CN113476402A - 一种多西他赛胶束纳米药物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多西他赛（DTX）胶束纳米药物及其制备方法与应用。将聚合物溶于低聚乙二醇，得到聚合物母液；将DTX溶于低聚乙二醇，得到DTX母液；再混合聚合物母液与DTX母液，得到DTX、聚合物、低聚乙二醇的混合溶液；将DTX、聚合物、低聚乙二醇的混合溶液与缓冲液混合，得到DTX胶束纳米药物。本发明装载化疗药制备的纳米药物和自由药相比，能增加自由疏水药物的溶解度，增加药物的循环时间，改变药物的生物分布，减少正常组织的富集等，在细胞内DTX能快速释放，具有长血液循环时间和高肿瘤富集量和深肿瘤穿透度，实现了对前列腺癌的靶向治疗和高效抑制。

Description

一种多西他赛胶束纳米药物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米药物，具体涉及多西他赛（DTX）胶束纳米药物及其制备方法与应用。
背景技术
目前，去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的治疗以化学疗法为主。但化疗药物总体上生物利用度低、毒副作用大、疗效不佳。纳米药物的蓬勃发展为CRPC的治疗提供了一个思路。但是，肿瘤治疗的药物递送面临着诸多障碍，包括血液循环时间不够长、肿瘤组织处富集量少、难以渗透到肿瘤组织的深处和难以被肿瘤细胞特异性内吞；研究人员研发了多种多功能药物递送系统来克服这些挑战。然而，设计复杂的多功能递送系统不仅使聚合物的合成耗时、难以质控，而且可能导致生物相容性差等问题，令实现临床转化举步维艰。迄今为止，基于聚乙二醇-聚D,L-丙交酯（PEG-PLA）嵌段共聚物的生物可降解的聚合物胶束是抗癌药物最主要的纳米递送系统之一。基于PEG-PLA的纳米药物Genexol-PM和Nanoxel-PM已进入临床，但需要指出的是，这些纳米药物在临床治疗中虽然降低了毒性，但患者生存期的延长未达到预期。可能原因是药物过早释放、肿瘤细胞摄取不足等。
发明内容
针对现有技术的问题和挑战，本发明设计了表面偶联靶向分子、基于两亲性聚合物的双硫交联、小尺寸DTX胶束纳米药物，并用于去势抵抗性前列腺癌CRPC的高效靶向治疗。比如，共聚物PEG-P(LA-DTC)、PEG-P(CL-DTC)或者PEG-P(TMC-DTC)通过可控开环聚合制备，和Nanoxel-PM的聚合物分子量相似，可得到小尺寸但有双硫交联的胶束，利用二硫戊环三亚甲基碳酸脂（DTC）自发形成双硫交联，稳定载多西紫杉醇（DTX），而在细胞内可被谷胱甘肽快速还原而释药，在荷人CRPC肿瘤的小鼠、前列腺癌病人PDX模型的治疗中均显示了令人惊喜的疗效。
本发明采用如下技术方案：
多西他赛（DTX）胶束纳米药物，将DTX、聚合物、低聚乙二醇的混合溶液与缓冲液混合，得到DTX胶束纳米药物；所述低聚乙二醇的分子量为200～600Da。
本发明中，所述低聚乙二醇的分子量（M n ）为200～600Da，优选300～500Da；聚合物的分子量为2000～15000Da，优选为3000～8000Da。本发明聚合物的分子量为核磁测定的数均分子量（M n ），单位为道尔顿（Da）。
本发明中，聚合物为非靶向聚合物，或者聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物；其中，非靶向聚合物为PEG-P(CL-DTC)、PEG-P(TMC-DTC)、PEG-P(LA-DTC)等；靶向聚合物为B-PEG-P(CL-DTC)、B-PEG-P(TMC-DTC)、B-PEG-P(LA-DTC)、B-PEG-PCL、B-PEG-PTMC或者B-PEG-PLA等，B为靶向分子，优选的，靶向分子为多肽，比如cRGD多肽、靶向促性腺激素释放激素的多肽(LHRH多肽)。聚合物中，PEG的分子量（M n ）为1000～6000 Da。
本发明中，将聚合物溶于低聚乙二醇，得到聚合物母液；将DTX溶于低聚乙二醇，得到DTX母液；再混合聚合物母液与DTX母液，得到DTX、聚合物、低聚乙二醇的混合溶液。优选的，25～70℃下，将DTX、聚合物、低聚乙二醇的混合溶液与缓冲液混合，得到DTX胶束纳米药物。进一步优选的，将DTX、聚合物、低聚乙二醇的混合溶液加入缓冲液中，低聚乙二醇的体积浓度不超过20 vol.%，DTX的浓度为1～100 mg/mL，聚合物的浓度为1～500 mg/mL；缓冲液为常规物质，可以为PB、Hepes、PBS等缓冲液，不影响技术效果的实现。
本发明中，聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物时，非靶向聚合物与靶向聚合物的摩尔比为（5～50）∶1。
本发明公开了上述DTX胶束纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用，该DTX胶束纳米药物为化疗药物，所述肿瘤为前列腺癌。
前列腺是男性生殖系统中的一个腺体，位于膀胱下方、直肠前方，如核桃般大小，前列腺癌是一种前列腺组织中形成恶性（癌症）细胞的疾病，早期不易察觉，一般发现时已经形成小且致密的肿瘤，导致一般纳米药物在肿瘤富集差、肿瘤细胞摄取少。本发明装载化疗药制备的纳米药物和现有纳米药相比，能增加疏水药物的溶解度，增加药物的循环时间，改变药物的生物分布，减少正常组织的富集等，设计的肿瘤主动靶向配体修饰的纳米药物，通过受体介导的内吞将药物递送到肿瘤细胞中，解决了药物在肿瘤富集差和肿瘤细胞摄取少的问题，设计了对肿瘤及肿瘤细胞内环境响应性化学交联，得到循环稳定的纳米药物，且在肿瘤及肿瘤细胞内的刺激下解除交联释放药物，延长循环时间并提高肿瘤细胞内的药物释放效率。
附图说明
图1为cRGD-MDTX的制备流程和结构以及靶向癌细胞；
图2为PEG-P(LA-DTC)（（CDCl3，400 MHz）A）、Mal-PEG-PLA（CDCl3，400 MHz）（B）和cRGD-PEG-PLA（DMSO-d 6，400 MHZ）（C）的1H NMR谱图；
图3为胶束形态和结构的测定通过TEM（A）和SLS（B）、（C）cRGD-Ms、Ms和ncMs的CMC；
图4为cRGD-MDTX和MDTX的理化特性。（A）粒径分布。（B）紫外光谱。PEG-P(LA-DTC)的DMF溶液（1.0 mg/mL）为对照组。在37oC（C）或在10% FBS存在24小时（D）时的粒径变化。在有或没有10 mM GSH的情况下，DTX的释放曲线（E）和粒径的变化（F）；
