CN113456820A - 包含glp-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含GLP‑1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的组合物及其用途。特别地，本发明涉及包含药物有效量的GLP‑1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的药物组合物，其中所述GLP‑1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂分别独立地与亲水性聚合物形成缀合物或者所述GLP‑1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂一起与亲水性聚合物形成缀合物。

Description

包含GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的组合物及 其用途
本申请是申请日为2015年12月29日、发明名称为“包含GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的组合物及其用途”、申请号为201511017796.2的发明的分案申请。
技术领域
本发明涉及药物领域。特别地，本发明涉及包含GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的组合物及其用于减肥和/或降脂的用途。
背景技术
随着近年来经济的发展带来的饮食和生活方式的改变，肥胖人群的比例逐年上升。根据世界卫生组织的最新统计结果：全球肥胖和超重人口人数已由1980年的8.57亿人激增至2013年的21亿，占全球总人口近三分之一。2014年，18岁及以上的成年人中有超过19亿人超重，其中6亿人肥胖。2014年，18岁及以上的成年人中有39％的人超重，13％的人肥胖。一度被视为高收入国家问题的超重和肥胖，如今在中低收入国家呈上升的趋势。超重和肥胖会升高血压和增加血液中胆固醇含量，是包括糖尿病、心血管疾病和癌症在内的若干慢性病的主要风险因素。
生活方式的干预(适当的运动以及健康的饮食)往往不能完全控制肥胖的发展。在这种情况下，药物干预被认为是适当和必要的。奥利司他是目前全球唯一的OTC减肥药，全球超过40,000,000人服用并成功减重，是目前最畅销的减肥产品。奥利司他是一种强效和长效的特异性胃肠道脂肪酶抑制剂，通过直接阻断人体对食物中脂肪的吸收，摄入的热能和脂肪一旦小于消耗，体内脂肪自然减少，从而达到减重的目的。但是，奥利司他具有多种缺点，例如，其减肥效果对某些人群不显著，而且其需要每天随餐或者餐后服用，患者依从性较差。而且，其也存在安全性风险。美国食品药品监督管理局于2010年5月警告其存在可能引起严重肝损害的风险。因此，需要开发其他机制的新的减肥药物。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种进食后由肠道L-细胞分泌的多肽激素，它能刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，从而稳定餐后血糖的波动。外源给予GLP-1能使II型糖尿病患者的血糖水平正常化。GLP-1降低血糖的作用具有葡萄糖浓度依赖性，从而在调节血糖的同时，大大降低了低血糖的风险。基于GLP-1的药物，例如Byetta、Victoza、Albiglutide和Dulaglutide，在近几年成功上市，在糖尿病药物中逐渐占据了重要的地位。
临床的应用中发现，GLP-1类药物在降低血糖的同时具有减肥的效果，其机理可能是由于GLP-1作用于胃肠道，延缓胃排空和肠道蠕动的作用，以及GLP-1作用于中枢神经系统，发挥抑制食欲，增加饱腹感等作用而达到减少摄食的目的。诺和诺德的Victoza更是在2014年获批增加了减肥这一适应证。但是由于半衰期短，采用Victoza治疗的患者需要每天打一针，增加了长期应用患者的痛苦。
胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的53至81位氨基酸，并具有如下序列：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr(SEQ ID NO:2)。胃泌酸调节素(Oxyntomodulin，简称OXM)是37个氨基酸的肽，其包含胰高血糖素完整的29个氨基酸序列以及八肽羧基端延伸(前胰高血糖素原的82至89位氨基酸)。默克和Zealand公司均在开发胃泌酸调节素的衍生物用于减肥和降糖。默克开发的一项用于减肥的双激动剂多肽项目已经进入临床I期，Zealand公司的zp2929尚在临床前阶段。
胃泌酸调节素用于减肥虽然有着诱人的前景，但还是有它的不足之处。比如人体血浆内胃泌酸调节素的半衰期非常短(8-12分钟)；作为双受体激动剂，它的活性较差，激活两个受体的能力均大大低于原肽，使得在人体的给药剂量需要达到mg/kg的级别。而且，胃泌酸调节素针对两个受体的激动活性呈现一种固定的比例，不能调节，而这一比例未必是施展其减肥效应的最佳比例。因此，如何针对这些问题来优化药物设计，成为了众多医药研发工作者的首要问题。
Exendin-4是从墨西哥巨蜥蜴唾液中分离出来的一种含有39个氨基酸的多肽序列，与GLP-1具有53％的同源性。研究表明，Exendin-4同样可以与GLP-1受体结合，并在药理上表现出与GLP-1相类似的激动作用。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。包括单纯性脂肪肝(SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝硬化。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，非酒精性脂肪性肝病现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人NAFLD患病率10％～30％，其中10％～20％为NASH，后者10年内肝硬化发生率高达25％。非酒精性脂肪性肝病除可直接导致失代偿期肝硬化、肝细胞癌和移植肝复发外，还可影响其他慢性肝病的进展，并参与2型糖尿病和动脉粥样硬化的发病。代谢综合征相关恶性肿瘤、动脉硬化性心脑血管疾病以及肝硬化为影响非酒精性脂肪性肝病患者生活质量和预期寿命的重要因素。为此，非酒精性脂肪性肝病是当代医学领域的新挑战，近期内非酒精性脂肪性肝病对人类健康的危害仍将不断增加。
发明内容
本发明人在研究中出人意料地发现，将亲水性聚合物修饰的GLP-1受体激动剂和亲水性聚合物修饰的胰高血糖素受体激动剂同时使用，无论二者是连接在一起还是独立存在，都表现出远好于单独GLP-1受体激动剂的结果(例如减肥)。而且，在实现更高活性的同时，还大大延长了其在体内的半衰期，减少了给药频率。特别地，本发明的技术方案除了降低体重之外，还能改善肥胖动物体内的脂肪代谢紊乱的症状，长期给药后在动物体内明显降低血清及肝脏甘油三酯和血清总胆固醇含量。为非酒精性脂肪肝的治疗提供了一个新的可能性。
