CN113480445A - 一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂及其制备与应用，该抑制剂结构式为：

Description

一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用。
背景技术
神经氨酸酶是分布于流感病毒被膜上的一种糖蛋白，在病毒感染时水解宿主细胞表面的唾液酸与糖蛋白之间糖苷键，促使成熟的病毒从被感染的细胞表面释放出来从而继续感染新的细胞。同时可阻止子代病毒粒子从宿主细胞释放后发生凝聚，还可水解呼吸道黏膜中的唾液酸，从而阻止子代病毒颗粒灭活，促进病毒在呼吸道中的传播，在病毒的复制和感染周期中发挥了重要作用，因此神经氨酸酶是抗流感病毒药物研发设计的重要靶点之一。
目前，美国FDA批准的抗流感病毒的药物仅有6个，2个M2质子通道抑制剂(金刚烷胺和金刚烷乙胺)、3个神经氨酸酶抑制剂(扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦)和1个RNA依赖RNA聚合酶抑制剂(索夫鲁扎)。以神经氨酸酶为靶点开发的抗流感病毒药物根据结构可分为以下几类：环己烯类、环戊烷类、吡喃类、吡咯烷类、苯甲酸衍生物类以及天然提取物等。
近年来，由于神经氨酸酶抑制药物广泛应用于临床，己经有耐药病毒株出现，达菲由于是口服制剂，应用最为广泛，但病毒耐药性也最为严重，且达菲的生产原料极其昂贵，合成工艺复杂，而扎那米韦、帕拉米韦和拉尼米韦也有耐药病毒株开始出现。
专利CN112851633A公开一种2-氨基噻吩类神经氨酸酶抑制剂，专利CN112409231A公开一种酰基硫脲类神经氨酸酶抑制剂，具有神经氨酸酶抑制活性，然而，进一步开发新型、高效、安全的神经氨酸酶抑制剂仍是目前抗流感药物领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂及其制备方法与应用，该抑制剂结构新颖，实验表明具有良好的神经氨酸酶抑制活性，可用于制备抑制神经氨酸酶活性的药物。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂，所述抑制剂具有式(I)所示的结构：
Figure BDA0003186047610000021
其中，R1选自如下结构式中的任意一种：
Figure BDA0003186047610000022
Figure BDA0003186047610000023
(X＝F、Cl、Br或I)、
Figure BDA0003186047610000024
Figure BDA0003186047610000025
R2选自如下结构式中的任意一种：
Figure BDA0003186047610000031
Figure BDA0003186047610000032
(X＝F、Cl、Br或I)、
Figure BDA0003186047610000033
Figure BDA0003186047610000034
优选地，R1选自如下结构式中的任意一种：
Figure BDA0003186047610000035
R2选自如下结构式中的任意一种：
Figure BDA0003186047610000041
Figure BDA0003186047610000042
进一步优选，所述抑制剂具有如下结构：
Figure BDA0003186047610000043
一种如上所述的草酰胺类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，所述制备方法的方程式如下所示：
Figure BDA0003186047610000051
所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将取代的苯胺、草酰氯单乙酯、三乙胺和乙酸乙酯形成反应体系，反应后经后处理得到式(II)中间体；
(2)取步骤(1)得到的式(II)中间体溶于有机溶剂中，加入氢氧化钾形成反应体系，反应后得到式(III)中间体；
(3)取步骤(2)得到的式(III)中间体溶于有机溶剂中，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCl)形成反应体系，反应后经后处理得到式(I)所示的草酰胺类抑制剂。
步骤(1)中，采用三乙胺作为催化剂，所述有机溶剂采用乙酸乙酯。
步骤(1)中，所述反应体系置于温度为0-35℃，优选为25℃，反应的时间为4-12h，优选为6h。
步骤(1)中，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至3，再向反应液中加入150mL乙酸乙酯进行萃取分液操作，取有机相，再将有机相进行减压蒸馏得到式(Ⅱ)中间体的粗产物，柱层析得到纯净的式(Ⅱ)中间体。
步骤(1)中，所述取代苯胺、草酰氯单乙酯、三乙胺和有机溶剂的添加量比为(20-30)mmoL:(30-45)mmoL:(20-30)mmoL:(60-100)mL，优选为20mmoL:30mmoL:30mmmoL:80mL。