图5为 cRGD-MDTX的细胞摄取和毒性研究。（A）用Cy5-MDTX或不同cRGD密度的cRGD-/Cy5-MDTX孵育4小时后PC3细胞的FACS分析。（B）与cRGD/Cy5-MDTX或Cy5-MDTX孵育4小时时的PC3细胞的CLSM图。cRGD/Cy5-MDTX与cRGD预处理的PC3细胞孵育为对照。比例尺：75 μm。MTT法测定用自由DTX、MDTX或cRGD-MDTX处理的PC3（C）和MCF-7细胞（D）的存活率。（E）空胶束对PC3细胞的毒性。（F）FACS测定自由DTX、MDTX和cRGD-MDTX处理的PC3细胞的凋亡。E-F图：培养4小时后在新鲜培养基继续培养44小时；
图6为 cRGD-MDTX对PC3细胞的抑制微管蛋白研究（孵育4小时）。（A）与PBS、DTX、MDTX或cRGD-MDTX组细胞中微管蛋白的表达。（B）MDTX或cRGD-MDTX对细胞的微管组织的影响。比例尺：25 μm；
图7为cRGD-MDTX和MDTX在小鼠中的药代动力学、体内成像和生物分布（7.5 mg/kg）。（A）在健康小鼠中的药代动力学。（B）荷PC3肿瘤的裸鼠尾静脉注射cRGD/ Cy5-MDTX和Cy5-MDTX（7.5 mg DTX/kg，0.02 mg Cy5/kg）后的在体荧光图像。注射后24小时的小鼠主要器官和肿瘤的离体荧光图像（C）和荧光强度的半定量（D）。注射后24小时用HPLC测量的主要器官和肿瘤中的DTX生物分布（E）和肿瘤与正常组织（T/N）的比值（F）。（G）注射3小时和24小时后DTX的肿瘤蓄积量。ns，无显著性差异；**p ＜ 0.01；*** p ＜ 0.001；
图8为荷PC3小鼠尾静脉注射Cy5标记的cRGD-MDTX和MDTX的24小时后胶束肿瘤穿透研究。肿瘤的外缘区域（A）或中心区域（B）的CLSM图像。细胞核用DAPI染色（蓝色），血管用Alexa Flour 488标记的抗CD31抗体染色（绿色），胶束显示为红色。比例尺：75 μm；
图9为 荷PC3（A）和U87MG（B）肿瘤小鼠的肿瘤切片的马松染色图片，以及PC3肿瘤组织中α-SMA的免疫荧光表征。比例尺：100 μm；
图10为在荷PC3瘤小鼠中研究MDTX或含不同cRGD密度的cRGD-MDTX的抗肿瘤疗效（n = 5）。在第0、3、6和9天分别给药（7.5 mg DTX/kg，0.2 mL PBS）。ncMDTX、DTX和PBS用作对照。（A）肿瘤体积和（B）小鼠的相对体重随时间的变化。（C）在第14天各组的平均肿瘤抑制率（TIR）。（D）肿瘤切片的TUNEL染色。比例尺：50 μm。统计分析：单向方差分析和Tukey多重比较测试，ns无显著性差异，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001；
图11为在治疗第14天的小鼠主要脏器切片的H＆E染色图。（Ⅰ）PBS、（Ⅱ）自由DTX、（Ⅲ）ncMDTX、（Ⅳ）MDTX、（Ⅴ）2.5% cRGD-MDTX、（Ⅵ）5% cRGD-MDTX或（Ⅶ）10% cRGD-MDTX。比例尺：100 μm；
图12为在治疗第14天小鼠血清中的钙（A）和磷（B）的浓度。统计分析：单向方差分析和Tukey多重比较测试，*p < 0.05，**p < 0.01，****p < 0.0001；
图13为cRGD-MDTX对荷PDX皮下瘤小鼠的抗肿瘤活性。在第0、3、6、9天给药（7.5 mgDTX/kg，0.2 mL PBS）。肿瘤体积（A）和体重（B）的变化。统计分析：单向方差分析和Tukey多重比较测试，ns无显著性差异，**p < 0.01，***p < 0.001；
图14为 LHRH-MDTX对荷PC3皮下瘤小鼠的抗肿瘤研究。在第0、3、6、9天给药（7.5mg DTX/kg，0.2 mL PBS）。肿瘤体积（A）和体重（B）的变化。统计分析：单向方差分析和Tukey多重比较测试，*p < 0.05；
图15 为基于PEG-P(CL-DTC)的胶束cRGD-MS-DTX (A) 在小鼠前列腺癌PDX模型的治疗方案，(B)肿瘤体积监测，(C)体重监测；除最后一组为10 mg/kg外，其他DTX的剂量均为7.5 mg/kg。统计分析采用单向方差分析和Tukey多重比较测试。
图16为图15治疗中(A) PDX模型治疗第17天小鼠肿瘤的离体照片，(B)肿瘤抑制率(TIR)。统计分析采用单向方差分析和Tukey多重比较测试。
具体实施方式
单甲氧基聚乙二醇（PEG，M n = 2 kg/mol，TCI）经干燥甲苯共沸除水后使用；d,l-丙交酯（LA，> 99%，TCI）经干燥甲苯重结晶后使用；ε-己内酯（ε-CL, 99%，Alfa Aesar）经氢化钙干燥、减压蒸馏后使用；三亚甲基碳酸酯(TMC，济南岱罡)由干燥甲苯两次重结晶并储存于氮气手套箱待用；马来酰亚胺聚乙二醇（Mal-PEG，M n = 2 kg/mol，北京键凯科技有限公司）购得后直接使用。1,2-二硫戊环三亚甲基碳酸酯（DTC）为申请人已公开的化合物。多西紫杉醇（DTX，> 99%）从上海金和生物制药有限公司购得。1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯（DBU，> 97%）从Sigma Aldrich （USA）购买得到。cRGD环肽（cRGDfC，> 95%，强耀生物）、PEG350（低聚乙二醇，M n = 350 Da）、等均是购买后直接使用。血液中钙和磷检测试剂盒从南京建成生物工程研究所购买。β-tubulin抗体（CST，美国）、GAPDH抗体（Service bio，武汉）、山羊抗兔二抗（Service bio，武汉）、一抗α-tubulin抗体（Santa Cruz，美国）、Alexa-680标记的anti-rat IgG （Molecular Probes，美国）均购买后直接使用。人源前列腺癌PC3、非小细胞肺癌A549和卵巢癌SKOV-3均购自上海中科院细胞库。培养基为含有1%青霉素、链霉素（基诺生物）和10%胎牛血清（Gibco）的RPMI 1640（HyClone），并将细胞放在37ºC和5% CO2的3111型培养箱中单层培养。所有细胞均用含0.03%（w/v）乙二胺四乙酸（EDTA）的0.25%（w/v）胰蛋白酶消化，用L-420低速离心机在1000 rpm条件下离心3分钟。
