CN113462013B - 一种多孔道烷基化壳聚糖海绵、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种多孔道烷基化壳聚糖海绵、制备方法及应用，涉及生物材料技术领域，所述烷基化壳聚糖海绵内部具有微通道结构，且微通道之间相互连通。本发明提供的烷基化壳聚糖海绵改善了现有形状记忆型止血剂内部孔洞连通性差，无法引导组织原位再生以及生物相容性和生物降解性差的技术问题。本发明提供的烷基化壳聚糖海绵，通过在内部设置相互连通微通道结构，不仅具有良好的生物相容性、生物降解性、促凝血和抗感染性能，而且具有高的水/血液吸附能力、快的形状恢复功能，能够用于非压迫新贯穿伤止血并促组织原位再生。

Description

一种多孔道烷基化壳聚糖海绵、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，尤其是涉及一种多孔道烷基化壳聚糖海绵、制备方法及应用。

背景技术

目前，研究者已研发出多种形状记忆型止血剂。XStat^TM是一种由压缩型纤维素海绵填充而成的商业化止血设备。吸收血液后，纤维素海绵可快速膨胀，填充和压迫伤口，进而控制伤口出血。然而，纤维素海绵具有差的生物降解性，留在伤口部位会阻碍伤口的愈合，需要在止血后移出伤口。此外，由于纤维素海绵缺乏高度连通的孔结构，故其无法引导组织原位再生。聚合物泡沫在非压迫性贯穿伤止血中也显示出一定的应用潜力。然而，但聚合物泡沫通常具有差的血液吸附能力和形状恢复性能，导致其难以及时地压迫伤口和控制出血。此外，具有高血液吸附能力和形状记忆性能的冷冻结晶胶也被应用于非压迫性贯穿伤的止血。然而，冷冻结晶胶内部的的孔之间具有差(低)的连通性，这会延长血液流入止血剂的时间，从而导致止血剂形状恢复缓慢及止血效率降低。

有鉴于此，特提出发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种烷基化壳聚糖海绵，所述多孔道烷基化壳聚糖海绵内部具有微通道结构，且微通道之间相互连通。

本发明多孔道烷基化壳聚糖海绵，通过在内部设置相互连通微通道结构，不仅具有良好的生物相容性、生物降解性、促凝血和抗感染性能，而且具有高的水/血液吸附能力、快的形状恢复功能，能够用于非压迫性贯穿伤止血并促组织原位再生。

在本发明的一种优选方案中，多孔道烷基化壳聚糖海绵的孔隙率为68-91％。

典型但非限制性的，多孔道烷基化壳聚糖海绵的孔隙率如为68％、70％、72％、75％、78％、80％、82％、85％、88％、90％或91％。

通过将多孔道烷基化壳聚糖海绵的孔隙率设置为68-91％，以使得多孔道烷基化壳聚糖海绵具有更高的水/血液吸附能力和更快的形状恢复功能，有效提高止血效率。

在本发明的一种优选方案中，烷基化壳聚糖内部的微通道结构包括微通道和微孔，微通道和微孔相互连通，微通道的尺寸为130-145μm，所述微孔的尺寸为7-10μm。

典型但非限制性的，微通道的尺寸如为130、132、135、138、140、142或145μm，微孔的尺寸如为7、7.5、8、8.5、9、9.5或10μm。

通过在多孔道烷基化壳聚糖海绵内部设置相互连通的微通道和微孔，以进一步提高多孔道烷基化壳聚糖海绵内部微通道记忆微孔之间的连通性，提高水/血的细度能力和形状恢复功能，从而进一步提高止血效率。

优选地，微通道的尺寸为133.7-142.3μm，微孔的尺寸为7.2-9.2μm时，更利于控制多孔道烷基化壳聚糖海绵内部的连通性。

在本发明的一种优选方案中，多孔道烷基化壳聚糖海绵由烷基化壳聚糖制备而成，所述烷基化壳聚糖由疏水烷基链修饰到壳聚糖制备而成。

具体的，本发明提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵的制备方法，按照如下步骤制备得到：提供填充率为15％-75％的聚合物纤维模板，在聚合物纤维模板的孔隙中灌注壳聚糖溶液，冷冻干燥后将聚合物纤维模板洗脱，得到壳聚糖海绵，然后在还原剂存在的情况下，采用C8-C20的醛类化合物对壳聚糖海绵进行修饰，得到多孔道烷基化壳聚糖海绵。

典型但非限制性的，聚合物纤维模板的填充率如为15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％。

通过控制聚合物纤维模板的填充率为15％-75％，以避免填充率过高，后续聚合物纤维模板洗脱后得到的烷基化壳聚糖的力学强度过低，无法保持，也能够稳定形状，同时也能够避免填充率过低，导致的烷基化壳聚糖的孔隙率过低，影响血液/水的吸附能力，从而无法达到快速止血和促凝血的技术效果。

壳聚糖具有良好的生物相容性、生物降解性、止血和抗感染能力，但是壳聚糖的止血和抗感染能力是有限的，其难以应对严重出血和细菌感染。本发明通过在壳聚糖上接枝烷基链，利用疏水烷基链与细胞膜之间强烈的疏水性相互作用提高壳聚糖的止血和抗感染能力。

本发明将微通道结构整合到壳聚糖海绵中，不仅能够促进机体所需营养物质和氧气的输送及代谢产物的排出，而且能够为宿主细胞浸润、血管形成及与组织长入提供一个舒适的微环境，同时也有利于液体的快速渗入。

[聚合物纤维模板]

在本发明的一种优选方案中，制备聚合物纤维模板的聚合物包括聚己内酯(PCL)、聚(丙交酯-己内酯)共聚物(PLCL)、聚氨基甲酸酯(PU)、聚葵二酸甘油酯(PGS)、聚对二氧六环己酮(PDS)、聚乙醇酸(PGA)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚羟基脂肪酸酯(PHA)、聚乙二醇(PEO)中任意一种或几种的任意比例的混合物。当聚合物纤维模板的原料为PLA时，更利于后续进行洗脱操作。