在一个方面中，本发明提供了一种包含药物有效量的GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂分别独立地与亲水性聚合物形成缀合物或者所述GLP-1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂一起与亲水性聚合物形成缀合物。任选地，本发明的药物组合物还包含药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物可用于预防或治疗非酒精性脂肪性肝病、减肥和/或降脂。在另一些实施方案中，本发明的药物组合物可用于抑制对象食欲、降低血清总胆固醇含量和/或降低肝脏中甘油三酯含量。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中所述GLP-1受体激动剂与所述胰高血糖素受体激动剂通过一个亲水性聚合物共价连接形成缀合物。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中所述亲水性聚合物的分子量为2kDa至60kDa，5kDa至50kDa，优选10kDa至40kDa，更优选20kDa至40kDa，特别地15kDa至30kDa，更特别地21kDa至29kDa。特别地，所述聚合物(例如，PEG)的分子量为约2kDa至约50kDa，优选约3kDa至约40kDa，更优选约4kDa至约35kDa，还优选约5kDa至约30kDa，例如约5kDa、约10kDa、约15kDa、约20kDa、21kDa、22kDa、23kDa、24kDa、约25kDa、26kDa、27kDa、28kDa、29kDa、约30kDa、约35kDa、约40kDa和约45kDa以及上述各分子量值之间的任意值。
在一些实施方案中，所述GLP-1受体激动剂选自Exendin-4、Exendin-3和GLP-1。特别地，所述GLP-1受体激动剂选自PB-105(例如其具有如SEQ ID NO:1所示序列)。
在一些实施方案中，所述胰高血糖素受体激动剂是胰高血糖素。特别地，所述胰高血糖素是PB-702(例如其具有如SEQ ID NO:3所示序列，并且其在第12位赖氨酸侧链氨基通过酰胺键连接有半胱氨酸基团)、PB-703(例如其具有如SEQ ID NO:4所示序列，即其中第24位谷氨酰胺替换为半胱氨酸)、PB-740(例如其具有如SEQ ID NO:5所示序列，即其中第29位氨基酸后添加了一个半胱氨酸残基)或PB-741(例如其具有如SEQ ID NO:6所示序列，并且其中第24位谷氨酰胺的侧链“-CO-NH2”被修饰成“-CO-NH-CH2CH2-SH”)。
在一些实施方案中，所述胰高血糖素的序列相比于野生型胰高血糖素序列在一个或更多个位点上被修饰。特别地，所述修饰是在赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸或天冬酰胺的侧链上引入可用于偶联的官能团(如巯基、叠氮基、马来酰亚胺基、氨基、炔基、乙烯基砜、卤素或醛基)，例如在SEQ ID NO:2的12位赖氨酸的侧链上添加半胱氨酸、在SEQ IDNO:2的12位赖氨酸的侧链上添加巯基乙酸、在SEQ ID NO:2的12位赖氨酸的侧链上添加巯基丙酸、在SEQ ID NO:2的24位谷氨酰胺的侧链上添加巯基乙基、在SEQ ID NO:2的24位谷氨酰胺的侧链上添加巯基丙基以及在SEQ ID NO:2的24位谷氨酰胺的侧链上添加巯基丙酸。另外的或者作为替代的，所述修饰为半胱氨酸添加或替换，例如SEQ ID NO:2的24位谷氨酰胺替换为半胱氨酸、SEQ ID NO:2的12位赖氨酸替换为半胱氨酸和/或SEQ ID NO:2的29位之后添加半胱氨酸。
在一些实施方案中，所述亲水性聚合物选自以下聚合物：多糖、多肽、聚亚烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、马来酸丙烯酸共聚物、聚酯、聚缩醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亚氨碳酸酯、聚酰胺、乙烯基醚马来酸酐共聚物、苯乙烯马来酸酐共聚物以及以上聚合物的共聚物。特别地，所述亲水性聚合物选自聚亚烷基二醇，例如聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，所述GLP-1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂的摩尔比为1:0.001至1:1000，优选1:0.01至1:100，更优选1:0.03至1:50，最优选1:0.1至1:30，特别地1:0.5至1:20，更特别地1:1至1:10，例如1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30以及上述各比例之间的任意值。
在又一个方面中，本发明提供了药物组合物，其包含PEG化的GLP-1受体激动剂和PEG化的胰高血糖素受体激动剂。特别地，所述PEG化的GLP-1受体激动剂选自：PB-119、PB-120和PB-107，以及所述PEG化的胰高血糖素受体激动剂选自：PB-707、PB-708、PB-709、PB-713、PB-721和PB-722。
在另一个方面中，本发明提供了包含GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的缀合物，其中所述GLP-1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂通过亲水性聚合物形成缀合物。
在本发明的缀合物中，GLP-1受体激动剂和/或胰高血糖素受体激动剂与亲水性聚合物直接或者通过接头相缀合。
在又一个方面中，本发明提供了具有通式X1-Z1-Y-Z2-X2的缀合物，其中X1表示GLP-1受体激动剂，X2表示胰高血糖素受体激动剂，Y表示亲水性聚合物，Z1表示第一接头，和Z2表示第二接头。特别地，本发明提供了具有式Exendin-4–Z1–PEG–Z2–胰高血糖素的缀合物，例如具有式PB105-PEG-PB703的缀合物(如PB-716、PB-717、PB-718、PB-719、PB-720)。
在本发明中，所述接头、所述第一接头和/或所述第二接头分别独立地包含反应性基团(例如马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基或其他具有高化学反应活性的基团)的活化形成的基团。更优选地，所述反应性基团选自：马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜和二硫键。