核磁共振氢谱（1H NMR）用型号为Agilent DD2或Unity Inova 400的核磁共振波谱仪测定，氘代溶剂为氯仿（CDCl3）或二甲亚砜（DMSO-d6），化学位移以溶剂信号为标准。聚合物分子量和分子量分布由Waters 1515凝胶渗透色谱仪（GPC）测得，流动相为DMF，流速为0.8 mL/分钟，温度为40°C，标样为聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）。胶束粒径、粒径分布及表面Zeta电势使用配有633 nm波长的He-Ne激光光源和173o背散射检测器的ZetaSizer Nano-ZS纳米粒度仪（Malvern Instruments）在25oC下测定。胶束的结构用透射电镜（TEM，TecnaiG220，200 kv，美国）表征，在铜网上滴加10 μL的0.5 mg/mL纳米粒溶液，然后用1.0 wt.%的磷钨酸染色制备样品。使用不对称流场-流动分馏-UV-QELS（AF4-UV-QELS）技术在连接Shimadzu LC-2030 Prominence-i的Wyatt Dualtec AF4仪器上测定回转半径（Rg）。胶束在细胞的内吞和肿瘤中的分布使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM，Leica，德国）观察，细胞摄取和凋亡用BD FACSVerse流式细胞仪（Becton Dickinson，FACSVerse，美国）测得。DTX的浓度由高效液相色谱测得，流动相为乙腈/水（60/40），流速为1 mL/分钟，检测温度为30oC，检测波长为227 nm。活体成像使用IVIS® Lumina Ⅲ小动物活体成像系统测试。
参见图1，为本发明的一个具体技术方案，设计了表面偶联cRGD、基于PEG-P(LA-DTC)的双硫交联、小尺寸DTX胶束纳米药物（cRGD-MDTX），用于荷人CRPC小鼠的高效靶向治疗。
合成例 聚合物的合成为常规方法
PEG-P(LA-DTC)通过DTC和LA在无水DCM中以PEG为大分子引发剂、DBU为催化剂的开环聚合反应合成。例如，在氮气气氛下的手套箱中，将MeO-PEG-OH（0.4 g，200 μmol）、DTC（0.14 g，7.1 mmol）和LA（0.2 g，13.9 mmol）在DCM（10 mL）中搅拌至完全溶解。搅拌下加入DBU（30 mg，2 mmol），然后密封反应器后转移出手套箱，置于37℃油浴中反应3小时。然后将反应溶液逐滴加到20倍过量的冷无水乙醚中沉淀，离心后，再用乙腈溶解，沉淀，重复两次，得到的PEG-P(LA-DTC)真空干燥24小时得到淡黄色块状固体。产率：76%。聚合物通过1H NMR和GPC测量相对分子量和分子量分布。核磁特征峰如下：PEG：δ 3.6（-CH2CH2O-）和δ 3.3（CH3O-），LA：δ 1.5（CH3-）和δ 5.1（-COCHO-），DTC：δ 3.0（-SCH2C-）和δ 4.2（-OCH2C-）。
将MeO-PEG或Mal-PEG（0.1 g，50 μmol）、LA（0.1 g，6.9 mmol）和无水甲苯加到25mL密闭反应器中，之后加入Sn(Oct)2（50 μmol，16 μL）密封，在100℃油浴中搅拌反应过夜，沉淀过滤提纯方法同上，分别得到PEG-PLA和Mal-PEG-PLA。
靶向聚合物cRGD-PEG-PLA是将cRGD通过迈克尔加成反应偶联到Mal-PEG-PLA得到。将干燥DMF（2 mL）用氮气鼓泡10分钟，加入Mal-PEG-PLA（0.1 g，25 μmol）并在氮气下搅拌至完全溶解，然后将cRGD（23.1 mg，37.5 μmol）加入到聚合物溶液中密封，在37℃下反应24小时。将反应混合液在DMF中透析（MWCO 1000）4小时，DCM中透析24小时，然后在冷乙醚中沉淀，过滤、真空干燥，得到cRGD-PEG-PLA。
将cRGD更换为能靶向到促性腺激素释放激素(LHRH)受体的多肽（序列为：Pyr-HWSYk(c)LRP-NH2，>95％；小写k,c为D-型氨基酸，其中k的伯胺通过和c的羧基酰胺化反应连接在侧链，多肽的羧基乙胺封端。北京中科亚光生物科技有限公司）），得到LHRH-PEG-PLA。
PEG-P(CL-DTC) 嵌段共聚物的合成是以MeO-PEG-OH (M n = 2.0 kg/mol) 为大分子引发剂、磷酸二苯酯（DPP）为催化剂引发DTC和CL的开环聚合而得，仅引发CL开环则得到PEG-PCL；cRGD-PEG-P(TMC-DTC) 嵌段共聚物的合成是以Mal-PEG-OH为大分子引发剂、DPP为催化剂引发DTC和CL的开环聚合后与cRGD反应而得。PEG-P(TMC-DTC) 嵌段共聚物的合成是以MeO-PEG-OH (M n = 2.0 kg/mol) 为引发剂、DPP为催化剂引发DTC和TMC的开环聚合而得；cRGD-PEG-P(TMC-DTC) 嵌段共聚物的合成是以Mal-PEG-OH为引发剂、DPP为催化剂引发DTC和TMC的开环聚合后与cRGD反应而得。具体为现有技术，可参见CN2021106266013或其他现有文献。
图2为上述典型产物的核磁图，PEG-P(LA-DTC)的目标分子量为2.0-1.0-0.7 kg/mol，和Nanoxel-PM的聚合物分子量（PEG-PLA，2.0-1.7 kg/mol）相近，部分聚合物表征结果见表1，其中cRGD在聚合物的官能化度都为100%。
Figure 737194DEST_PATH_IMAGE001
a 根据1H NMR峰面积计算得到， b 由GPC测定。
Cy5标记的PEG-P(LA-DTC)合成分为两步。首先，在吡啶存在下，使PEG-P(LA-DTC)与NPC反应。最后，使PEG-P(LA-DTC)-NPC与Cy5-NH2反应过夜，得到Cy5标记的PEG-P(LA-DTC)，再在DMF和DCM透析（MWCO 1000）提纯目标靶向聚合物。
实施例一 DTX胶束纳米药物的制备和表征
将PEG2k-P(LA1k-DTC0.7k)、cRGD-PEG2k-PLA1.7k和DTX分别以200 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL的浓度溶解在PEG350中配置三种母液。然后按照设计比例混合均匀后，取0.05mL的混合溶液加热到60°C再注入到预热到60°C的0.95 mL磷酸缓冲液（PB，10 mM, pH 7.4）中，获得均一澄清的胶束溶液cRGD-MDTX，为表面偶联cRGD、基于PEG-P(LA-DTC)的双硫交联、小尺寸DTX胶束纳米药物。