步骤(2)中，采用氢氧化钾进行水解，所述有机溶剂采用乙醇。
步骤(2)中，所述反应体系置于温度为0-40℃，优选为25℃，反应的时间为2-6h，优选为4h。
步骤(2)中，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至1，减压蒸馏除去溶剂得到式(Ⅱ)中间体的粗产物，从水中重结晶得到纯净的式(Ⅱ)中间体。
步骤(2)中，所述式(Ⅱ)中间体、氢氧化钾和有机溶剂的添加量比为(10-30)mmoL:(30-90)mmoL:(120-160)mL，优选为10mmoL:30mmoL：150mL。
步骤(3)中，所述有机溶剂采用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇和DMF，优选为DMF。
步骤(3)中，所述反应体系置于温度为15-35℃，优选为25℃，反应的时间为0.5-6h，优选为6h。
步骤(3)中，所述取代苯胺、式(Ⅲ)中间体、HOBt、EDCl和有机溶剂的添加量比为5mmoL：(6-7.5)mmoL：(10-12.5)mmoL：(17.5-20)mmoL：(20-50)mL，优选为5mmoL:7.5mmoL:10mmoL:17.5mmoL:50mL。
步骤(3)中，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，冷却至室温，过滤并用蒸馏水洗涤得到式(Ⅲ)中间体的粗产物，从95％含水乙醇中重结晶得到式(I)所示的抑制剂。
一种如上述所述的含有草酰胺类神经氨酸酶抑制剂在制备能够抑制神经氨酸酶活性的药物中的应用。
本发明利用基于受体的分子对接虚拟筛选方法，从ZINC数据库中筛选了600000个化合物，得到了理论上具有神经氨酸酶抑制活性的一个化合物，继而对其结构进行改造，设计出了更为合理的化合物，并对其中10个化合物进行了抑制神经氨酸酶活性测试，以奥司他韦酸(OSC)作为阳性对照，其中OSC的IC50值为0.10μM。
本发明所合成的如下两个化合物的IC50值都接近于0.10μM：
Figure BDA0003186047610000061
其中，抑制效果最好的化合物
Figure BDA0003186047610000062
其IC50值为0.09±0.02μM，低于阳性对照OSC的IC50值，具有非常优异的神经氨酸酶抑制活性。
与现有技术相比，本发明提供一种含有草酰胺基的新骨架结构的神经氨酸酶抑制剂及其制备方法和应用，合成了一系列含有草酰胺基和芳基的不对称化合物，分子结构简单，合成方法简便。而且草酰胺基的优点在于它易与配体形成很强的氢键，故制得的抑制剂具有优异的抑制神经氨酸酶活性效果。毒性测试实验表明抑制酶活性最好的化合物
Figure BDA0003186047610000071
和阳性对照OSC的CC50值均大于400μM，说明此系列化合物毒性较小，成药性好。。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，但绝不是对本发明的限制。
一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂，所述抑制剂具有式(I)所示的结构：
Figure BDA0003186047610000072
其中，R1选自
Figure BDA0003186047610000073
Figure BDA0003186047610000074
(X＝F、Cl、Br或I)、
Figure BDA0003186047610000075
Figure BDA0003186047610000076
Figure BDA0003186047610000081
Figure BDA0003186047610000082
中的任意一种；
R2选自
Figure BDA0003186047610000083
Figure BDA0003186047610000084
Figure BDA0003186047610000085
(X＝F、Cl、Br或I)、
Figure BDA0003186047610000086
Figure BDA0003186047610000087
Figure BDA0003186047610000091
Figure BDA0003186047610000092
中的任意一种。
上述的草酰胺类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，制备方法的方程式如下所示：
Figure BDA0003186047610000093
所述制备方法具体包括以下步骤：
(1)将取代的苯胺、草酰氯单乙酯、三乙胺和乙酸乙酯形成反应体系，反应后经后处理得到式(Ⅱ)中间体；
(2)取步骤(1)得到的式(Ⅱ)中间体溶于有机溶剂中，加入氢氧化钾形成反应体系，反应后得到式(Ⅲ)中间体；
(3)取步骤(2)得到的式(Ⅲ)中间体溶于有机溶剂中，加入1-羟基苯并三唑(HOBt)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCl)形成反应体系，反应后经后处理得到式(I)所示的草酰胺类抑制剂；