在本发明中，所述接头、所述第一接头和/或所述第二接头分别独立地包含被活化的反应性基团(例如马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基或其他具有高化学反应活性的基团)。更优选地，所述反应性基团选自：马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜和二硫键。
在一些实施方案中，所述亲水性聚合物是被活化的从而与所述GLP-1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂相缀合，优选地所述聚合物为经修饰的带有反应性基团的聚合物，使得所述聚合物通过所述反应性基团的活化与所述GLP-1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂相缀合，更优选地所述反应性基团选自：马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基以及其他具有高化学反应活性的基团。
在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含选自下列的项：PB-721和PB-119之组合、PB-722和PB-119之组合、以及PB-708和PB-120之组合；或者其包含选自下列的项：PB-716、PB-717、PB-718、PB-719和PB-720。具体地，PB-119、PB-120、PB-707、PB-708、PB-709、PB-713、PB-716、PB-717、PB-718、PB-719、PB-720、PB-721、PB-722的结构如表1中所示。
在又一个方面中，本发明提供了药盒，其包含根据本发明的药物组合物或的缀合物，以及任选地包含使用说明书。
在又一个方面中，本发明提供了本发明的组合物或本发明的缀合物在制备用于预防或治疗非酒精性脂肪性肝病、减肥和/或降脂的药物中的用途。
在又一个方面中，本发明提供了本发明的组合物或本发明的缀合物在制备用于抑制对象食欲、降低血清总胆固醇含量和/或降低肝脏中甘油三酯含量的药物中的用途。
在又一个方面中，本发明提供了如上所述的组合物或缀合物，其用于预防或治疗非酒精性脂肪性肝病、减肥和/或降脂。
在又一个方面中，本发明提供了如上所述的组合物或缀合物，其用于抑制对象食欲、降低血清总胆固醇含量和/或降低肝脏中甘油三酯含量。
在又一个方面中，本发明提供了用于预防或治疗非酒精性脂肪性肝病、减肥和/或降脂的方法，其包括向有此需要的对象施用根据本发明的组合物或缀合物。
在又一个方面中，本发明提供了用于抑制对象食欲、降低血清总胆固醇含量和/或降低肝脏中甘油三酯含量的方法，其包括向有此需要的对象施用根据本发明的组合物或缀合物。
本发明人还出人意料地发现，本发明的组合物和缀合物大大降低了维持所需效果需要的给药频率。在某些实施方案中，本发明的缀合物每至少30天、每至少25天、每至少20天、每至少15天、每至少10天、每至少9天、每至少8天、每至少7天、每至少6天、每至少5天、每至少4天、每至少3天、每至少2天、每至少1天一次向所述对象施用。在某些实施方案中，本发明的缀合物每至多30天、每至多25天、每至多20天、每至多15天、每至多10天、每至多9天、每至多8天、每至多7天、每至多6天、每至多5天、每至多4天、每至多3天、每至多2天、每至多1天一次向所述对象施用。
本发明的组合物和缀合物大大降低了给药频率，增加了对象的顺从性。
本发明的组合物和缀合物可用于防止体重增加或促进体重减轻。“防止”是指与不进行治疗相比抑制或减少体重增加，而不必然指体重增加的完全停止。本发明的组合物和缀合物可引起食物摄取的减少和/或能量消耗的增加，从而导致对体重的可见作用。不依赖于其对体重的作用，本发明的组合物和缀合物可对葡萄糖耐受和循环胆固醇水平具有有益作用(例如，可降低循环LDL水平并提高HDL/LDL比值)。因此，本发明化合物可用于直接或间接治疗由体重超重引起或以其为特征的任何病症，例如治疗和/或预防肥胖症、病态肥胖、肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病、肥胖引起的睡眠呼吸暂停。本发明的组合物和缀合物还可用于治疗代谢综合征、胰岛素抗性、葡萄糖不耐受、2型糖尿病、高血压、致动脉粥样化血脂异常(atherogenic dyslipidimia)、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病或中风。它们在这些病症中的作用可由它们对体重的作用引起或与其有关，或者可不依赖于其对体重的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1显示了PB-716纯化图谱；
图2显示了PB-717纯化图谱；
图3显示了PB-718纯化图谱；
图4显示了PB-719纯化图谱；
图5显示了PB-720纯化图谱；
图6显示了PB-716系列化合物单次给药对DIO小鼠体重的影响；
图7显示了PB-716系列化合物连续给药对DIO小鼠累积摄食的影响；
图8显示了14天连续给药后给药各组累积摄食相对模型对照组下降率；
图9显示了PB-716系列化合物连续给药对DIO小鼠体重的影响；
图10显示了PB-716系列化合物连续给药后DIO小鼠体重下降率；
图11显示了PB-716系列化合物长期给药对DIO小鼠随机血糖的影响；
图12显示了化合物PB-718、PB-119及复方(PB-708+PB-120)连续给药对DIO小鼠体重的影响；
图13显示了PB-718、PB-119及复方(PB-708+PB-120)连续给药后DIO小鼠体重下降率；
图14显示了化合物PB-718、PB-119及复方(PB-708+PB-120)长期给药对DIO小鼠累积摄食的影响；
图15显示了14天连续给药后累积摄食相对模型对照组下降率；
图16显示了PB-718、PB-119及复方(PB-708+PB-120)连续给药后对DIO小鼠随机血糖的影响；
图17显示了长期给药对DIO小鼠随机体重的影响；
图18显示了长期给药后DIO小鼠随机体重下降率；
图19显示了长期给药对DIO小鼠摄食的影响；
图20显示了长期给药后DIO小鼠累积摄食量下降率；
图21显示了长期用药对DIO小鼠血清甘油三脂水平的影响；
图22显示了长期给药对DIO小鼠肝脏甘油三酯含量的影响；
图23显示了长期给药对DIO小鼠血清总胆固醇含量的影响。
具体实施方式
定义
本文中使用的术语“接头”、“第一接头”、“第二接头”等表示在本发明中将聚合物和生物活性分子相连接的基团、片段、化学键或者任何起到连接作用的实体(entity)。在本发明中，所述接头可以包含活化基团(例如马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基或其他具有高化学反应活性的基团)，例如MAL、ppMAL等。