优选地，聚合物纤维模板的填充率为20％-60％，以使得后续聚合物纤维模板洗脱后得到的多孔道烷基化壳聚糖海绵既具有优异的力学强度，能够保持结构的稳定性，又具有较高的孔隙率，能够促进血液/水的快速吸附，达到快速止血和抗凝血的功效，尤其是当聚合物纤维模板的填充率为40％，后续制备得到的多孔道烷基化壳聚糖海绵具有更为优异的力学性能、止血性能和促凝学功能。

[壳聚糖溶液]

在本发明的一种优选方案中，壳聚糖溶液为壳聚糖的乙酸水溶液，壳聚糖溶液的质量浓度为1-6％，优选为4％。

乙酸的水溶液属于壳聚糖的良溶剂，采用乙酸的水溶液溶解壳聚糖，以使得壳聚糖具有更佳的溶解性能。

优选地，乙酸的水溶液中，乙酸的质量浓度为1-4％，优选为2％。

典型但非限制性的，壳聚糖溶液的质量浓度如为1％、2％、4％或6％。

壳聚糖的质量浓度＜4％会导致形成的烷基化壳聚糖的力学性能差，无法保持稳定的形状，壳聚糖的质量浓度＞4％时，粘度过高，不易灌注到PLA模板的孔隙中。当壳聚糖的质量浓度为4％时，既有利于保持壳聚糖海绵的强度，又能保持较低的粘度，易于进行灌注操作。

[醛类化合物]

本发明采用带有疏水碳链的醛类化合物与壳聚糖上的氨基反应，以将水碳链修饰到壳聚糖上，利用疏水烷基链与细胞膜之间强烈的疏水性相互作用提高壳聚糖的止血和抗感染能力。

在本发明的一种优选方案中，醛类化合物为直链或直链的C10-C14醛，在保证壳聚糖疏水性能的同时，也更利于将疏水性碳链修饰到壳聚糖上。

典型但非限制性的，C10-C14醛如为直链或支链的C10醛、直链或支链的C11醛、直链或支链的C12醛、直链或支链的C13醛或直链或支链的C14醛，尤其是当醛类化合物为十二醛时，既能够保证壳聚糖疏水性能，又有利于进行修饰反应，将疏水链接枝到壳聚糖上。

在本发明的一种优选方案中，还原剂包括但不限于NaCNBH₃。

醛类化合物中的醛基基团能够与壳聚糖分子上的氨基基团反应，形成席夫碱(C＝N)，因为席夫碱对水较为敏感，易于断裂，使用还原剂对其进行还原，将其转化为具有高稳定性的C-N。

在本发明的一种优选方案中，采用醛类化合物对壳聚糖海绵进行修饰后，采用乙醇和水的混合溶液浸泡去除未反应的醛类化合物及还原剂，以避免残留的未反应醛类化合物及还原剂影响烷基化壳聚糖的生物相容性。

在本发明的一种优选方案中，将聚合物纤维模板洗脱后，采用乙醇和NaOH的混合溶液中和壳聚糖海绵中残留的乙酸，以避免残留的乙酸影响后续的醛类化合物的修饰反应。

优选地，乙醇和NaOH的混合溶液中，两者的体积比为8-9:2-1，优选为9:1。

在本发明的一种优选方案中，进行冷冻干燥前，先进行液氮预冷，以利于在壳聚糖海绵内部形成通道孔径分布均匀的微通道结构。

在本发明的一种优选方案中，聚合物纤维模板通过3D打印、浇筑、相分离、静电纺丝、湿法纺丝、熔融纺丝或粒子沥滤中的任意一种或几种相结合制备而成，尤其是采用3D打印的方式制备聚合物纤维模板时，更利于填充率的控制以及提高加工效率。

在本发明的一种优选方案中，多孔道烷基化壳聚糖海绵中，疏水烷基链的接枝率为27.86±18.90％，以使得多孔道烷基化壳聚糖海绵具有优异的疏水性能。

本发明的目的之二在于提供上述多孔道烷基化壳聚糖海绵在制备止血剂中的应用。

本发明的目的之三在于提供上述多孔道烷基化壳聚糖海绵在制备非压迫性贯穿伤止血剂或促组织原位再生领域的应用。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

附图说明

图1为壳聚糖(CS)粉末、实施例1中制备得到的聚乳酸(PLA)纤维模板、实施例1中制备得到的CS/PLA复合体和对比例1提供的具有微通道结构的壳聚糖海绵的FTIR图；

图2为对比例1提供的壳聚糖海绵(MCS-2)的XPS图；

图3为实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵(MACS-2)的XPS图；

图4为实施例1-5提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACSs、对比例1提供的壳聚糖海绵MCS-2及对比例2提供多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS宏观和微观结构图、力学性能测试图以及吸血后的力学性能图；

图5为实施例1-3提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACSs及对比例2提供多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS的宏观和微观结构的水/血液吸附表征图；

图6为实施例1-3提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACSs及对比例2提供多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS的宏观和微观结构形状恢复表征图；

图7为吸水/血液前后，实施例1-3提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACSs的孔尺寸统计柱状图；

图8为实施例1-3提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACSs的体外促凝血活性表征图；

图9为GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、对比例1提供的MCS-2、对比例2提供的ACS和实施例2提供的MACS-2的在大鼠体内止血能力表征图；

图10为水、PBS、纱布、GS、CELOX^TM、对比例1提供的壳聚糖海绵MCS-2、对比例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS和实施例2提供的烷基化壳聚糖MACS-2的血液相容性和细胞相容性表征图；

图11为TCP、纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、对比例1提供的壳聚糖海绵MCS-2、对比例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS和实施例2提供的烷基化壳聚糖MACS-2的体外抗感染能力表征图；

图12为实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACS-2和对比例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS的促组织原位再生能力表征图。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供了一种多孔道烷基化壳聚糖海绵(命名为MACS-1)，其按照如下步骤制备而成：

(1)使用3D打印机打印填充率为20％的PLA纤维模板；

(2)将CS(壳聚糖)溶解于乙酸水溶液(2％，v/v)中获得浓度为4％(w/v)的CS溶液；利用4％(w/v)的CS溶液灌注PLA纤维模板，液氮预冷后，冷冻干燥，得到CS/PLA复合体；其中，液氮冷冻温度是-196℃，冷冻时间是5-30min；冷冻干燥的温度是-40到-80℃；冷冻干燥时间：24-72h；

