6-deoxy-Talp)H-1/(α-1,3-6-deoxy-Talp)C-3；(O-CH3)H/(α-1,3-6-deoxy-Talp)C2；(α-1,3-6-deoxy-Talp)H-1/(α-1,3-Manp)C-3。在NOESY谱中(图5中的E，表3)，异头质子与残基连接处质子之间存在如下的耦合关系：(α-1,3-Manp)H1/(α-1,3-Manp)H3；(β-1,3-6-deoxy-Hepp)H1/(β-1,3-6-deoxy-Hepp)H3；(β-1,3-6-deoxy-Hepp)H2/(OAc)H；(α-1,3-6-deoxy-Talp)H1/(α-1,3-6-deoxy-Talp)H3；(α-1,3-6-deoxy-Talp)H2/(O-CH3)H；(α-1,3-6-deoxy-Talp)H1/(α-1,3-Manp)H3，综上所述，BPC006-BPPI-b1的主链由α-1,3-Manp和α-1,3-6-deoxy-Talp构成，其中部分6-deoxy-Talp的O-2位被甲基化。此外，根据甲基化的分析结果，BPC006-BPPI-b1中α-1,3-Manp和α-1,3-6-deoxy-Talp的摩尔比为4.14:1，据此推测主链由五糖重复单元[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)4-2Me-a-L-6dTalp-1→]构成。此外BPC006-BPPI-b1中还存在少量β-1,3-6-deoxy-Hepp，但是核磁结果中未观察到该结构与α-1,3-Manp和α-1,3-6-deoxy-Talp间存在耦合关系，推测其可能单独存在。
表2BPC006-BPPI-b1的HSQC谱化学位移
Figure BDA0003133845230000121
表3BPC006-BPPI-b1的NOESY谱化学位移
Figure BDA0003133845230000131
表4BPC006-BPPI-b1的HMBC谱化学位移
Figure BDA0003133845230000132
实施例6类鼻疽菌多糖抗原免疫原性研究
将纯化的多糖抗原BPC006-BPPI-b1与弗氏完全佐剂(F5881，美国Sigma)等体积混合并充分乳化后，皮下注射免疫小鼠(0.05mg/只)。初次免疫后第14、28天和35天分别进行第二次、第三次免疫和第四次免疫(初次实施免疫的时间记为第0天)，免疫完成后，采用眼球取血的方式收集小鼠全血，分离血清备用。多糖抗原抗血清效价检测(间接ELISA法)：将纯化后的多糖抗原BPC006-BPPI-b1以5μg/mL的浓度包被96孔板(美国Costa公司)于4℃过夜包被，5％BSA(广州赛国生物科技有限公司)溶液37℃封闭2h，加入小鼠的抗血清Anti-BPC006-BPPI-b1，同时以PBS组小鼠抗血清为对照，其抗体稀释度分别设置为1：1000，1：2000，1：4000，1：8000，1：16000和1：32000，在37℃反应1h，加入1：5000山羊抗小鼠二抗(赛默飞Invitrogen)，TMB(上海生工)显色后在450nm处检测其吸光度值。
采用间接ELISA法进行抗血清效价检测，结果表明多糖抗血清效价在1：32000左右(图6)，说明制备多糖抗原表现出较好的免疫原性。
实施例7类鼻疽菌多糖抗原免疫反应性研究
以纯化后的多糖抗原BPC006-BPPI-b1(6μg/mL)在4℃过夜包被96孔板，5％BSA溶液37℃封闭2h，加入1：2000稀释的23份临床血清样本(13份类鼻疽菌病人阳性血清、10份健康捐赠者血清，血清均来自海南省三亚市人民医院)于37℃反应1h，最后加入1：10000稀释的兔抗人二抗(博士德生物工程有限公司)，显色后在450nm处检测其吸光度值。
实验结果显示多糖抗原均能与类鼻疽病人的血清发生特异性结合，而与健康捐赠者血清不发生反应，二者差异极显著(图7)。上述结果说明多糖抗原能够识别类鼻疽病人血清中的特异性抗体，据此推测多糖抗原BPC006-BPPI-b1中最小的重复单元[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)4-2Me-a-L-6dTalp-1→]可作为类鼻疽血清学诊断的候选抗原靶标。
实施例8血清学交叉反应
将过夜培养的10株临床菌株(BPC003、BPC004、BPC006、BPC008、BPC010、BPC014、BPC016、BPC018、BPC084和BPC158)(收集自海南省三亚市人民医院)经超声破碎后收集上清液冻干后均以5μg/mL的浓度在4℃过夜包被，5％BSA溶液37℃封闭2h，加入1：800稀释的小鼠抗血清Anti-BPC006-BPPI-b1在37℃反应1h，加入1：5000山羊抗小鼠二抗在37℃反应1h，显色后在450nm处检测其吸光度值。
结果发现多糖抗原的抗血清可以与大部分临床菌株发生交叉反应(图8)，结合多糖抗原的结构特征以及血清学实验结果，推测[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)4-2Me-a-L-6dTalp-1→]重复单元是类鼻疽菌在不同临床菌株(除了BPC003和BPC016)中表现出抗原性的基本结构单元，也可称为表位，具有交叉反应性和潜在的免疫保护效果。
结论：本发明提供了一种由类鼻疽菌多糖的提纯、纯化以及结构鉴定等一系列方法，并同时通过对其免疫学性质进行研究，本申请所表征的[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)4-2Me-a-L-6dTalp-1→]抗原可能在类鼻疽菌的血清学诊断和疫苗开发方面都具有较大的应用价值。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (17)