本文中所述的“聚乙二醇”具有本领域普通技术人员通常理解的含义，既包括聚乙二醇(含不同结构的如线性、支链、星型等分叉结构)本身，也包括其末端修饰的衍生物，除非另有明确说明。例如，所述PEG是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。在本文中，如果没有特别指明，所述聚乙二醇(PEG)既包括末端基团为羟基也包括末端为其它基团的类型。所述其它基团包括但不限于烷氧基、环烷氧基、环烷基氧基、烯基、芳氧基或芳烷基氧基。这些PEG分子类型都是现有技术中已知的，并且在多肽修饰中常规使用。PEG侧链可以是线性的、分枝的、分叉的或者由多个臂组成，不同的聚乙二醇可以具有不同的聚合链长度和聚合结构。
本文中所述“缀合物”，是指具有生物活性的分子(例如GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂)与聚乙二醇分子直接或者通过接头共价连接后形成的产物。
此外，对于聚合物如聚乙二醇来说，有多种方法测定其分子量。由于聚合物是由一定分布范围内的不同聚合度的分子构成，一般用平均分子量表示聚合物的分子量。具体来说可以是数均分子量，或重均分子量。尽管在聚合物的聚合度差异较大时，数均分子量和重均分子量可能有一些偏差，但是对于分布范围较窄的聚合物来说，二者趋于相等。对于本文提及的聚合物如聚乙二醇，在提及其分子量时，既可以是重均分子量，也可以是数均分子量，优选数均分子量。
本文所述的“GLP-1受体激动剂”是指具有GLP-1受体激动作用的物质，例如野生型GLP-1及其变体(例如GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7-36)酰胺)、野生型exendin-4及其变体、野生型exendin-3及其变体。在一些实施方案中，本发明的GLP-1受体激动剂与亲水性聚合物形成的缀合物是长效的。在另一些实施方案中，本发明的GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂一起与亲水性聚合物形成的缀合物是长效的。
本文所述的“胰高血糖素受体激动剂”是指具有胰高血糖素受体激动作用的物质，例如野生型胰高血糖素及其变体。例如，所述胰高血糖素是PB-702(例如其具有如SEQ IDNO:3所示序列，并且其在第12位赖氨酸侧链氨基通过酰胺键连接有半胱氨酸基团)、PB-703(例如其具有如SEQ ID NO:4所示序列，即其中第24位谷氨酰胺替换为半胱氨酸)、PB-740(例如其具有如SEQ ID NO:5所示序列，即其中第29位氨基酸后添加了一个半胱氨酸残基)或PB-741(例如其具有如SEQ ID NO:6所示序列，并且其中第24位谷氨酰胺的侧链“-CO-NH2”被修饰成“-CO-NH-CH2CH2-SH”)。在一些实施方案中，本发明的胰高血糖素受体激动剂与亲水性聚合物形成的缀合物是长效的。
本文所述的“Exendin-4”是指在毒蜥的唾液分泌物中发现的多肽(J.Biol.Chem,265,20259-20262,1990；J.Biol.Chem,267,7402-7405,1992)以及基本上保持了GLP-1受体激动作用的其变体。野生型Exendin-4与GLP-1(7-36)具有高度同源性(53％)，其序列为
His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser，SEQ ID NO:7)。
本文所述的“胰高血糖素”是指对应于前胰高血糖素原的53至81位氨基酸的多肽(具有如SEQ ID NO:2所示的序列：
His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr)以及基本上保持了胰高血糖素受体激动作用的其变体。
本文使用的术语“长效”在用于受体激动剂时，意指其给药频率至多1天1次，优选至数天，例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、15天、20天、25天、30天、40天、50天或更长。
术语例如“包含”、“含”、“含有”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。
本文中所述的“变体”和“功能性变体”可互换使用，其是指经过修饰或改变的生物学分子，优选地所述变体仍保持其生物学活性。例如，多肽的“变体”是指通过一个或多个取代、缺失、插入、融合、截短或其任意组合在氨基酸序列上有所不同的多肽。变体多肽可以是完全功能性的或者可缺乏一种或多种活性的功能。完全功能性变体可含有例如仅仅保守性改变或非关键残基或非关键区域的改变。功能性变体还可包含相似氨基酸的替换，其导致功能未改变或不显著的改变。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考CurrentProtocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
本文使用的术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本发明的缀合物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
根据本发明的药物组合物可通过任何适宜的途径施用，例如可口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉内施用。
本文使用的“药物有效量”、“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如野生动物(如苍鹭、鹳、鹤等)，家畜(如鸭、鹅等)或实验动物(如猩猩、猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠、土拨鼠、地松鼠等)。
尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数涵盖近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。
另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。
提供了以下实施例以证明并进一步解释本发明的一些优选的实施方式和方面，不应被解释为限制其范围。
表1.本发明所涉及的生物活性分子
Figure BDA0003081031100000091
Figure BDA0003081031100000101
注：下划线显示修饰
实施例1：PB-119(PB-105与mPEG-ppMAL-23KD的缀合物)的制备