(3)利用二氯甲烷洗脱CS/PLA复合体中的PLA纤维模板，获得具有微通道结构的CS海绵；

(4)利用乙醇/NaOH(9/1，v/v)混合溶液中和CS海绵中残留的乙酸；

(5)在NaCNBH₃存在下，用十二醛(DA)对CS海绵进行表面修饰，制备烷基化CS海绵；

(6)修饰后，将烷基化CS海绵浸泡于乙醇/水混合溶液中除去未反应的十二醛和NaCNBH₃，得到多孔道烷基化壳聚糖海绵。

实施例2

本实施例提供了一种多孔道烷基化壳聚糖海绵(命名为MACS-2)，其与实施例1的不同之处在于，步骤1中，3D打印得到的PLA纤维模板的填充率为40％。

实施例3

本实施例提供了一种多孔道烷基化壳聚糖海绵(命名为MACS-3)，其与实施例1的不同之处在于，步骤(1)中，3D打印得到的PLA纤维模板的填充率为60％。

实施例4

本实施例提供了一种多孔道烷基化壳聚糖海绵，其与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中灌注PLA纤维模板的CS溶液的质量浓度为1％。

实施例5

本实施例提供了一种多孔道烷基化壳聚糖海绵，其与实施例1的不同之处在于，步骤(2)中灌注PLA纤维模板的CS溶液的质量浓度为2％。

对比例1

本对比例提供了一种壳聚糖海绵(命名为MCS-2)，其制备方法同实施例1中步骤(1)-(4)，其与实施例1的不同之处在于，未进行烷基化修饰。

对比例2

本对比例提供了一种多孔道烷基化壳聚糖海绵(命名为ACS)，其按照以下步骤制备而成：

(1)将CS溶解于乙酸水溶液(2％，v/v)中获得浓度为4％(w/v)的CS溶液；

(2)将4％(w/v)的CS溶液采用液氮预冷后，冷冻干燥，得到壳聚糖海绵；其中，液氮冷冻温度是-196℃，冷冻时间是5-30min；冷冻干燥的温度是-40到-80℃；冷冻干燥时间：24-72h；

(3)在NaCNBH₃存在下，用十二醛对CS海绵进行表面修饰，制备烷基化CS海绵；

(4)修饰后，将烷基化CS海绵浸泡于乙醇/水混合溶液中除去未反应的十二醛和NaCNBH₃，得到多孔道烷基化壳聚糖海绵。

试验例1

通过FTIR测试对壳聚糖(CS)粉末、实施例1中制备得到的聚乳酸(PLA)纤维模板、实施例1中制备得到的CS/PLA复合体和对比例1提供的壳聚糖海绵的特征官能团进行表征。结果如图1所示，从图1中CS海绵的FTIR图，仅观察到归属于CS的特征峰，未见归属于PLA的特征峰，这表明CS海绵中无PLA残留。

试验例2

通过XPS测试分析和检测实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵和对比例1提供的壳聚糖海绵表面的化学结构和元素含量。壳聚糖海绵的XPS图如图2所示，烷基化CS海绵的XPS图如图3所示。实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵和对比例1提供的壳聚糖海绵中C-N*H₂，-N*H-COCH₃和C-N*H-C的峰面积如下表1所示。

表1 N1s峰面积

	C-N*H2％	-N*H-COCH3％	C-N*H-C％
				对比例1(CS海绵)	86.18±4.24％	13.82±4.24％	0.00±0.00％
实施例2(烷基化CS海绵)	57.29±15.57％	14.83±3.55％	27.86±18.90％

结合图2、图3以及表1可以看出，对比例1提供的壳聚糖海绵中N1s的化学态为C-N*H₂和-N*H-COCH₃。实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵中N1s的化学态为C-N*H₂，-N*H-COCH₃和C-N*H-C。对比例1提供的壳聚糖海绵中C-N*H₂和-N*H-COCH₃的峰面积分别为86.18±4.24％和13.82±4.24％。实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵中C-N*H₂，-N*H-COCH₃和C-N*H-C的峰面积分别为57.29±15.57％，14.83±3.55％和27.86±18.90％。C-N*H-C的出现和C-N*H₂峰面积的降低证明了十二醛的成功修饰。十二醛的接枝率为27.86±18.90％。

试验例3

(1)使用Micro-CT和SEM表征实施例1-5提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵及对比例2提供多孔道烷基化壳聚糖海绵的宏观和微观结构，使用Image-J软件测量孔的尺寸，使用Micro-CT测量孔隙率。

(2)使用万能力学试验机测试了实施例4、实施例2及实施例5提供的圆柱形MACSs(PLA纤维模板的填充率为40％，CS浓度为1，2和4％(w/v))、实施例1-3提供的圆柱形MACSs(PLA纤维模板的填充率为20，40和60％，CS浓度为4％(w/v))和对比例2提供的圆柱形ACS的压缩应力。压缩应变和速度分别为70％和1mm/min。

(3)将实施例4、实施例2及实施例5提供的圆柱形MACSs(PLA纤维模板的填充率为40％，CS浓度为1，2和4％(w/v))、实施例1-3提供的圆柱形MACSs(PLA纤维模板的填充率为20，40和60％，CS浓度为4％(w/v))和对比例2提供的圆柱形ACS分别浸没于血液中5-30min后取出，再分别使用万能力学试验机测试压缩压力，压缩应变和速度分别为70％和1mm/min。