通过改变三种母液的配比，可以得到一系列具有不同cRGD密度和DTX载药量的胶束。其中，cRGD-PEG-PLA和PEG-P(LA-DTC)按照摩尔比0/100、2.5/97.5、5/95、和10/90混合，可得到cRGD表面密度分别为0、2.5%、5%和10%的胶束。DTX载药量（DLC）为DTX的质量/（DTX的质量+聚合物的质量）×100。
以类似的方式制备无靶向胶束MDTX（不加cRGD-PEG-PLA）、空胶束cRGD-Ms（不加DTX）、无靶向空胶束Ms（不加cRGD-PEG-PLA、不加DTX）、不交联空胶束ncMs（用PEG-PLA代替PEG-P(LA-DTC)且不加cRGD-PEG-PLA、不加DTX）以及不交联胶束ncMDTX（用PEG-PLA代替PEG-P(LA-DTC)且不加cRGD-PEG-PLA）。
通过共混占总量10%的PEG-P(LA-DTC)-Cy5聚合物PEG350溶液（50 mg/mL）制备Cy5标记的胶束Cy5-MDTX、2.5% cRGD/Cy5-MDTX、5% cRGD/Cy5-MDTX和10% cRGD/Cy5-MDTX。
使用DLS测定胶束粒径、在含血清的培养基中或稀释到不同浓度的纳米粒粒径和粒径分布随时间的变化。CMC是以芘作为荧光探针，测定一系列浓度的聚合物胶束溶液中芘的荧光强度来确定的，聚合物浓度从1.0×10-4到1 mg/mL，每个样品中芘的浓度均为1.0 µM。通过分光光度计测定激发波长为330 nm的荧光样品。以373 nm和383 nm处荧光强度的比值为纵坐标，以胶束浓度为横坐标作图，图中低浓度区拐点处的浓度即为聚合物胶束的CMC值。为了确定胶束是否交联，利用紫外检测聚合物PEG-P(LA-DTC)的DMF溶液（1 mg/mL）和1mg/mL胶束的PB溶液，以跟踪其中双硫环的特征。参见图3，空胶束均具有22-27 nm的小而均匀的流体力学尺寸（PDI 0.05-0.11）。
cRGD-MDTX表现了出色的DTX负载能力和小而均匀的尺寸，其粒径和相应空胶束有小幅上升（表2）。图4为cRGD-MDTX和MDTX的理化特性，其UV光谱显示，PEG-P(LA-DTC)溶液中DTC的二硫戊环在330 nm处有显著吸收峰，而在cRGD-MDTX和MDTX的胶束中，该吸收峰显著下降（图4 B），也显示了胶束中发生了交联。此外，MDTX和cRGD-MDTX在37°C、PB中粒径至少稳定4天，且在含10% FBS中24小时后粒径都不会有大幅度的增加（图4 C，D）。相比之下，不含DTC的ncMDTX的尺寸在放置过程中有明显增大。根据Nanoxel-PM使用说明，Nanoxel-PM必须在重新溶解后4小时内使用，表明此制剂在4小时后的稳定性不能保证。文献中也有记载：Nanoxel-PM仅保证在6小时内DTX不会析出。本发明研制的cRGD-MDTX制剂的稳定性高，能防止胶束解离、DTX泄漏，利于在生理条件下维持纳米药物的小尺寸，是其能渗透入肿瘤深处和高效治疗肿瘤的关键。
Figure 123176DEST_PATH_IMAGE002
载药胶束的DTX释放实验在两种介质中进行：含0.5%吐温80的PB缓冲液（10 mM，pH7.4），以及相同溶液外加10 mM GSH。将0.5 mL的cRGD-MDTX（1.0 mg/mL，DTX的浓度为110 μg/mL）装入MWCO为3500 Da的释放袋中，并置于25 mL相应的释放介质中，放置在恒温摇床中（100 rpm，37℃）。在预先设定的时间点，各取5.0 mL介质，并补加相应体积的新鲜介质。取出的介质冷冻干燥后用0.1 mL乙腈复溶后，用HPLC测定DTX的浓度，计算药物的累计释放量。每组有三个平行样。
药物释放实验结果发现，在pH 7.4和37°C下，24小时内仅有约15%的DTX从cRGD-MDTX和MDTX中泄漏出来，而ncMDTX则有85%的DTX泄漏。当加入10 mM GSH时，cRGD-MDTX和MDTX会快速释放DTX，24小时释放约80%的DTX（图4 E），ncMDTX并没有因为GSH的加入释放更多DTX。重要的是，这种由细胞内浓度的GSH触发的可控解交联、及时释放比无响应性的药物靠扩散释放在肿瘤治疗更有利。
根据上述制备方法，将PEG2k-P(LA1k-DTC0.7k)、cRGD-PEG2k-PLA1.7k更换为表1其他的聚合物，得到的靶向DTX胶束（cRGD表面密度分别为2.5%、5%和10%）或者非靶向DTX胶束的粒径都在20～32nm，属于小尺寸纳米药物，载药量5～15%。
拓展实施例
将PEG2k-P(LA1k-DTC0.7k)和DTX分别以100 mg/mL和100 mg/mL的浓度溶解在PEG350中配置两种母液。然后按照DLC为15%的比例混合均匀后，取0.05 mL的混合溶液加热到60°C再注入到预热到60°C的0.95 mL磷酸缓冲液（PB，10 mM, pH 7.4）中，获得均一澄清的胶束溶液，为非靶向基于PEG-P(LA-DTC)的双硫交联、小尺寸DTX胶束纳米药物，测试粒径为29nm，PDI为0.2。
将PEG2k-P(LA1k-DTC0.7k)和DTX分别以200 mg/mL和100 mg/mL的浓度溶解在PEG350中配置两种母液。然后按照DLC为10%的比例混合均匀后，取0.05 mL的混合溶液加热到50°C再注入到预热到50°C的0.95 mL磷酸缓冲液（PB，10 mM, pH 7.4）中，获得均一澄清的胶束溶液，为非靶向基于PEG-P(LA-DTC)的双硫交联、小尺寸DTX胶束纳米药物，测试粒径为26nm，PDI为0.23。
将PEG2k-P(LA1k-DTC0.7k)和DTX分别以200 mg/mL和100 mg/mL的浓度溶解在PEG350中配置两种母液。然后按照DLC为10%的比例混合均匀得到混合溶液，取预热到60°C的0.95mL磷酸缓冲液（PB，10 mM, pH 7.4）注入到0.05 mL加热到60°C的混合溶液中，获得均一澄清的胶束溶液，为非靶向基于PEG-P(LA-DTC)的双硫交联、小尺寸DTX胶束纳米药物，测试粒径为23nm，PDI为0.10。
实施例二DTX胶束纳米药物的细胞摄取实验