1.一种类鼻疽菌多糖，其特征在于，含有聚合交联的五糖重复单元[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)4-2Me-a-L-6dTalp-1→]，其结构式为：
[3-(a-D-Manp-1→3-a-D-Manp)4-2Me-a-L-6dTalp-1→]n，所述n＝700，分子量为640KD。
2.如权利要求1所述的类鼻疽菌多糖的制备方法，其特征在于，包括：
1)制备类鼻疽菌粗多糖，将所述类鼻疽菌粗多糖复溶于一级水中，获得粗多糖重溶液，然后将所述粗多糖重溶液通过离子交换层析柱线性梯度洗脱纯化，基于洗脱峰获收集多糖洗脱液，再将所收集多糖洗脱液经透析和冻干获得第一次纯化的多糖产物；
2)将所述第一次纯化的多糖产物复溶于一级水中，获得溶液，将所述第一次纯化的多糖产物溶液经分子筛层析进行第二次纯化，基于洗脱峰收集对应的洗脱液，获得单组分多糖洗脱液，再将所述单组分多糖洗脱液透析和冻干，即得纯化后的类鼻疽菌多糖。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述离子交换层析柱线性梯度洗脱是利用0～1.5M NaCl溶液进行线性梯度洗脱。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述离子交换层析柱选自DEAESepharose Fast Flow或DEAE Cellulose或Q-Sepharose Fast Flow。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述粗多糖重溶液浓度为5mg/mL～10mg/mL。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：洗脱时使用的洗脱曲线是根据苯酚硫酸法绘制得到的。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，洗脱是通过以0.15M NaCl溶液为洗脱液，以0.15mL/min的流速的方法实现的。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述第一次纯化的多糖产物溶液浓度为10mg/mL～20mg/mL。
9.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述分子筛层析选自Sepharose Cl-6B或Sephacryl S-400HR。
10.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述类鼻菌粗多糖是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
a)将类鼻疽菌的灭活菌体以PBS缓冲液重悬，于37℃磁力搅拌1h，离心，取上清液，获得粗提液；所述类鼻疽菌为BPC006、BPC010、BPC018、BPC084、BPC158中的任一种；
b)向粗提液中加入核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶和蛋白溶解酶，以酶解粗提液中的核糖核酸、脱氧核糖核酸和蛋白质成分，将酶解后的粗提液加热至变性温度终止酶解，离心后取上清获得酶解液；
c)将所述酶解液转移至透析袋中进行透析处理后，经浓缩后冻干即得粗多糖。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤a)离心后，将沉淀物再次以PBS缓冲液重悬，于37℃磁力搅拌1h，离心后，取重提上清液，并将重提上清液与初提上清液合并。
12.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，
所述脱氧核糖核酸酶为DNaseI；所述核糖核酸酶为RNaseA；所述蛋白溶解酶为ProteinaseK。
13.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述酶解是通过包括下述步骤的方法实现的：
先向粗提液中加入DNaseI和RNaseA，于37℃磁力搅拌2h，然后加入ProteinaseK，于60℃磁力搅拌3h，最后在80℃处理30min终止酶解。
14.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶在酶解液中的终浓度分别为50μg/mL。
15.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述类鼻疽菌的灭活菌体是通过包括下述步骤的方法制备得到的：
将培养类鼻疽菌的菌液以8000rpm离心5min，弃上清，向菌体沉淀中加入PBS缓冲液重悬菌体，重悬菌液再次离心，弃上清，最后向菌体沉淀中加入PBS缓冲液，充分混匀后于70℃以上温度下水浴处理至少30min，使菌体灭活。
16.如权利要求1所述的类鼻菌多糖在制备用于诊断、预防或治疗类鼻疽菌感染的制剂中的应用。
17.一种用于预防或治疗类鼻疽菌感染的药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1所述的类鼻菌多糖。
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