图4(A)为MACSs的制备过程示意图；图4(B)为PLA纤维模板、PLA/CS复合体、CS海绵和烷基化CS海绵的体视显微镜图；图4(C)为对比例2提供ACS和实施例1-3提供的MACSs的Micro-CT图；图4(D)为对比例2提供ACS和实施例1-3提供的MACSs的SEM图；图4(E)为横切对比例2提供ACS和实施例1-3提供的MACSs的孔尺寸统计柱状图(n＝16)；图4(F)为纵切对比例2提供ACS和实施例1-3提供的MACSs的孔尺寸统计柱状图(n＝16)；图4(G)为对比例2提供ACS和实施例1-3提供的MACSs的孔隙率统计柱状图(n＝25)；图4(H)为实施例4、实施例2及实施例5提供的具有不同CS浓度的MACSs的压缩应力-应变曲线；图4(I)为实施例4、实施例2及实施例5提供的具有不同CS浓度的MACSs的压缩应力统计柱状图；图4(J)为对比例2提供的ACS，对比例1提供MCS-2和实施例1-3提供的MACSs的压缩应力-应变曲线；图4(K)为对比例2提供的ACS，对比例1提供MCS-2和实施例1-3提供的MACSs的压缩应力统计柱状图。图4(L)为吸血后，对比例2提供的ACS，对比例1提供MCS-2和实施例1-3提供的MACSs的压缩应力-应变曲线；图4(M)为吸血后，对比例2提供的ACS，对比例1提供MCS-2和实施例1-3提供的MACSs的压缩应力统计柱状图；图4(N)为吸血后，对比例2提供的ACS，对比例1提供MCS-2和实施例1-3提供的MACSs的力学增强倍数统计柱状图。样本平均数为3，数据表示为平均值±标准偏差，ns表示组间没有显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

如图4(C)所示，MACSs具有高度连通的微通道结构，且微通道密度随着PLA纤维模板填充率的提高而提高。ACS仅具有致密的微孔结构。

如图4(D)、(E)和(F)所示，MACSs内部同时分布有136.5±17.8μm的微通道和8.3±0.8μm的微孔结构。ACS内部仅分布有8.1±1.0μm的微孔结构。MACSs内部的微通道结构是高度连通和可控的。反之，ACS内部的微孔结构具有较低的连通性和可控性。

如图4(G)所示，随着PLA纤维模板填充率的提高，MACSs的孔隙率从73.2±2.9％提高到88.8±1.6％。MACSs的孔隙率明显高于ACS的32.1±1.9％。

如图4(H)和(I)所示，当CS浓度由1％增加到4％(w/v)时，MACSs的压缩应力从0.6±0.16kPa提高到23.3±1.2kPa。

如图4(J)和(K)所示，当PLA纤维模板的填充率由20％增加到60％，MACSs的压缩应力从46.3±6.5kPa降到8.1±0.8kPa。MACSs压缩应力的降低主要源自于单位体积内固含量的降低。此外，MACSs的压缩应力明显低于ACS的压缩应力(138.0±13.4kPa)，这归因于微通道的存在。

如图4(L)和(M)所示，吸血后，MACSs的压缩应力明显提高，这归因于凝血块的形成。当血液进入微通道中，其与CS和疏水烷基链作用，发生凝固。相比于ACS，血液对MACSs的力学强度具有更高的增强效应。此外，血液对MACSs力学强度的增强效应随孔隙率的提高而提高。增强效应的提高与孔隙率密切相关。孔隙率越高，比表面积越大。大的比表面积利于血液与止血剂更加充分的接触，进而能够形成更多的凝血块。

试验例4

通过定性和定量实验测试实施例1-3提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACSs及对比例2提供多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS的宏观和微观结构的水/血液吸附能力。

(一)定性实验的实验步骤如下：

1)将MACSs和ACS置于滤纸表面，压缩排出其内部自由水；

2)将排水的MACSs和ACS置于水/血液中；

3)使用数码相机记录MACSs和ACS在水/血液中的位置。

(二)定量实验的实验步骤如下：

1)测量MACSs和ACS的体积，记为V；

2)将MACSs和ACS置于滤纸表面，压缩排出其内部自由水；

3)称量排水后MACSs和ACS的重量，记为Wd；

4)将排水的MACSs和ACS浸没于水/血液中；

5)浸没一定时间后，取出，称重，重量记为Wt；

6)根据公式(水/血液吸附量/海绵体积(g/cm3)＝(Wt－Wd)/V)计算MACSs和ACS的水/血液吸附量。根据水/血液吸附量-时间动力学曲线来计算MACSs和ACS的水/血液吸附速率(单位是：g/cm3/s)。

图5(A)为浸泡于血液中的ACS和MACSs的宏观图；图5(B)为ACS和MACSs的水吸附量-时间曲线；图5(C)为ACS和MACSs的血液吸附量-时间曲线；图5(D)为ACS和MACSs的饱和吸水量统计柱状图；图5(E)为ACS和MACSs的饱和吸血量统计柱状图；图5(F)为ACS和MACSs的吸水速率统计柱状图；图5(G)为A CS和MACSs的吸血速率统计柱状图；图5(H)吸水前后，形状固定的ACS和MACSs的宏观图片。图5(I)吸血液前后，形状固定的ACS和MACSs的宏观图片。图5(J)为ACS和MACSs的流体吸附能力计算机模拟图像。图5(K)为ACS和MACSs的总流体速度。样本平均数为3，数据表示为平均值±标准偏差，ns表示组间没有显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

如图5(A)所示，吸收血液后，MACSs沉入容器底部。反之，ACS则悬浮在血液表面。如图5(B)、图5(C)、图5(D)、图5(E)、图5(F)和图5(G)所示，MACSs的饱和吸水/血液量明显高于ACS的饱和吸水/血液量，且随着孔隙率的提高而逐渐提高。此外，MACSs的吸水/血液速率也明显高于ACS的吸水/血液速率，且随着孔隙率的提高而提高。如图5(H)和图5(I)，MACSs能够允许水和血液的快速渗入。ACS能够允许水的快速渗入，但是，ACS阻碍了血液的渗入。接着，我们通过计算机进一步模拟了MACSs和ACS的流体吸附行为。如图5(J)和图5(K)所示，计算机模拟MACSs和ACS的流体吸附图中，高流速流体在MACSs内部的分布面积比在ACS内部的分布面积大。高流速流体在MACSs内部的分布面积随孔道数的增多而增大。此外，流体在MACSs内部的总流速明显高于ACS内部的总流速，且随着微通道数的增加而逐渐提高。上述结果表明，MACSs具有比ACS更强的水/血液吸附能力，这源自于微通道的存在。微通道结构使MACSs具有高的孔隙率，进而能够容纳更多的液体。此外，微通道结构具有高的连通性，利于液体的快速渗入。