称取10mgPB-105(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和65mg的mPEG23KD–ppMAL(派格生物医药公司生产)于50mL玻璃容器瓶中(PB-105与PEG摩尔比为1:1.2)，用5ml0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调pH至4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的10mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)洗脱过量的PEG，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱10个柱体积梯度洗脱到30％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。
实施例2：PB-120(PB-105与mPEG-ppMAL-25KD的缀合物)的制备
称取10mgPB-105(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和72mg的mPEG25KD–ppMAL(派格生物医药公司生产)于50mL玻璃容器瓶中(PB-105与PEG摩尔比为1:1.2)，用5ml 0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调pH至4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的10mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)洗脱过量的PEG，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱10个柱体积梯度洗脱到30％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。
实施例3：PB-107(PB-105与mPEG-ppMAL-30KD的缀合物)的制备
称取10mgPB-105(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和86mg的mPEG30KD–ppMAL(派格生物医药公司生产)于50mL玻璃容器瓶中(PB-105与PEG摩尔比为1:1.2)，用5ml 0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的10mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)洗脱过量的PEG，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱10个柱体积梯度洗脱到30％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。
实施例4：PB-707(PB-703与mPEG-ppMAL-23KD的缀合物)的制备
称取10mgPB-703(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和100mg的mPEG-ppMAL-23KD(派格生物医药公司生产)于50mL玻璃容器瓶中(PB-703与PEG摩尔比为1:1.5)，用5ml 0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的10mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)洗脱过量的PEG，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱15个柱体积梯度洗脱到30％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。
实施例5：PB-708(PB-703与mPEG-ppMAL-25KD的缀合物)的制备
称取10mgPB-703(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和110mg的mPEG-ppMAL-25KD(派格生物医药公司生产)于50mL玻璃容器瓶中(PB-703与PEG摩尔比为1:1.5)，用5ml0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的10mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)洗脱过量的PEG，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱15个柱体积梯度洗脱到30％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。
实施例6：PB-709(PB-703与mPEG-ppMAL-30KD的缀合物)的制备
称取10mgPB-703(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和130mg的mPEG-ppMAL-30KD(派格生物医药公司生产)于50mL玻璃容器瓶中(PB-703与PEG摩尔比为1:1.5)，用5ml0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的10mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)洗脱过量的PEG，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱15个柱体积梯度洗脱到30％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。
实施例7：PB-713(PB-703与mPEG-ppMAL-40KD的缀合物)的制备
称取10mgPB-703(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和175mg的mPEG-ppMAL-40KD(派格生物医药公司生产)于50mL玻璃容器瓶中(PB-703与PEG摩尔比为1:1.5)，用5ml0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的10mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)洗脱过量的PEG，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱15个柱体积梯度洗脱到30％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。
实施例8：PB-721(PB-740与mPEG-ppMAL-23KD的缀合物)的制备