步骤(1)中，采用三乙胺作为催化剂，所述有机溶剂采用乙酸乙酯，所述反应体系置于温度为0-35℃，优选为25℃，反应的时间为4-12h，优选为6h，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至3，再向反应液中加入150mL乙酸乙酯进行萃取分液操作，取有机相，再将有机相进行减压蒸馏得到式(Ⅱ)中间体的粗产物，柱层析得到纯净的式(Ⅱ)中间体，所述取代苯胺、草酰氯单乙酯、三乙胺和有机溶剂的添加量比为(20-30)mmoL:(30-45)mmoL:(20-30)mmoL:(60-100)mL，优选为20mmoL:30mmoL:30mmmoL：80mL。
步骤(2)中，采用氢氧化钾进行水解，所述有机溶剂采用乙醇，所述反应体系置于温度为0-40℃，优选为25℃，反应的时间为2-6h，优选为4h，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至1，减压蒸馏除去溶剂得到式(Ⅱ)中间体的粗产物，从水中重结晶得到纯净的式(Ⅱ)中间体，所述式(Ⅱ)中间体、氢氧化钾和有机溶剂的添加量比为(10-30)mmoL:(30-90)mmoL:(120-160)mL，优选为10mmoL:30mmoL：150mL。
步骤(3)中，所述有机溶剂采用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇和DMF，优选为DMF，所述反应体系置于温度为15-35℃，优选为25℃，反应的时间为0.5-6h，优选为6h，所述取代苯胺、式(Ⅲ)中间体、HOBt、EDCl和有机溶剂的添加量比为5mmoL：(6-7.5)mmoL：(10-12.5)mmoL：(17.5-20)mmoL：(20-50)mL，优选为5mmoL:7.5mmoL:10mmoL:17.5mmoL:50mL，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，冷却至室温，过滤并用蒸馏水洗涤得到式(Ⅲ)中间体的粗产物，从95％含水乙醇中重结晶得到式(I)所示的抑制剂。
对制备得到的抑制剂进行抑制神经氨酸酶活性测试，具体测试方法如下：
1.实验仪器和材料
多功能荧光酶标仪，SP-Max 3500FL型，上海闪谱生物科技有限公司；
超净工作台；
Bond A3Pipette手动单道可调试移液器，0.5-10ul，10-100ul，100-1000ul泰坦科技；
96孔板(黑色)，灭菌，康宁；
H5N1神经氨酸酶，购自北京义翘神州科技股份有限公司；酶抑制实验中使用的荧光底物2’-(4-甲基伞形酮)-α-D-乙酰神经氨酸钠水合物(4-MUNANA)(Sigma，M8639)，购自Sigma公司；2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、氯化钙、氢氧化钠、无水乙醇，购自泰坦科技。
阳性对照药，奥司他韦酸(Oseltamivir carboxlate，简写为OSC)，上海贺康生物技术有限公司。
2.实验方法
将阳性对照药及实施例制备的目标化合物用DMSO溶解，初始浓度配制成1000μM/l，将其按照倍比稀释成6个浓度梯度，依次为200μM/l、40μM/l、8μM/l、1.6μM/l、0.32μM/l、0.064μM/l，每个浓度梯度依次配制三组；
2.1样品检测准备
a.缓冲液(33mM MES，4mM CaCl2)每孔加入70μL于96孔酶标板中；
b.神经氨酸酶每孔加入10μL；
c.每孔加入10μL配好浓度的待测神经氨酸酶抑制剂样品或阳性对照药样品，同时设置三组空白试验对照；
d.神经氨酸酶底物(100μM·L-1 4-MUNANA)每孔加入10μL。
2.2检测
a.将96孔板置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟；
b.温度设置为37摄氏度，孵育15分钟，使神经氨酸酶与待测样品充分混匀、相互作用；
c.取出96孔板，每孔再加入神经氨酸酶荧光底物10μL；
d.再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀1分钟；
e.于37摄氏度下孵育60分钟，取出，每孔加入150μL的终止液(14mM·L-1NaOH的83％乙醇水溶液)，再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀5分钟，激发波长设置为355nm，发射波长设置为460nm，孵育结束后开始荧光强度(RFU)测定；
f.重复上述操作步骤，做3组平行实验。
注：96孔板中的第一个孔作为空白组，不加待测样品，加入10微升DMSO溶液。
算出每次平行实验中每个梯度浓度下的样品的抑制率的平均值，再通过Origin拟合出相应IC50值。