试验例5

测试实施例1-3提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACSs及对比例2提供多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS的形状记忆性能，实验步骤如下：

1)将圆柱形MACSs和ACS置于滤纸表面，压缩排出其内部自由水；

2)滴加水/血液于形状固定的MACSs和ACS表面；

3)使用数码相机记录形状固定的MACSs和ACS的形状恢复过程；

4)定量评价MACSs和ACS的形状恢复率和形状恢复时间；

5)此外，使用SEM观察MACSs和ACS在压缩-恢复过程中微观结构的变化；

6)使用Image-J软件测量孔的尺寸。

图6(A)为吸水前后，MACSs和ACS的宏观图；图6(B)为吸血前后，MACSs和ACS的宏观图；图6(C)为吸水后，ACS和MACSs的形状恢复率统计柱状图；图6(D)为吸血后，ACS和MACSs的形状恢复率统计柱状图；图6(E)为吸水后，ACS和MACSs的形状恢复时间统计柱状图；图6(F)为吸血后，ACS和MACSs的形状恢复时间统计柱状图；图6(G)为吸水/血液前后，ACS和MACSs的SEM图。箭头指示变形的孔道。表2为MACS-2与已报道止血剂的形状恢复时间对比数据表。样本平均数为3，数据表示为平均值±标准偏差，ns表示组间没有显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

表2 MACS-2与已报道止血剂的形状恢复时间对比数据表

Hemostats

XSatTM

GT25/DA8

Peanut

TRAP/Sp

QCS/PDA4

MACS-2

水

4.2±0.2s

～10s

10s

2.4s

2.1±0.1s

血

25s

23.4±2.4s

～10s

19.8±4.9s

2.5±0.5s

注：XSatTM是商品化的止血剂。其余止血剂为研究报道止血剂

图7(A)为吸水/血液前后，MACS-1的孔尺寸统计柱状图；图7(B)为吸水/血液前后，MACS-2的孔尺寸统计柱状图；图7(C)为吸水/血液前后，MACS-3的孔尺寸统计柱状图。样本平均数为6，数据表示为平均值±标准偏差，ns表示组间没有显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001如图6(A)和图6(B)所示，压缩排水后，MACSs和ACS能够实现形状固定。吸水后，形状固定的MACSs和ACS能够恢复到初始形状。吸血后，形状固定的MACSs能够恢复到初始形状，而形状固定的ACS不能够恢复到初始形状。

如图6(C)和图6(D)所示，吸水后，MACS-1、MACS-2、MACS-3和ACS的形状恢复率分别为100±0％、99.6±0.6％、99.6±0.6％和98.3±1.5％。吸血后，MACS-1、MACS-2、MACS-3和ACS的形状恢复率分别为100±0％、99.6±0.6％、99.6±0.6％和0.0±0.0％。

如图6(E)和图6(F)所示，吸水后，MACS-1、MACS-2、MACS-3和ACS的形状恢复时间分别为3.3±0.6s、2.1±0.1s、1.7±0.6s和41±3.6s。吸血后，MACS-1，MACS-2和MACS-3的形状恢复时间分别为4.0±1.0s，2.5±0.5s和2.1±0.1s。

此外，从表2可以看出，MACSs的形状恢复时间明显短于已报道止血剂的形状恢复时间。MACSs的形状恢复时间不受体液(血液)粘度的影响。反之，部分已报道止血剂的形状恢复时间随体液粘度的提高而延长。上述结果表明，MACSs具有比ACS和已报道止血剂更强的形状恢复能力，这主要归因于MACSs内部微通道的存在。微通道具有高度的连通性，能够允许水/血液快速地渗透到MACSs中。反之，ACS和已报道止血剂内部的孔结构具有差的连通性，其将阻碍水/血液的快速渗入。

使用SEM进一步观察了MACSs和ACS内部孔结构的变化，如图6(G)所示，压缩前，MACSs内部具有相互连通的圆形微通道结构。ACS内部具有致密的微孔结构。压缩后，MACSs内部的圆形微通道发生塌陷变为平坦通道。ACS内部的致密微孔结构也发生塌陷，变得更加致密。吸水后，MACSs内部变形的微通道恢复到原始状态，微孔道的尺寸与压缩前的尺寸基本一致(如图7所示)。ACS内部的变形微孔也恢复初始形状。吸血后，MACSs内部变形的微通道同样能够恢复到原始状，且在微通道内部可以观察到大量聚集的RBC。与之相反，ACS内部的变形微孔不能恢复到原始状态，在变形的微孔内部几乎不能观察到RBC，这是因为微孔结构较为致密，限制了血液的渗入。

试验例6

测量血液凝集指数(BCI)来评价实施例1-3提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACSs的促凝血能力。纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、对比例1提供的壳聚糖海绵MCS-2及对比例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS作为对照组，其中，纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G均由市售购买得到，实验步骤如下：

1)1)将MACSs置于滤纸表面，压缩排出其内部自由水；

2)将排水的MACSs放置于EP管中；

3)滴加50μL柠檬酸钠抗凝全血于形状固定的MACSs表面；

4)4)37℃孵育一段时间后，向EP管中加入3mL去离子水浸没MACSs；

5)使用酶标仪测量上清液的OD_540nm值；

6)使用酶标仪测量抗凝全血/去离子水溶液的OD_540nm值，并记为参考值；

7)根据公式(BCI(％)＝OD_止血剂/OD_参考值×100％)计算MACSs的BCI值。

图8(A)为纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、ACS、MCS-2和MACSs组的BCI-时间曲线；图8(B)为RBC在纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、ACS、MCS-2和MACSs表面的粘附百分比统计柱状图；图8(C)为血小板在纱布、GS、CELOXTM、CELOXTM-G、ACS、MCS-2和MACSs表面的粘附百分比统计柱状图；图8(D)为粘附于纱布、GS、CELOXTM、CELOXTM-G、ACS、MCS-2和MACSs表面的RBC的SEM图；图8(E)为粘附于纱布、GS、CELOXTM、CELOXTM-G、ACS、MCS-2和MACSs表面的血小板的SEM图；图8(F)为粘附于止血剂表面血小板的免疫荧光染色图片；图8(G)为MACSs的体外促凝血机理示意图。样本平均数为3，数据表示为平均值±标准偏差，ns表示组间没有显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