称取10mgPB-740(购买于中肽生化有限公司)和96mg的mPEG-ppMAL-23KD(派格生物医药公司生产)于50mL玻璃容器瓶中(PB-740与PEG摩尔比为1:1.5)，用5ml 0.2MpH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的10mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)洗脱过量的PEG，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱15个柱体积梯度洗脱到30％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。
实施例9：PB-722(PB-741与mPEG-ppMAL-23KD的缀合物)的制备
称取10mgPB-741(购买于中肽生化有限公司)和97mg的mPEG-ppMAL-23KD(派格生物医药公司生产)于100mL玻璃容器瓶中(PB-741与PEG摩尔比为1:1.5)，用5ml 0.2MpH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的10mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)洗脱过量的PEG，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱15个柱体积梯度洗脱到300％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。
实施例10：PB-716(PB-703和PB-105与PEG-(ppMAL)2-40KD的缀合物)的制备
称取20mgPB-105(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)、21mg PB-703(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和158.6mg的PEG-(ppMAL)2-40KD(派格生物医药公司生产)于50mL玻璃容器瓶中(PEG:PB-105:PB-703投料摩尔比为1:1.2:1.5)，用:10mL0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的20mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)平衡3-4个柱体积，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱30个柱体积梯度洗脱到40％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％目标物组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。PB-716的纯化图谱在图1中示出。
实施例11：PB-717(PB-703和PB-105与PEG-(ppMAL)2-30KD的缀合物)的制备
称取20mgPB-105(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)、21mg PB-703(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和119mg的PEG-(ppMAL)2-30KD(派格生物医药公司生产)于100mL玻璃容器瓶中(PEG:PB-105:PB-703投料摩尔比为1:1.2:1.5)，用:10mL0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的20mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)平衡3-4个柱体积，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱30个柱体积梯度洗脱到40％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％目标物组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。PB-717的纯化图谱在图2中示出。
实施例12：PB-718(PB-703和PB-105与PEG-(ppMAL)2-25KD的缀合物)的制备
称取20mgPB-105(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)、21mg PB-703(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和99mg的PEG-(ppMAL)2-25KD(派格生物医药公司生产)于100mL玻璃容器瓶中(PEG:PB-105:PB-703投料摩尔比为1:1.2:1.5)，用:10mL0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并在室温(25℃)下搅拌反应1小时，并用盐酸调至pH4.0终止反应，4℃下放置纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的20mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)平衡3-4个柱体积，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱30个柱体积梯度洗脱到40％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％目标物组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。PB-718的纯化图谱在图3中示出。
实施例13：PB-719(PB-703和PB-105与PEG-(ppMAL)2-20KD的缀合物)的制备
称取20mgPB-105(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)、21mg PB-703(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和79.3mg的PEG-(ppMAL)2-20KD(派格生物医药公司生产)于100mL玻璃容器瓶中(PEG:PB-105:PB-703投料摩尔比为1:1.2:1.5)，用:10mL0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并室温(25℃)搅拌反应1小时，并用盐酸调pH4.0终止反应，放置4℃纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的20mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)平衡3-4个柱体积，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱30个柱体积梯度洗脱到40％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％目标物组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。PB-719的纯化图谱在图4中示出。