将阳性对照药及目标化合物用DMSO溶液均配制成初始浓度1000μM/L的混合溶液，再将这两种混合溶液按照倍比稀释成6个浓度梯度，依次为200μM/l、40μM/l、8μM/l、1.6μM/l、0.32μM/l、0.064μM/l，每个浓度梯度依次配制三组。在96孔黑色荧光酶标板中加入神经氨酸酶缓冲液70μL，神经氨酸酶10μL，以及待测的每个梯度浓度的阳性对照药样品，同时设置三组空白试验对照。在多功能荧光酶标仪中震荡1分钟混匀，37℃孵育15min；取出96孔酶标板，每孔加入10μL的神经氨酸酶底物，震荡1分钟混匀，在37℃孵育60min后，取出，每孔加入150μL的终止液(14mM·L-1NaOH的83％乙醇水溶液)，再次置于多功能荧光酶标仪中，震荡混匀5分钟，激发波长设置为355nm，发射波长设置为460nm，孵育结束后开始荧光强度(RFU)测定。平行进行三次实验，算出每次平行实验中每个梯度浓度下的样品的抑制率的平均值，再通过Origin拟合出相应IC50值算出每个样品的抑制率，再通过Origin拟合出相应IC50值。
以下为具体示例：
实施例1
N1-(3-氯苄基)-N2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)草酰胺，其结构式如式I所示：
Figure BDA0003186047610000121
具体合成步骤如下：
(1)准确称取3-氯苄胺2.83g(20mmoL)于150ml圆底烧瓶中，加入4.17mL(30mmoL)三乙胺和80.00mL乙酸乙酯，然后在0℃下用恒压滴液漏斗向体系中缓慢滴加3.36mL(30mmoL)草酰氯单乙酯，置于室温25℃下搅拌反应6小时，反应结束后。在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至3，再向反应液中加入150mL乙酸乙酯进行萃取分液操作，取有机相，再将有机相进行减压蒸馏得到式(Ⅱ)中间体的粗产物，柱层析得到纯净的式(Ⅱ)中间体。
(2)准确称取式(Ⅱ)中间体2.42g(10mmoL)于250mL圆底烧瓶中，加入150mL乙醇，然后在0℃下将溶于5ml蒸馏水的氢氧化钾1.68g(30mmoL)溶液加入圆底烧瓶中，置于室温25℃下反应4小时。反应完毕后，在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至1，减压蒸馏除去溶剂得到式(Ⅱ)中间体的粗产物，从水中重结晶得到纯净的式(Ⅱ)中间体。
(3)准确称取取式(Ⅲ)中间体1.07g(5mmoL)、2-甲氧基-5-氨基苯酚1.04g(7.5mmoL)、HOBt 1.35g(10mmoL)和EDCl 3.35g(17.5mmoL)于100mL圆底烧瓶中，加入50mLDMF，在氮气保护下于25℃下搅拌6小时，反应结束后，在反应体系中加入100mL蒸馏水，冷却至室温，过滤并用蒸馏水洗涤得到式(Ⅲ)中间体的粗产物，从95％含水乙醇中重结晶得到式(I)所示的抑制剂。
实验结果
N1-(3-氯苄基)-N2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)草酰胺，为褐色固体，产率85％，其IC50值为0.09±0.02μM，熔点为172.4-173.4℃，阳性对照药的IC50值为0.10μM。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.39(s,1H),9.52(t,J＝6.4Hz,1H),9.07(s,1H),7.41–7.36(m,3H),7.34(dd,J＝6.5,1.7Hz,1H),7.29(d,J＝7.3Hz,1H),7.20(dd,J＝8.7,2.5Hz,1H),6.89(d,J＝8.8Hz,1H),4.40(d,J＝6.4Hz,2H),3.76(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ161.00,158.37,146.76,145.23,141.75,133.43,131.54,130.71,127.79,127.42,126.62,112.73,111.84,109.20,56.34,42.58.
实施例2
N1-(3-氯苄基)-N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)草酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
Figure BDA0003186047610000131
白色固体，产率81％，IC50值为0.24±0.11μM，熔点为215.5-215.7℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.55(s,1H),9.59(t,J＝6.4Hz,1H),7.42–7.29(m,6H),4.42(d,J＝6.4Hz,2H),3.77(s,6H),3.66(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ160.75,158.67,153.11,141.66,134.82,134.11,133.46,130.71,127.71,127.43,126.54,98.79,60.58,56.23,42.58.