选用PC3细胞。在流式细胞仪（FACS）测试中，首先将2 mL PC3细胞铺于6孔板中（3×105细胞/孔）培养24小时。加入200 µL的Cy5-MDTX、2.5% cRGD/Cy5-MDTX、5% cRGD/Cy5-MDTX或10% cRGD/Cy5-MDTX孵育4小时后，去除培养基和胶束。PBS洗涤后，加入0.25%（w/v）胰蛋白酶和0.03%（w/v）EDTA消化至单细胞悬液，细胞悬液在1000 rpm下离心3分钟，PBS洗2遍，最后将细胞悬浮于500 µL PBS中，用FACS检测细胞相关的Cy5的荧光强度。以MCF-7细胞作为阴性对照。在激光共聚焦显微镜（CLSM）测试中，将PC3细胞铺在含小圆盖玻片的24孔板里（3.0×105细胞/孔）培养24小时。随后加入200 µL的5% cRGD/Cy5-MDTX或Cy5-MDTX，继续培养4小时。除去培养液后用4%甲醛固定15分钟，然后DAPI染细胞核10分钟。每步之间用PBS洗3次。最后，用CLSM（TCS SP5）观察和拍摄。受体封闭实验中，用1 mg/mL cRGD预先和PC3细胞孵育4小时后再加入cRGD/Cy5-MDTX，后面处理相同。
FACS分析表明，有cRGD组的细胞荧光强度都高于无靶组，而含5% cRGD的cRGD/Cy5- MDTX有最强的细胞荧光强度（图5 A），是Cy5-MDTX的2.5倍，展现最好的增强内吞的能力。此外，CLSM图片显示，用cRGD/Cy5-MDTX组PC3细胞的细胞膜上和细胞质中Cy5的荧光强度显著高于MDTX组。用cRGD预处理PC3细胞会导致细胞结合的cRGD-MDTX的荧光明显下降，基本降至与MDTX相似的水平（图5 B），说明cRGD-MDTX能通过cRGD更多进入PC3细胞，具有主动靶向能力。
本发明用5% cRGD的cRGD-MDTX进行后续的细胞和动物实验。
实施例三 体外细胞毒性和细胞凋亡研究
PC3细胞以每孔2×103个细胞的密度接种在96孔板中培养24小时。之后加入20 μL一系列浓度的cRGD-MDTX、MDTX或自由DTX孵育4小时后，除去该含药物的培养基，用新鲜培养基替换继续培养44小时。然后加10 μL MTT的PBS溶液（5 mg/mL）培养4小时。除去培养基，加150 μL DMSO孵育15分钟以溶解活细胞产生的甲瓒。使用酶标仪测量在570 nm的吸光度。仅含DMSO的对照孔的吸光度用作背景信号，通过将样品吸光度与PBS组吸光度比较来确定相对细胞存活率。空胶束cRGD-Ms和Ms的毒性的评估方法相同。
为了评估cRGD-MDTX诱导PC3细胞凋亡的能力，将PC3细胞以5×104细胞/孔的密度接种在24孔板中并培养过夜。加含cRGD-MDTX、MDTX或自由DTX（30 ng/mL）培养4小时，随后弃培养基，加入新鲜培养基培养44小时。PBS处理的细胞作为阴性对照组。用不含EDTA的胰酶消化，收集细胞并重悬于200 μL结合缓冲液中。之后，加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI避光染色15分钟。单阳性对照：单早期凋亡阳性组是将1 mL细胞液均分为两份，一份不动，一份置于50℃水浴锅中煮5~10分钟；单晚期凋亡阳性组是将1 mL细胞液均分为两份，一份不动，一份加入300 μL 4%甲醛处理5分钟，最后两份混匀制得，最后使用流式细胞仪检测。
进一步通过MTT和FACS测试研究了cRGD-MDTX和MDTX对PC3细胞的毒性。MTT结果表明，cRGD-MDTX组显现出三组中最高的细胞毒性，对PC3细胞的半致死浓度（IC50）为29 ngDTX/mL，分别比自由DTX和MDTX低1.5倍和2.0倍（图5 C）。但是在MCF-7细胞中，cRGD-MDTX和MDTX有类似的毒性，均低于自由DTX组（图5 D）。空cRGD-Ms和Ms组细胞有近100%的细胞存活率（图5 E），说明胶束本身无毒，具有良好的生物相容性。
用流式细胞仪分析了cRGD-MDTX和MDTX对细胞凋亡的影响，结果显示，其他条件相同情况下，cRGD-MDTX诱导大量PC3细胞凋亡，无论是早期还是晚期凋亡都明显多于MDTX和自由DTX组（图5 F），和MTT实验结果相符合。
以上结果证实了cRGD-MDTX进入PC3细胞递送DTX，更高效引起细胞凋亡。
对于前列腺癌细胞LNCaP和22RV1，MDTX也有一定毒性，同样方法测试的IC50别为2.5 和 0.15 μg DTX/mL。
实施例四 细胞微管的抑制研究
DTX对细胞微管的抑制作用通过western blot和免疫荧光法研究。在westernblot实验中，将1.8 mL PC3细胞铺板在6孔板（5×105细胞/孔）中培养24小时后，加入200 μL的cRGD-MDTX、MDTX或自由DTX（DTX浓度为2 μg/mL）孵育4小时后，将培养基替换为2 mL新鲜培养基再孵育44小时。之后用RIPA裂解液裂解细胞，在冰上孵育15分钟，以12000 rpm的速度离心15分钟，收集上清液，并用BCA蛋白试剂盒测定蛋白质浓度用于统一加样量。然后，往蛋白样品中加入溴酚蓝煮沸5分钟使蛋白质变性，加到SDS-PAGE凝胶上进行电泳。凝胶转移至PVDF膜后，将该膜放在含5%脱脂奶粉的封闭溶液中室温孵育1小时。最后，分别加入β-tubulin抗体和GAPDH抗体4ºC孵育过夜。随后加山羊抗兔二抗孵育90分钟。该膜用Tris缓冲盐水/0.1% Tween-20洗涤，最后显影。WB实验结果表明，自由DTX组PC3细胞的微管蛋白条带很浅，MDTX组并未展现出比自由DTX更强的蛋白抑制效果，而用cRGD-MDTX处理的PC3细胞内的β微管蛋白含量显著更低，基本可忽略不计（图6A），这是因为和cRGD-MDTX或自由DTX孵育后，PC3细胞内微管蛋白几乎全部为聚集体的形式，导致呈现自由α微管蛋白的分子量处无条带。免疫荧光图像显示，与MDTX组PC3细胞内较分散的微管（红色）相比，cRGD-MDTX组的PC3细胞核周围聚集的很亮的微管明显增加（图6 B），显示了细胞核周围DTX对微管解聚的作用的体现增加。荧光半定量分析发现，cRGD-MDTX和MDTX组细胞内荧光强度有显著性差异（图6C），此外cRGD-MDTX组产生微管聚集的细胞比例约为74%，远高于MDTX组的36%（图6 D）。因此，cRGD-MDTX可促进自由微管蛋白聚合，并阻止微管解聚，从而抑制有丝分裂，导致细胞调亡。
动物模型