实施例14：PB-720(PB-703和PB-105与PEG-(ppMAL)2-10KD的缀合物)的制备
称取20mgPB-105(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)、21mg PB-703(购买于成都凯捷生物医药科技发展有限公司)和39.7mg的PEG-(ppMAL)2-10KD(派格生物医药公司生产)于100mL玻璃容器瓶中(PEG:PB-105:PB-703投料摩尔比为1:1.2:1.5)，用:10mL0.2M pH6.5的PBS缓冲液溶解，并室温(25℃)搅拌反应1小时，并用盐酸调pH4.0终止反应，放置4℃纯化备用。
将上述反应液用超纯水稀释5倍后，并用醋酸调pH至4.0，上样于用缓冲液A(20mMpH 4.0的HAc-NaAc)平衡过3-4个柱体积的20mL Macrocap SP的阳离子交换柱，上样完后用缓冲液A(20mM pH 4.0的HAc-NaAc)平衡3-4个柱体积，然后用洗脱液B(20mM pH4.0HAc-NaAc+1M NaCl)洗脱30个柱体积梯度洗脱到40％，等体积收集洗脱峰，并用HPLC分析各收集组份，将纯度大于95％目标物组份混合后定量，为后续药效试验提供样品。PB-720的纯化图谱在图5中示出。
实施例15：聚乙二醇化胰高血糖素的体外EC50
将稳定表达胰高血糖素受体的HEK293细胞(辉源生物科技(上海)有限公司)培养于添加了10％FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)培养基中，放置于37摄氏度，10％CO2的培养箱中培养。将细胞用胰酶(Hyclone)消化并按5X104细胞/100ul密度接种于96孔板，培养16-24小时，弃去原培养基，更换为无血清DMEM培养基，继续培养4小时。加入野生型胰高血糖素、胰高血糖素变体以及聚乙二醇化胰高血糖素(终浓度分别为100nmol/L，30nmol/L，10nmol/L，3nmol/L，1nmol/L，0.3nmol/L，0.1nmol/L，0.01nmol/L)与细胞共同孵育20min，弃去孵药培养基，加入细胞裂解液(cAMP酶联免疫检测试剂盒中附带，R&D Systems)，置-80℃冰箱冻融两次以裂解细胞，低温离心收集上清液。按cAMP酶联免疫检测试剂盒(R&DSystems)说明进行操作，通过绘制标准曲线测定样品孔上清液中cAMP浓度。应用GraphpadPrism软件绘制胰高血糖素与其变构体的量效曲线图，并计算各样品曲线的EC50。
野生型胰高血糖素、胰高血糖素变体以及聚乙二醇化胰高血糖素在细胞水平上均显示出剂量依赖性地增加HEK293/胰高血糖素R细胞内的cAMP含量，其刺激细胞释放cAMP的EC50值如表2所示。
表2：聚乙二醇化胰高血糖素的体外EC50
Figure BDA0003081031100000141
Figure BDA0003081031100000151
实施例16：本发明缀合物长期给药对DIO小鼠的减肥药效学实验
雄性C57BL/6小鼠(常州卡文斯实验动物有限公司)，经高脂饲料(江苏美迪森生物医药有限公司，MD12032，45％kcal)喂养9周，与同龄用普通饲料(苏州双狮实验动物饲料科技有限公司，151113)喂养的小鼠相比体重超出20％以上，判断为肥胖(DIO，Diet-inducedObesity)模型建模成功。DIO小鼠35只，根据体重，随机血糖进行分组，分为7组，每组5只，分别为PB-716组(383μg/kg)，PB-717组(383μg/kg)，PB-718组(383μg/kg)，PB-719组(383μg/kg)，PB-720组(383μg/kg)，Victoza组(200μg/kg)和模型对照组(生理盐水)(剂量均以肽含量计)。第一次给药后各组观察96小时，然后进行第二次给药，随后的试验中，Victoza组每天给药一次，其余各组3天给药一次。连续给药试验共进行14天，试验期间每天测定小鼠体重和摄食，试验开始前及结束后各测定一次随机血糖。
第一次给药后，各组动物和模型对照组相比，体重均有显著下降，结果见图6。给药后48-96小时，Victoza组体重逐步反弹，到96小时，该组小鼠体重与对照组体重相比没有明显差异。PB-720组小鼠在给药后48-96小时体重基本维持恒定，略有反弹。PB-716，PB-717，PB-718和PB-719组小鼠在给药后48小时体重仍保持下降趋势，给药后72-96小时体重略有反弹。和对照组相比，PB-716，PB-717，PB-718和PB-719组单次给药对体重的降低作用可以维持到给药后96小时，说明PEG化之后大大延长了化合物在动物体内的作用时间。
连续给药对DIO小鼠摄食的影响见图7。单次给药后观察96小时，开始连续给药实验，其中Victoza组每天给药一次，其余各组3天给药一次。连续给药开始后的14天内，模型对照组累积摄食呈直线上升趋势，其余各组与对照组相比摄食均有不同程度的下降。到连续给药14天试验结束的时候，PB-716组和Victoza组累积摄食降低得最多，分别达到58.67％和50.82％。PB-720，PB-719，PB-718和PB-717也分别降低了31.83％，34.88％，48.79％和39.63％。图8显示了14天连续给药后给药各组累积摄食相对模型对照组的下降率。
连续给药对DIO小鼠体重的影响见图9和图10。试验结束后，模型对照组体重和给药前相比增长了10.24％，而给药各组体重均有不同程度的下降。其中PB-716组下降最为显著，和给药前相比体重下降了38.03％，与模型对照组比差异具有统计学意义(p＜0.001)。其余各组体重下降情况是：Victoza组较给药前体重下降了15.83％(p<0.05)；PB-720组下降了10.21％(p<0.05)；PB-719组下降了24.73％(p＜0.001)；PB-718组下降了30.25％(p＜0.001)；PB-717组下降了28.11％(p＜0.001)说明PB-716系列化合物长期给药对DIO小鼠体重有明显的抑制作用。