实施例3
N1-(3-氯苄基)-N2-(3-氟苯乙基)草酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
Figure BDA0003186047610000141
白色固体，产率79％，IC50值为0.90±0.43μM，熔点为142.5-143.5℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.35(t,J＝6.4Hz,1H),8.85(t,J＝5.9Hz,1H),7.40–7.30(m,4H),7.22(d,J＝7.3Hz,1H),7.05(dt,J＝13.2,6.0Hz,3H),4.33(d,J＝6.5Hz,2H),3.43(dd,J＝13.6,6.9Hz,2H),2.84(t,J＝7.2Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ161.46,160.68,160.27,142.61,141.79,133.41,130.67,130.54,127.63,127.36,126.47,125.28,115.89,113.32,42.33,34.62.
实施例4
N1-(2-(苯并[d][1,3]二氧杂环-5-基)乙基)-N2-(3-氯苄基)草酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
Figure BDA0003186047610000142
白色固体，产率89％，IC50值为1.21±0.65μM，熔点为151.9-153.1℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.34(t,J＝6.4Hz,1H),8.76(t,J＝5.9Hz,1H),7.37–7.30(m,3H),7.23(d,J＝7.3Hz,1H),6.81(dd,J＝7.6,4.6Hz,2H),6.66(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),5.98(s,2H),4.33(d,J＝6.5Hz,2H),3.40–3.35(m,2H),2.73(t,J＝7.3Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ160.75,160.22,147.69,146.04,141.80,133.42,133.36,130.68,127.66,127.37,126.50,121.98,109.44,108.57,101.15,42.35,41.00,34.72.
实施例5
N1-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-N2-(2-甲氧基-5-甲基苯基)草酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
Figure BDA0003186047610000143
褐色固体，产率86％，IC50值为17.27±1.16μM，熔点为175.8-176.6℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.67(s,1H),9.86(s,1H),9.12(s,1H),8.05(s,1H),7.41(s,1H),7.26(d,J＝8.7Hz,1H),7.02(dd,J＝17.7,8.3Hz,2H),6.92(d,J＝8.7Hz,1H),3.89(s,3H),3.77(s,3H),2.30(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ158.17,157.89,147.40,146.79,145.48,131.29,129.96,128.06,125.98,120.56,112.65,112.09,111.59,109.40,56.32,21.08.
实施例6
N1-(3-氯苄基)-N2-(2-甲氧基-5-甲基苯基)草酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
Figure BDA0003186047610000151
淡黄色固体，产率78％，IC50值为7.43±1.60μM，熔点为168.0-169.2℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.75(s,1H),9.68(t,J＝6.4Hz,1H),8.02(d,J＝1.5Hz,1H),7.42–7.27(m,4H),6.99(dt,J＝8.4,5.0Hz,2H),4.41(d,J＝6.4Hz,2H),3.87(s,2H),2.28(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ160.53,157.52,147.30,141.46,133.46,130.73,129.95,127.81,127.50,126.66,125.91,120.50,111.53,56.53,42.80,21.03.
实施例7
N1-(3-氟苯乙基)-N2-(2-甲氧基-5-甲基苯基)草酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
Figure BDA0003186047610000152
白色固体，产率83％，IC50值为0.97±0.72μM，熔点为104.5-105.4℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.72(s,1H),9.13(t,J＝5.5Hz,1H),8.01(s,1H),7.35(dd,J＝14.7,7.5Hz,1H),7.11–6.93(m,5H),3.87(s,3H),3.47(dd,J＝13.6,6.8Hz,2H),2.88(t,J＝7.2Hz,2H),2.27(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ161.48,160.17,157.57,147.20,142.44,130.70,129.96,125.90,125.85,125.31,120.33,115.71,113.58,111.52,56.53,40.85,34.51,21.03.
实施例8
N1-(2-(苯并[d][1,3]二氧杂环-5-基)乙基)-N2-(2-甲氧基-5-甲基苯基)草酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
Figure BDA0003186047610000161
白色固体，产率88％，IC50值为2.91±1.85μM，熔点为141.5-142.4℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.73(s,1H),9.07(s,1H),7.99(d,J＝19.0Hz,1H),7.05–6.95(m,2H),6.83(d,J＝9.1Hz,2H),6.68(d,J＝7.9Hz,1H),5.98(s,2H),3.88(d,J＝11.3Hz,3H),3.42(s,2H),2.76(t,J＝7.0Hz,2H),2.29(d,J＝8.9Hz,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ160.09,157.58,147.66,147.17,146.05,133.23,129.97,125.89,125.83,122.05,120.30,111.48,109.47,108.63,101.15,56.49,41.41,34.58,21.01.