所有的动物操作均获得苏州大学伦理委员会的批准。用PC3细胞（1.2×107/只）在雄性裸鼠（17-21 g，6周，维通利华）的右侧近肋骨皮下接种得到荷PC3皮下瘤小鼠。病人来源的肿瘤异种移植模型（Patient-derived tumor xenograft，PDX）中病人是来自苏州大学附一院的一位初诊、随访前列腺癌患者（57岁，PSMA阴性，非恶性和转移性），瘤块的获取经病人知情同意。前列腺癌病人PDX肿瘤建模方法：通过将手术切除的病人前列腺癌组织片段植入NOD SCID小鼠的右肩背部皮下，并培养为种鼠，当瘤体长到约1000 mm3时，取出瘤块切成约50-100 mm3的小块种入NOD SCID小鼠皮下得到PDX模型，重复接种3次后，该病人瘤块可以在小鼠体内稳定传代。将稳定传代的前列腺癌PDX模型扩增传代至足够量，用于药物的评价。
实施例五 药代动力学和生物分布
在cRGD-MDTX的药代动力学研究中，将5周龄雄性Balb/c白鼠随机分组（n = 3），将200 μL的cRGD-MDTX、MDTX和自由DTX（7.5 mg/kg）通过尾静脉注射进小鼠体内，按照预定时间点眼眶取血50 μL左右至肝素钠处理过的EP管，离心后，收集20 μL血清加入到1 mL乙腈中提取DTX，置于4 ℃冰箱24小时。高速离心（13000 rpm，20分钟）后取上清液，挥发干乙腈后，补加0.1 mL乙腈溶解。最后，通过HPLC检测DTX的浓度，比对标准曲线计算样品中DTX含量。标准曲线是将20 μL健康小鼠血浆和已知浓度的DTX的乙腈溶液混合后按相同方法测定得到的。DTX含量对时间做图得到的血液循环曲线，通过Origin 8软件二次指数衰减拟合，通过公式：y = A1×exp(-x/t1) + A2×exp(-x/t2), t1/2, α= 0.693×t1; t1/2, β= 0.693×t2，可计算出分布半衰期和消除半衰期t1/2, α和t1/2, β。研究了cRGD-MDTX和MDTX在健康Balb/c小鼠中的药代动力学。如图7 A所示，两者的药代动力学均遵循两室模型，其消除半衰期（t1/2,β）分别为为4.5和5.0小时。与之形成鲜明对比的是，自由DTX被迅速消除（t1/2,β，0.4小时），2小时之后就检测不到DTX了。据报道，临床DTX制剂Nanoxel-PM和Taxotere的t1/2, β在小鼠中分别为2.10和1.98小时。说明本发明的cRGD-MDTX和MDTX表现出更长的循环时间。
以荷皮下PC3的Balb/c裸鼠为模型来评估cRGD/Cy5-MDTX的体内靶向和肿瘤穿透效果。具体如下：当肿瘤体积达到300 mm3左右时（n = 3），cRGD/Cy5-MDTX和Cy5-MDTX注射到荷瘤裸鼠（7.5 mg DTX/kg，10μg Cy5/kg）中。在注射后1、2、4、8和24小时分别腹腔注射戊巴比妥钠（80 mg/kg）麻醉小鼠后，用IVIS成像系统对小鼠全身扫描，观察Cy5的体内分布。在第24小时后，断颈处死小鼠，收集肿瘤和主要器官，离体荧光成像并半定量荧光强度。之后将肿瘤切片，通过免疫荧光法观察肿瘤中的胶束分布。具体步骤如下：肿瘤切片在二甲苯中脱蜡3次，每次10分钟，然后分别用无水乙醇、95%乙醇和二次水浸泡两次复水，每次10分钟。室温下，将切片浸泡于抗原修复液（Tris/EDTA缓冲液，10 mM Tris，1 mM EDTA溶液，0.05%吐温-20，pH 9.0）中，用微波炉加入使之沸腾，保持95-99oC 10分钟。取出切片放到室温自然冷却。用10%山羊血清溶液覆于组织，并保证组织处于湿润状态，4oC下避光过夜。用0.1%的PBST冲洗后浸泡于PBS中2次，每次15分钟。然后加CD31抗体（1000倍稀释）溶液覆盖组织，在37oC孵育1小时后PBS清洗3次。接着用Alexa-680标记的anti-mouse IgG（稀释1000倍）37oC孵育1小时后PBS清洗3次。最后用DAPI染核，清洗后甘油封片，用CLSM观察切片。
为了研究纳米药物在荷PC3瘤小鼠体内的分布，当肿瘤体积达到300 mm3左右时，尾静脉注射cRGD-MDTX和MDTX到荷PC3瘤裸鼠（7.5 mg/kg DTX，n = 3）中。在3和24小时牺牲小鼠，取肿瘤和主要器官在2 mL甲醇中匀浆，在4oC下孵育24小时以提取DTX。离心获得上清液并挥发干后，加0.1 mL乙腈到残留物中充分溶解DTX。用HPLC测量DTX浓度，并根据标准曲线计算出该DTX的量占每克组织的注射剂量的百分比（%ID/g）。标准曲线是将一定质量的各器官与已知浓度的DTX乙腈溶液一起匀浆后按照上述步骤测得的。
利用非侵入式在体荧光成像技术监测了荷PC3皮下瘤的裸鼠中Cy5标记的cRGD-MDTX和MDTX的实时生物分布和肿瘤蓄积。图像显示，两者均在1小时迅速积聚在肿瘤中，并在2-4小时达到较高水平。MDTX的强度快速下降，而cRGD-MDTX在8-24小时仍在肿瘤中保持很高的水平（图7 B），表明其不仅可以在肿瘤快速富集还能较长时间滞留。在注射后24小时牺牲小鼠，其主要脏器和肿瘤的离体图像及其半定量分析结果显示，cRGD-MDTX组的肿瘤的荧光强度显著高于MDTX组（**p ＜ 0.01，图7 C，D），其在主要脏器，尤其是肝脏上并无大量富集，这一点与其他体系上观察到的现象有所不同。
在注射cRGD-MDTX 24小时后取小鼠主要器官和肿瘤，研磨、提取DTX，并用HPLC测定DTX的含量。结果显示，cRGD-MDTX组DTX在肿瘤中积累达8.3 %ID/g，约为MDTX组的3.1倍（***p ＜ 0.001，图7 E）。在荷PC3瘤小鼠中，cRGD-MDTX组肿瘤与正常组织（T/N）的比例是MDTX组的1.8-3.8倍（图7 F）。因为T/N比是一个药物体内靶向性的重要指标，cRGD-MDTX的高T/N比也证实了其优异的体内肿瘤选择性。cRGD-MDTX组肿瘤中的DTX从3小时显著增加到24小时（***p ＜ 0.001），而MDTX并没有太大变化（图7 G），证实了cRGD-MDTX在小鼠PC3肿瘤中的更高的富集和较长时间的滞留。