如图8(A)所示，随着孵育时间的延长，MACSs组的BCI值逐渐降低，表明MACSs的促凝血活性逐渐提高。在同一时间点，MACSs组的BCI值随孔隙率的增加而降低，表明MACSs的促凝血能力与孔隙率呈正相关性。MACSs组的BCI值明显低于ACS组的BCI值，表明MACSs的促凝血能力强于ACS，其源自于孔隙率的提高。孔隙率越高，比表面积越大，大的比表面积有利于血液与止血剂更加充分的接触。MACSs组的BCI值也明显低于MCS-2组的BCI值，表明MACSs的促凝血能力强于MCS-2，这主要归因于疏水烷基链的引入。疏水烷基链能够促进RBC粘附和聚集。此外，相比于纱布、GS、CELOXTM和CELOXTM-G，MACSs同样展现出更强的促凝血能力，其源自于CS和疏水烷基链的协同作用。

机体主动的凝血级联反应主要依赖于RBC的聚集和血小板的粘附与激活。如图8(B)和8(C)所示，纱布、GS、CELOXTM、CELOXTM-G、ACS、MCS-2、MACS-1、MACS-2和MACS-3组的RBC粘附百分比分别为7.1±1.4％、9.8±1.2％、26.2±1.9％、25.3±2.1％、16.8±1.6％、20.4±1.6％、32.8±2.3％、41.0±2.0％和48.2±2.2％。纱布、GS、CELOXTM、CELOXTM-G、ACS、MCS-2、MACS-1、MACS-2和MACS-3组的血小板粘附百分比分别为14.4±1.1％、11.9±1.5％、30.8±2.3％、28.9±2.6％、18.7±1.6％、20.8±2.2％、38.0±2.3％、44.7±2.2％和49.8±2.5％。

如图8(D)和8(E)所示，相比于其它止血剂，更多的RBC和血小板粘附在MACSs上。此外，在MACSs表面可以观察到聚集的RBC和激活的血小板，其数量高于其它组(图8(F))。上述实验结果表明，MACSs具有强的体外促凝血能力，其主要源自于CS，微通道结构和疏水烷基链的协同作用(图8(G))。微通道结构能够加速血液渗透，进而促使RBC和血小板与止血剂充分接触。CS能够促进RBC的聚集和血小板的粘附，聚集与激活。疏水烷基链可通过疏水相互作用主动捕获和聚集RBC和血小板。

试验例7

通过大鼠的致死性肝脏贯穿伤出血模型评价实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACS-2的体内止血能力。纱布，GS，CELOXTM，CELOXTM-G，对比例1提供的壳聚糖海绵MCS-2以及对比例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS和作为对照组。动物实验的进行得到了南开大学动物实验伦理委员会的批准。实验步骤如下：

1)使用10％(w/v)的水合氯醛麻醉大鼠并将其固定在手术板上。麻醉剂的使用剂量为300g/1mL；

2)刮去大鼠腹部毛发后，切开大鼠腹部，将肝脏取出，置于预先称重的滤纸表面；

3)使用组织活检器，在肝脏表面创建一个直径为6mm的贯穿性伤口；

4)将压缩排水的MACS-2(原直径为8mm)填充到伤口中；

5)使用数码相机记录止血过程；

6)使用计时器记录止血时间；

7)通过公式(失血量(g)＝(W_{血液+滤纸}+W_{血液+止血剂})－(W_滤纸+W_止血剂))计算总失血量。

图9(A)为正常大鼠肝脏贯穿伤止血示意图；图9(B)为未处理伤口与纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、ACS、MCS-2和MACS-2处理伤口的宏观图，箭头和虚线分别指示伤口和肝脏边缘；图9(C)为未处理组与纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、ACS、MCS-2和MACS-2处理组的总失血量统计柱状图；图9(D)为未处理组与纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、ACS、MCS-2和MACS-2处理组的止血时间统计柱状图。样本均数为3，数据表示为平均值±标准偏差，ns表示组间没有显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

如图9(B)所示，未处理伤口、纱布、GS、CELOX^TM-G、CELOX^TM、ACS和MCS-2处理的伤口发生明显的血液泄露，大量的血液分散在滤纸表面。相反，MACS-2处理的伤口没有发生明显的血液泄漏，仅有少量的血液分散在滤纸表面。如图9(C)和图9(D)所示，MACS-2组的总失血量为0.5±0.1g，其明显低于其它组的失血量。MACS-2组的止血时间为12.7±2.5s，其明显短于其它组的止血时间。上述结果表明，MACS-2具有比其它止血剂更好的止血效果。

试验例10

(一)血液相容性实验

通过观察和量化血红蛋白的释放评价实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACS-2的血液相容性。DIW、PBS、纱布、GS、CELOX^TM、对比例1提供的壳聚糖海绵MCS-2和对比例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS作为对照组。实验步骤如下：