实施例9
N1-(4-硝基苯基)-N2-(3,4,5-三甲氧基苯基)草酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
Figure BDA0003186047610000162
白色固体，产率73％，IC50值为21.38±15.46μM，熔点为193.5-194.3℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.44(s,1H),10.85(s,1H),8.31(d,J＝9.1Hz,2H),8.16(d,J＝9.1Hz,2H),7.38(s,2H),3.79(s,6H),3.67(s,3H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ159.73,158.19,153.13,144.28,143.74,134.90,134.04,125.27,120.81,98.76,60.60,56.19.
实施例10
N1-(3-氯苄基)-N2-(4-硝基苯基)草酰胺，其结构式如下，采用类似实施例1的方法制备得到。
Figure BDA0003186047610000171
淡黄色固体，产率84％，IC50值为16.09±0.28μM，熔点为185.9-186.3℃。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.26(s,1H),9.70(t,J＝6.3Hz,1H),8.28(d,J＝9.2Hz,2H),8.13(d,J＝9.2Hz,2H),7.41(s,1H),7.38(d,J＝7.5Hz,1H),7.34(d,J＝6.6Hz,1H),7.30(d,J＝7.3Hz,1H),4.43(d,J＝6.4Hz,2H).13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ160.20,159.73,144.28,143.69,141.51,133.46,130.71,127.80,127.47,126.63,125.18,120.89,42.67.
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，该抑制剂具有式(I)所示的化学结构式：
Figure FDA0003186047600000011
其中，R1选自如下结构式中的任意一种：
Figure FDA0003186047600000012
R2选自如下结构式中的任意一种：
Figure FDA0003186047600000021
2.根据权利要求1所述的一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，R1选自如下结构式中的任意一种：
Figure FDA0003186047600000031
R2选自如下结构式中的任意一种：
Figure FDA0003186047600000032
Figure FDA0003186047600000033
3.根据权利要求1所述的一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂，其特征在于，所述抑制剂具有如下化学结构式中的一种：
Figure FDA0003186047600000034
4.一种如权利要求1-3任一项所述的草酰胺类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)将取代的苯胺、草酰氯单乙酯、三乙胺和乙酸乙酯形成反应体系，反应后经后处理得到式(Ⅱ)中间体；
(2)取步骤(1)得到的式(Ⅱ)中间体溶于有机溶剂中，加入氢氧化钾形成反应体系，反应后得到式(Ⅲ)中间体；
(3)取步骤(2)得到的式(Ⅲ)中间体溶于有机溶剂中，加入1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐形成反应体系，反应后经后处理得到式(I)所示的草酰胺类抑制剂；
所述制备方法的方程式如下所示：
Figure FDA0003186047600000041
5.根据权利要求4所述的一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，反应的温度为0-35℃，反应的时间为4-12h，采用三乙胺作为催化剂，所述有机溶剂采用乙酸乙酯；
所述取代的苯胺、草酰氯单乙酯、三乙胺和有机溶剂的添加量比为(20-30)mmoL:(30-45)mmoL:(20-30)mmoL:(60-100)mL。
6.根据权利要求5所述的一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至3，再向反应液中加入150mL乙酸乙酯进行萃取分液操作，取有机相，再将有机相进行减压蒸馏得到式(Ⅱ)中间体的粗产物，柱层析得到纯净的式(Ⅱ)中间体。
7.根据权利要求4所述的一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，反应的温度为0-40℃，反应的时间为2-6h，采用氢氧化钾进行水解，所述有机溶剂采用乙醇；
所述式(Ⅱ)中间体、氢氧化钾和有机溶剂的添加量比为(10-30)mmoL:(30-90)mmoL:(120-160)mL。
8.根据权利要求7所述的一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，用浓盐酸调节pH至1，减压蒸馏除去溶剂得到式(Ⅱ)中间体的粗产物，从水中重结晶得到纯净的式(Ⅱ)中间体。
9.根据权利要求4所述的一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，反应的温度为15-35℃，反应的时间为0.5-6h，所述有机溶剂采用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇和DMF；
所述取代苯胺、式(Ⅲ)中间体、HOBt、EDCl和有机溶剂的添加量比为5mmoL：(6-7.5)mmoL：(10-12.5)mmoL：(17.5-20)mmoL：(20-50)mL；
后处理的过程具体为：在反应体系中加入100mL蒸馏水，冷却至室温，过滤并用蒸馏水洗涤得到式(Ⅲ)中间体的粗产物，从95％含水乙醇中重结晶得到式(I)所示的抑制剂。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的一种草酰胺类神经氨酸酶抑制剂在制备能够抑制神经氨酸酶活性的药物中的应用。
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