在静脉注射后24小时，取肿瘤切片，用CLSM荧光显微镜观察Cy5标记的cRGD-MDTX和MDTX在肿瘤内部的分布情况，主要观察了肿瘤切片中，两种胶束在肿瘤外缘区域、中心区域的分布以及与血管的相对位置（血管用抗CD31抗体染成绿色）。观察发现，不论是在肿瘤外缘或中心区域都可以观察到两种胶束（红色）的分布（图8）。在肿瘤外缘区域（图8 A），MDTX稍微少些，在血管里面大量停留，cRGD-MDTX则显著荧光强度更高、离血管更远、且荧光信号弥散到整个视野。重大的区别在肿瘤中心区域（图8 B），cRGD-MDTX仍然具有极其丰富的并均匀的分布，荧光强度和边缘区域相差无几；但MDTX的荧光强度大大减少，仅分布在血管里面。这个现象是令人兴奋的，尤其是考虑到前列腺癌被报道是血管化程度较低的肿瘤，导致其EPR效应差。也用马松和α-SMA染色了PC3肿瘤切片，发现PC3肿瘤的确是很致密肿瘤，其中含大量被染成蓝黑色的胶原纤维以及充满了肿瘤相关成纤维细胞标志物α-SMA（图9A，C）。现有技术普遍认为，肿瘤组织的细胞外屏障，如很高的组织间质压和较低的毛细血管间的压力梯度，会阻止纳米粒渗透到肿瘤组织深处。但是，本发明小尺寸的DTX胶束纳米药物穿透能力强，能穿透到肿瘤中心区域，该高肿瘤穿透能力是其合适的小尺寸、cRGD的靶向和新生血管系统并结合长期蓄积共同作用的结果。
实施例六 cRGD-MDTX在荷PC3瘤裸鼠体内的抗肿瘤活性和组织学分析
当肿瘤体积达到100 mm3左右时，荷瘤小鼠被随机分为7组（n = 5）。在第0、3、6、9天将200 μL的2.5% cRGD-MDTX、5% cRGD-MDTX、10% cRGD-MDTX、MDTX、ncMDTX、或自由DTX以7.5 mg DTX/kg或PBS尾静脉注射。每两天测量并计算肿瘤体积（V = W2×L/2，其中W和L分别为宽度和长度）。每两天称量体重并计算相对初始的相对肿瘤体积。在第14天牺牲小鼠，收集血液、主要器官和肿瘤，以及肋骨、脊柱、四肢骨，用4%甲醛固定。主要器官用苏木精和伊红（H&E）染色，肿瘤进行TUNEL染色。骨组织用小鼠X射线仪以评估骨损伤和骨溶解。血液中钙和磷的含量通过相应的ELSIA试剂盒按照说明书操作来测试，健康鼠为对照。
结果表明，与PBS组相比，ncMDTX和自由DTX具有相似的较弱的抗肿瘤能力，而MDTX则显著好于ncMDTX（*p ＜ 0.05，图10 A）。考虑到二者相似的尺寸和表面性质，MDTX的更高的抗肿瘤功效归因于DTC构建的坚固的交联的核心，从而防止了DTX的过早释放以及癌细胞内部的过慢释放；三种cRGD-MDTX对肿瘤生长的抑制作用都明显强于MDTX、ncMs或自由DTX（***p ＜ 0.001）。而5% cRGD-MDTX的肿瘤抑制作用又显著优于2.5% cRGD-MDTX（**p ＜0.01）和10% cRGD-MDTX（*p ＜ 0.05）（图10 A）。此外，所有小鼠在治疗期间均具有恒定的体重（图10 B），明确了该胶束纳米药物的低毒副作用。结果证实，纳米药物的cRGD密度在体内靶向性和抗肿瘤功效中起着至关重要的作用。现有技术（Biomaterials, 2014, 35,3005）报道的装载DTX的透明质酸纳米粒（靶向到CD44）在10 mg DTX/kg的剂量下，在同样的荷PC3的裸鼠模型中，仅仅稍微抑制肿瘤的生长，但是和PBS组无显著性差异。即使是双靶向组肿瘤也在缓慢增加，其疗效远低于本发明。
在第14天切除肿瘤，称重后与PBS组肿瘤质量相比计算出的肿瘤抑制率（TIR）。结果发现，5% cRGD-MDTX组的TIR高达94.6%（图10 C），大大高于MDTX、ncMDTX、自由DTX（***p＜0.001）、2.5% cRGD-MDTX（**p＜0.01）和10% cRGD-MDTX（*p＜0.05）。肿瘤切片用TUNEL染色，组织学分析表明，5%和10% cRGD的cRGD-MDTX均诱导广泛而大量的肿瘤细胞凋亡，明显强于其他组（图10 D）。H＆E染色结果发现，各组制剂对心、肝、脾、肺和肾均无明显的伤害（图11）。
由于PC3肿瘤具有骨转移性，解剖小鼠时发现，PBS组小鼠靠近肿瘤的肋骨、脊柱遭受了严重的损伤，甚至肋骨碎掉了，而其他治疗组的情况有改善。接着测量了治疗后小鼠血中钙和磷的浓度，以定量评估骨损伤。结果发现，PBS组钙和磷的血清浓度的确明显高于健康小鼠，自由DTX、ncMDTX、MDTX、2.5% cRGD-MDTX的治疗使得小鼠血清中钙和磷明显降低，而5% cRGD-MDTX组的浓度很低，和健康组没有显著差异（图12 A，B），说明其可保护小鼠骨骼免受损伤。
实施例七 cRGD-MDTX在PDX模型小鼠体内的抗肿瘤活性
PDX小鼠的肿瘤体积达到100 mm3左右时，小鼠随机分为5组（n = 5），在第0、3、6、9天将200 μL的cRGD-MDTX、MDTX、ncMDTX、自由DTX以7.5 mg DTX/kg或PBS注射到小鼠中。每两天测量肿瘤体积、称量体重。观察并记录小鼠状态和生存期。小鼠死亡或体重降低15%以上算为死亡。病人PDX模型是目前为止最接近临床研究的相关肿瘤模型，这种模拟人肿瘤特异性的模型对肿瘤临床前评估、治疗和预后具有重要意义。实验结果表明，在第16天时，PBS组肿瘤体积长到800 mm3，各个给药组均远远小于该值。值得注意的是，自由DTX和ncMDTX组肿瘤体积相差不大（ns），相比之下MDTX抗肿瘤活性显著提升（**p < 0.01），体积基本保持不变（图13 A）。在该PDX模型中，cRGD-MDTX组的抗肿瘤活性也是显著优于其他组（***p <0.001），肿瘤体积不仅没增长，在第16天时肿瘤体积比初始体积还缩小了43%。在显著减小肿瘤体积的同时，小鼠体重都无明显减小（图13 B）。这个结果和PC3皮下瘤的CDX模型结果一致。
实施例十 LHRH-MDTX在荷PC3瘤小鼠体内抗肿瘤活性
LHRH-MDTX的制备和cRGD-MDTX相似，即将LHRH-PEG-PLA替换cRGD-PEG-PLA，其余一样，在水相制备得到，LHRH-MDTX、cRGD-MDTX两者粒径近似，可认为无差异。小鼠实验也一样，与cRGD-MDTX相类似（图14），LHRH表面密度为5%时最优胶束的抗肿瘤活性最佳，比其他各组显示明显更强的抗肿瘤活性。LHRH表面密度为10%时，治疗效果与5%相似。
实施例十一 cRGD-MS-DTX在PDX模型小鼠体内的抗肿瘤活性
将DTX和PEG2k-P(CL1.0k-DTC1.1k) 按照不同质量比（5/100、10/100、20/100、30/100）溶于PEG 350中，其中聚合物浓度在50 mg/mL。室温下，取100 μL的该混合溶液打入900μL的PB溶液底部（pH 7.4，10 mM），即得到理论DTX载药量为4.8 wt.%～23.1 wt.%的DTX胶束纳米药物，为非靶向小胶束纳米药物，称为MS-DTX，DLS测定其粒径为25～30nm。