1)1)将装入离心管的抗凝全血放于离心机中，在1000rpm下离心15min获得浓缩的RBC；

2)使用PBS反复洗涤浓缩的RBC；

3)使用PBS稀释RBC获得浓度为2％(v/v)的RBC悬浮液；

4)将MACS-2置于滤纸表面，压缩排出内部自由水，并放入1.5mL的离心管中；

5)向离心管中加入稀释的RBC悬浮液，浸没MACS-2；

6)6)37℃孵育1h后，离心MACS-2/RBC混合物。离心速度和时间分别为1000rpm和15min；

7)使用数码相机获取离心后MACS-2/RBC混合物的宏观照片；

8)取100μL上清液，使用酶标仪测其OD_540nm值；

9)根据公式(溶血率(％)＝(OD_止血剂－OD_PBS)/(OD_DIW－OD_PBS)×100％)计算MACS-2的溶血率。

(二)细胞相容性实验

通过CCK-8和活/死染色实验评价实施例2提供的烷基化壳聚糖MACS-2对3T3成纤维细胞的细胞相容性，GS作为对照组。

(1)CCK-8实验的实验步骤如下：

1)将灭菌的MACS-2放入48孔细胞培养板中；

2)将3T3成纤维细胞悬浮液滴加于MACS-2表面；

3)在37℃下孵育1，3和5天；

4)孵育结束后，向孔中加入CCK-8试剂，继续孵育4h；

5)取100μL上清液滴加于96孔细胞培养板中；

6)使用酶标仪测量上清液的OD_450nm值。以此来评价3T3成纤维细胞的增殖情况。

(2)活/死染色实验的实验步骤如下：

1)将灭菌的MACS-2放入48孔细胞培养板中；

2)将3T3成纤维细胞悬浮液滴加于MACS-2表面；

3)在37℃孵育1、3和5天后，向孔中加入活/死染色试剂；

4)30min后，使用激光共聚焦显微镜观察染色细胞并获取相应的图像。

图10(A)为水、PBS、纱布、GS、CELOX^TM、ACS、MCS-2和MACS-2的溶血宏观图；图10(B)为水、PBS、纱布、GS、CELOXTM、ACS、MCS-2和MACS-2组的溶血率统计柱状图；图10(C)为GS和MACS-2组中细胞悬液的OD_450nm值统计柱状图；图10(D)为与GS和MACS-2共培养后，3T3成纤维细胞的活/死染色荧光图片。样本平均数为3，数据表示为平均值±标准偏差，ns表示组间没有显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

如图10(A)所示，水组中上清液的颜色为亮红色，这归因于RBC破裂后血红蛋白的释放。相反，MACS-2组中上清液的颜色为浅粉红色，与其它组中上清液的颜色接近。如图10(B)所示，MACS-2组的溶血率明显低于水组的溶血率。此外，MACS-2组的溶血率低于生物材料的溶血率安全标准5％。上述结果表明，MACS-2具有良好的血液相容性。我们通过CCK-8实验和活/死染色实验评价了MACS-2对3T3成纤维细胞的细胞相容性。GS作为对照组。如图10(C)所示，MACS-2组的OD_450nm值随培养时间的延长而逐渐增大，且与GS组的OD_450nm值间无显著性差异。如图10(D)所示，在MACS-2组中，几乎没有观察到死亡的3T3成纤维细胞。上述结果表明，MACS-2对3T3成纤维细胞具有良好的细胞相容性。

试验例11

通过接触杀菌实验评价实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACS-2对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的体外抗感染活性。组织培养板(TCP)、纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、对比例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS和实施例1提供的壳聚糖海绵MCS-2作为对照组。实验步骤如下：

1)将形状固定的MACS-2放入48孔细胞培养板中；

2)UV照射后，滴加10μL(10⁸CFUs/mL)细菌悬液于MACS-2表面；

3)37℃孵育2h后，向每孔中加入200μL PBS重悬活菌；

4)取20μL重悬菌液，十倍稀释六次，获得终稀释菌液；

5)取20μL终稀释菌液，滴加在LB琼脂板表面；

6)37℃过夜培养后，统计LB琼脂板上形成的菌落数；

7)根据公式(LogIncrease＝Log止血剂组的CFUs－LogTCP组的CFUs)计算MACS-2对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀菌率。

图11(A)为与TCP、纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、ACS、MCS-2和MACS-2接触后，金黄色葡萄球菌的涂板结果宏观图；图11(B)为与TCP、纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、ACS、MCS-2和MACS-2接触后，大肠杆菌的涂板结果宏观图；图11(C)为纱布、GS、CELOX^TM、CELOX^TM-G、ACS、MCS-2和MACS-2对金黄色葡萄球菌的杀菌率统计柱状图；图11(D)为纱布、GS、CELOXTM、CELOXTM-G、ACS、MCS-2和MACS-2对大肠杆菌的杀菌率统计柱状图。样本平均数为3，数据表示为平均值±标准偏差，ns表示组间没有显著性差异，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

如图11(A)所示，MACS-2组中金黄色葡萄球菌的菌落数明显少于纱布，GS和ACS组中金黄色葡萄球菌的菌落数。MACS-2组中金黄色葡萄球菌的菌落数与CELOXTM-G，CELOXTM和MCS-2组中金黄色葡萄球菌的菌落数没有明显差异。如图11(B)所示，MACS-2组中大肠杆菌的菌落数明显少于其它组中大肠杆菌的菌落数。如图11(C)所示，MACS-2组的LogIncrease值明显低于纱布和GS组的LogIncrease值。MACS-2组的LogIncrease值与CELOXTM-G，CELOXTM和MCS-2组的LogIncrease值间无显著性差异。如图11(D)所示，MACS-2组的LogIncrease值明显低于其它组的LogIncrease值。上述结果表明，相比于纱布，GS和ACS，MACS-2对金黄色葡萄球菌具有更强的抗感染能力。MACS-2对金黄色葡萄球菌的抗感染能力与CELOXTM-G，CELOXTM和MCS-2对金黄色葡萄球菌的抗感染能力相当。MACS-2对大肠杆菌的抗感染能力强于其它止血剂对大肠杆菌的抗感染能力。MACS-2的抗感染能力归因于微通道结构，接枝的疏水烷基链和CS本身的协同效应。微通道结构能够使细菌与MACS-2充分的接触。在细菌与MACS-2接触培养过程中，细菌呼吸将产生大量酸性物质(乳酸和碳酸)，能够诱导MACS-2局部酸化，使CS分子中的氨基基团发生质子化。质子化氨基能够与菌膜发生静电相互作用，从而诱发菌膜变形和破裂，导致胞内营养物质流失和细菌死亡。MACS-2中残留的质子化氨基基团也能够发挥抗菌作用。接枝的疏水烷基链可通过疏水相互作用嵌入细菌膜内部，破坏细胞膜，导致胞内营养物质流失，进而诱发细菌死亡。此外，CS分子中的氨基和羟基基团能与维持细胞膜稳定和细胞正常代谢所需要的金属离子发生螯合作用，干扰细菌代谢，破坏细胞膜稳定性，导致渗透性改变，抑制细菌生长。

试验例12

使用大鼠肝脏缺损模型评价实施例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵MACS-2和对比例2提供的多孔道烷基化壳聚糖海绵ACS的促组织原位再生能力。实验步骤如下：