将部分PEG2k-P(CL1.0k-DTC1.1k)替换为cRGD-PEG2k-P(CL0.9k-DTC1.0k)，得到cRGD表面密度分别为2.5%、5%和10%的DTX胶束纳米药物，称为cRGD-MS-DTX，DLS测定其粒径为26～30nm。
以PEG2k-PCL2.0k为聚合物，得到ncMS-DTX。
病人PDX模型是目前为止最接近临床研究的相关肿瘤模型，这种模拟人肿瘤特异性的模型对肿瘤临床前评估、治疗和预后具有重要意义。当PDX小鼠肿瘤体积达到约50-100mm3时开始尾静脉给予PBS、自由DTX、ncMS-DTX、MS-DTX和cRGD-MS-DTX（7.5 mg /kg或者10mg /kg ）(n=5)，每三天给一针，共给五针。实验结果表明，在第16天时，PBS组肿瘤体积长到500 mm3，各个给药组均远远小于该值。值得注意的是，自由DTX、ncMS-DTX和MS-DTX肿瘤体积相差不大（ns），该PDX模型中，cRGD-MS-DTX组的抗肿瘤活性显著优于PBS、自由DTX、ncMS-DTX和MS-DTX组（*p < 0.05），肿瘤体积没有明显增长；cRGD-MS-DTX(10 mg /kg) 的抗肿瘤活性显著优于PBS、自由DTX、ncMS-DTX和MS-DTX组（**p ＜ 0.01）和cRGD-MS-DTX(7.5 mg /kg)（***p ＜ 0.001），在第16天解剖时有4只小鼠肿瘤由于过小无法测量到，结果见图15。cRGD-MS-DTX具有稳定胶束内核，增强了稳定性和DTX循环时间，且主动靶向增强了胶束在肿瘤处的富集、穿透到肿瘤深处以及肿瘤细胞特异性内吞，能使PDX模型小鼠肿瘤缩小。
参见图16，治疗第17天后，从小鼠的肿瘤照片中可以看出，cRGD-MS-DTX(7.5 mg /kg)治疗组小鼠的肿瘤体积小于自由DTX、ncMs-DTX和MS-DTX组肿瘤体积，其中，cRGD-MS-DTX(10 mg /kg)组肿瘤体积最小，并且其余4只小鼠并未发现肿瘤，这与肿瘤体积测量结果相符合。除此之外，在第17天切除肿瘤，称重后与PBS组肿瘤质量相比计算出的肿瘤抑制率（TIR）。结果发现， cRGD-MS-DTX(10 mg /kg)组的TIR高达99.4%，大大高于自由DTX、ncMs-DTX和MS-DTX组（**p ＜ 0.01）和cRGD-MS-DTX(7.5 mg /kg) （*p ＜ 0.05）；cRGD-MS-DTX(7.5 mg /kg) 组的TIR高达91.2%高于自由DTX、ncMs-DTX和MS-DTX组（*p ＜ 0.05）；MS-DTX组的TIR为79.8%高于ncMs-DTX组（*p ＜ 0.05）。
给药第17天，牺牲的小鼠取全血进行血常规检测、分离血清进行血生化检测，并解剖取主要脏器观察并切片，用H&E染色进行组织学分析。血生化检测表明，主要肝（碱性磷酸酶ALP、谷氨酰基转移酶GGT、天门冬氨酸氨基转移酶AST、丙氨酸氨基转移酶ALT）、肾（肌酐CRE、尿素URE）功能的各项指标在各组之间无显著性差异，并且，通过查文献，与健康小鼠作对比发现丙氨酸氨基转移酶ALT、天门冬氨酸氨基转移酶AST、碱性磷酸酶ALP的值均低于健康小鼠；血常规结果显示，红细胞数（RBC）、血小板数（PLT）和白细胞（WBC）在各组之间并无显著性差异，与健康小鼠之间无明显差异。荷瘤小鼠主要脏器的H&E染色切片显示，各组小鼠心、肝、肾没有出现明显的组织损伤。
本发明中所有数据均表示为平均值±标准方差（Mean ± SD）。组间的差异性通过ANOVA单因素方差分析计算得到。其中，*p ＜0.05代表存在统计学意义上的差异，**p ＜0.01与***p ＜ 0.001代表存在显著性的差异。
本发明设计制备了基于PEG-P(LA-DTC)、偶联cRGD的DTX胶束cRGD-MDTX，其DTX载药量高且稳定、小粒径、能主动靶向肿瘤细胞和肿瘤新生血管，在细胞内DTX能快速释放，具有长血液循环时间和高肿瘤富集量和深肿瘤穿透度，实现了对人源去势抵抗前列腺癌PC3的靶向治疗和高效抑制，在前列腺癌病人PDX模型的治疗中显示了令人惊喜的疗效。这种cRGD-MDTX生物可降解、制备便捷、可放大，为其高效治疗提供了一个平台。

Claims (10)

1.一种多西他赛胶束纳米药物，其特征在于，将多西他赛、聚合物、低聚乙二醇的混合溶液与缓冲液混合，得到多西他赛胶束纳米药物；所述低聚乙二醇的分子量为200～600Da。
2.根据权利要求1所述多西他赛胶束纳米药物，其特征在于，所述低聚乙二醇的分子量为300～500Da；聚合物的分子量为2000～15000Da。
3.根据权利要求1所述多西他赛胶束纳米药物，其特征在于，聚合物为非靶向聚合物，或者聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物的混合物。
4.根据权利要求3所述多西他赛胶束纳米药物，其特征在于，非靶向聚合物包括PEG-P(LA-DTC)、PEG-P(CL-DTC)或者PEG-P(TMC-DTC)。
5.根据权利要求3所述多西他赛胶束纳米药物，其特征在于，靶向聚合物包括B-PEG-P(LA-DTC)、B-PEG-P(CL-DTC)、B-PEG-P(TMC-DTC)、B-PEG-PLA、B-PEG-PCL或者B-PEG-PTMC，B为靶向分子。
6.权利要求1所述多西他赛胶束纳米药物的制备方法，其特征在于，将聚合物溶于低聚乙二醇，得到聚合物母液；将多西他赛溶于低聚乙二醇，得到多西他赛母液；再混合聚合物母液与多西他赛母液，得到多西他赛、聚合物、低聚乙二醇的混合溶液；将多西他赛、聚合物、低聚乙二醇的混合溶液与缓冲液混合，得到多西他赛胶束纳米药物。
7.根据权利要求6所述多西他赛胶束纳米药物的制备方法，其特征在于，聚合物为非靶向聚合物，或者聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物的混合物。
8.根据权利要求6所述多西他赛胶束纳米药物的制备方法，其特征在于，聚合物为非靶向聚合物与靶向聚合物时，非靶向聚合物与靶向聚合物的摩尔比为（5～50）∶1。
9.权利要求1所述多西他赛胶束纳米药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述多西他赛胶束纳米药物为化疗药物。
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