1)使用水合氯醛麻醉大鼠并将其固定在手术板上；

2)刮去大鼠腹部毛发，切开大鼠腹部，将肝脏取出，置于滤纸表面；

3)使用组织活检器，在肝脏表面创建一个直径为6mm的贯穿性伤口；

4)将形状固定的MACS-2(原直径为8mm)填充到伤口中。将直径为8mm的ACS直接填充到伤口中，这是因为压缩的ACS与血液接触不能够恢复初始形状；

5)止血后，缝合腹部，正常喂养大鼠；

6)术后一个月，将大鼠麻醉，取出肝脏组织；

7)通过H&E染色评价MACS-2和ACS中组织的长入程度；

8)通过糖原染色(PAS)检测MACS-2和ACS中肝糖原的合成；

9)通过DAPI染色评价MACS-2和ACS中宿主细胞的浸润程度；

10)通过对von Willebrand因子(vWF)进行免疫荧光染色来评价MACS-2和ACS中的血管化程度；

11)通过对白蛋白(ALB)进行免疫荧光染色来评价MACS-2和ACS中肝实质细胞的浸润程度；

12)通过对肝细胞核因子(HNF-4α)进行免疫荧光染色来评价MACS-2和ACS中肝因子的表达。

图12(A)为天然肝脏，ACS和MACS-2的DAPI染色图片、H&E染色图片、vWF/DAPI免疫荧光染色图片和ALB/DAPI免疫荧光染色图片。星号，井号键和箭头分别指示烷基化CS，血管和肝实质细胞(LPC)。图12(B)为天然肝脏，ACS和MACS-2中细胞数统计柱状图(n＝7)。图12(C)为天然肝脏，ACS和MACS-2中组织长入面积统计柱状图(n＝3)。图12(D)为天然肝脏，ACS和MACS-2中血管数统计柱状图(n＝7)。图12(E)为天然肝脏，ACS和MACS-2中LPC数统计柱状图(n＝7)。图12(F)为天然肝脏，ACS和MACS-2的PAS染色图片和HNF-4α/DAPI免疫荧光染色图片。星号和箭头分别指示烷基化CS和肝细胞核因子。图12(G)为ACS和MACS-2引导肝组织原位再生示意图。样本平均数为3或者7，数据表示为平均值±标准偏差，*P<0.05，***P<0.001。

如图12(A)和图12(B)所示，宿主细胞能够迁移进入MACS-2内部。相反，宿主细胞无法迁移进入ACS内部，仅仅分布在ACS边缘。浸润后，宿主细胞将分泌大量细胞外基质，形成新组织。

如图12(A)和图12(C)所示，MACS-2内部可见大面积的新生组织。反之，ACS内部几乎没有新生组织。MACS-2和ACS组的组织长入面积分别为44.8±5.6％和0.0±0.0％。新生组织的存活往往需要氧气和营养物质的供应。毛细血管能够输送组织生存所需的氧气和营养物质。

如图12(A)和图12(D)所示，MACS-2内部分布有高密度的毛细血管。相反，ACS内部几乎没有毛细血管存在。此外，我们通过对肝脏特异性markers(白蛋白，糖原和肝细胞核因子)进行了染色进一步评价了MACS-2与肝组织的整合程度。

如图12(A)、图12(E)和图12(F)所示，MACS-2内部具有大量浸润的ALB阳性细胞以及糖原和肝细胞核因子。相反，ACS内部几乎未见ALB阳性细胞以及糖原和肝细胞核因子。上述实验结果表明，MACS-2具有比ACS更强的促组织原位再生能力，其主要源自于高度连通的微通道结构，高孔隙率和良好的生物相容性。微通道能够促进细胞浸润，血管形成和组织长入(图12(G))。反之，致密的微孔结构限制了细胞的浸润。

MACS-2能够同时实现止血和促组织原位再生，这不仅扩大了止血剂的应用范围，也为止血剂的设计和构建提供了新思路。此外，MACS-2的应用将减轻患者的不适感，简化治疗程序并有可能降低医疗成本。

综上所述，本发明使用纤维模板沥洗，冷冻干燥和表面活性修饰相结合的方法制备了一种多孔道烷基化壳聚糖海绵MACSs。MACSs具有高度连通且可控的微通道结构、优异的力学性能、强的水/血液吸附能力和快的形状恢复性能。与纱布、GS、CELOX^TM和CELOX^TM-G相比，MACSs具有更强的促凝血活性。同时，MACSs在大鼠肝脏贯穿伤出血模型中展现出更强的止血能力。MACSs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有强的抗感染活性。更重要的是，止血后，MACSs能够留在伤口部位，通过促进肝实质细胞的浸润，血管生成和肝组织长入来引导肝组织原位再生。上述结果表明，MACSs在控制非压迫性贯穿伤出血和引导组织原位再生方面具有较大的应用潜力和临床转化潜力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (3)

1.一种多孔道烷基化壳聚糖海绵，其特征在于，所述多孔道烷基化壳聚糖海绵内部具有微通道结构，且微通道之间相互连通；

所述多孔道烷基化壳聚糖海绵的孔隙率为68-91％；所述微通道结构包括微通道和微孔，所述微通道和微孔相互连通，所述微通道的尺寸为133.7-142.3μm，所述微孔的尺寸为7.2-9.2μm；

所述多孔道烷基化壳聚糖海绵由烷基化壳聚糖制备而成；所述烷基化壳聚糖由疏水烷基链修饰到壳聚糖制备而成；

所述疏水烷基链为C10-C14的直链或支链的脂肪烃；

所述疏水烷基链的接枝率为27.86±18.90％；

所述多孔道烷基化壳聚糖海绵的制备方法包括：提供填充率为15％-75％的聚合物纤维模板，在聚合物纤维模板的孔隙中灌注壳聚糖溶液，冷冻干燥后将聚合物纤维模板洗脱，得到壳聚糖海绵，然后在还原剂存在的情况下，采用C8-C20的醛类化合物对壳聚糖海绵进行修饰，得到多孔道烷基化壳聚糖海绵。

2.根据权利要求1所述的多孔道烷基化壳聚糖海绵在制备止血剂中的应用。

3.根据权利要求1所述的多孔道烷基化壳聚糖海绵在制备非压迫性贯穿伤止血剂或促组织原位再生领域的应用。

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