连续给药对DIO小鼠随机血糖的影响见图11。经过9周的高脂饲养，C57BL/6小鼠随机血糖有一定程度的升高，正常饲料喂养组随机血糖的平均值为8.7mmol/L，而高脂肪饲养组小鼠的随机血糖平均值上升了33.3％，达到11.6mmol/L。各组动物给药后，随机血糖均有明显下降，PB-716组下降幅度最大，平均下降了51.06％(p<0.05)，PB-720，PB-719，PB-718也分别下降了29.31％，33.40％和38.89％，与模型对照组比差异都具有统计学意义(p＜0.05)。说明PB-716系列化合物长期给药对DIO小鼠具有降糖作用。
结果显示PB-716系列Exendin-4和胰高血糖素双激动剂缀合物由于连接了PEG分子从而大大延长了化合物在动物体内的作用时间。PB-716系列化合物长期给药对DIO小鼠的摄食有明显的抑制作用，并能显著降低DIO小鼠的体重，其中PB-716的减肥效果最佳。
实施例17：PB-708和PB-120之组合长期给药对DIO小鼠的减肥药效学实验
雄性C57BL/6小鼠(常州卡文斯实验动物有限公司)，经高脂饲料(江苏美迪森生物医药有限公司，MD12032，45％kcal)喂养12周，与同龄用普通饲料(苏州双狮实验动物饲料科技有限公司，151113)喂养的小鼠相比体重超出20％以上，判断为肥胖(DIO，Diet-induced Obesity)模型建模成功。DIO小鼠35只，根据体重，血糖随机分为7组，每组5只，分别为Victoza组(200μg/kg)，PB-718高剂量组(383μg/kg)，PB-718低剂量组(153.2μg/kg)，PB-119组(210μg/kg)，PEG-OXM(天然的GLP-1受体和胰高血糖素受体双激动剂Oxyntomodulin与23KD PEG缀合物)组(222.5μg/kg)，复方给药组(172.9μg/kgPB-708+210μg/kg PB-120)和模型对照组(生理盐水)(剂量均以肽含量计)。Victoza组每天给药一次，其余各组2天给药一次。连续给药试验共进行14天，试验期间每天测定小鼠体重和摄食，试验开始前及结束后各测定一次随机血糖。
长期给药对DIO小鼠体重的影响见图12和图13。试验结束后，模型对照组体重和给药前相比增长了6.30％，而给药各组体重均有不同程度的下降。其中Victoza组较给药前体重下降了15.92％(p<0.05)；PB-119组下降13.33％(p＜0.05)，与Victoza组减肥效果类似。PEG-OXM组仅下降了1.34％(p>0.05)，可能是因为天然的双激动剂Oxyntomodulin针对胰高血糖素和GLP-1受体的激动活性均较弱的缘故。复方给药组和给药前相比体重下降了24.72％，与模型对照组比差异具有统计学意义(p＜0.001)。PB-718在DIO小鼠中的减肥效果呈现剂量相关性，PB-718低剂量组体重下降了18.78％(p＜0.001)，而PB-718高剂量组体重下降了27.38％(p＜0.001)。实验结果表明胰高血糖素和GLP-1受体的双激动剂PB-718和胰高血糖素+GLP-1受体激动剂的复方长期给药对DIO小鼠体重都具有明显的抑制作用，其减肥效果要显著优于单独给予GLP-1受体激动剂PB-119。
长期给药对DIO小鼠摄食的影响见图14和图15。试验期间，模型对照组累积摄食呈直线上升趋势，其余各组与对照组相比摄食均有不同程度的下降。到连续给药14天试验结束的时候，复方组和PB-718高剂量组累积摄食降低得最多，分别达到43.69％和45.34％。PB-718低剂量，PB-119组也分别降低了34.37％和39.95％。
长期给药对DIO小鼠随机血糖的影响见图16。经过12周的高脂饲养，C57BL/6小鼠随机血糖有一定程度的升高，正常饲料喂养组随机血糖的平均值为8.7mmol/L，而高脂肪饲养组小鼠的随机血糖平均值上升了17.3％，达到10.2mmol/L。各组动物给药后，随机血糖均有明显下降，PB-718高剂量组，复方组，PB-119和PB-718低剂量组血糖分别下降了31.61％，31.61％，27.27％，28.30％，与模型对照组比差异都具有统计学意义(p＜0.05)。说明化合物PB-718、长期给药对DIO小鼠具有一定的降糖作用。
实施例18：PB-119与PB-721或PB-722之组合在DIO小鼠中的减肥药效实验
雄性C57BL/6小鼠(常州卡文斯实验动物有限公司)，经高脂饲料(江苏美迪森生物医药有限公司，MD12032，45％kcal)喂养16周，与同龄用普通饲料(苏州双狮实验动物饲料科技有限公司，151113)喂养的小鼠相比体重超出20％以上，判断为肥胖(DIO，Diet-induced Obesity)模型建模成功。DIO小鼠80只，根据体重，血糖随机分为10组，每组8只，分别为模型对照组，PB-119(10nmol/kg)组，PB-721(60nmol/kg)组，PB-722(60nmol/kg)组，PB-722(10nmol/kg)+PB-119(10nmol/kg)组，PB-722(30nmol/kg)+PB-119(10nmol/kg)组，PB-722(60nmol/kg)+PB-119(10nmol/kg)组，PB-722(100nmol/kg)+PB-119(10nmol/kg)组，PB-722(150nmol/kg)+PB-119(10nmol/kg)组，PB-721(60nmol/kg)+PB-119(10nmol/kg)组和模型对照组(生理盐水)。各组均为皮下给药，两天一次，实验共进行21天，给药11次。实验期间每天测定动物的体重和摄食量，Day1和Day21测定动物的血糖值，Day21测定动物的血清甘油三酯，血清总胆固醇和肝脏甘油三脂等指标。
长期给药对DIO小鼠体重的影响见图17和图18。在试验期间模型对照组动物的体重呈稳定态势，给药各组重均有不同程度的降低。给药结束后，模型对照组动物体重和给药前相比增加0.85％，10nmol/kgPB-119单独给药组的小鼠体重下降了14.37％，60nmol/LPB-721和PB-722单独给药后小鼠体重分别下降了21.65％和21.95％。而同等剂量的复方给药组(10nmol/kgPB-119+60nmol/kgPB-721)和(10nmol/kgPB-119+60nmol/kgPB-722)小鼠体重分别下降了47.18％和40.02％，其体重下降率超过了复方的两个成分单独给药造成的下降率的叠加。说明复方的两个成分同时使用对DIO小鼠体重的下降具有协同效应。
此外，本发明人还出人意料地发现，GLP-1受体激动剂(即PB-119)与胰高血糖素受体激动剂(即PB-722)的摩尔比在某个区间中时，减肥效果出乎意料的好。可参见PB-722(60nmol/kg)+PB-119(10nmol/kg)组，PB-722(100nmol/kg)+PB-119(10nmol/kg)组，PB-722(150nmol/kg)+PB-119(10nmol/kg)组的数据。
长期给药对DIO小鼠摄食量的影响见图19和图20。PB-119，PB-721和PB-722单独给药对DIO小鼠的食欲有一定的抑制作用，而PB-119和PB-721联合使用或是PB-119和PB-722联合使用对DIO小鼠的食欲产生的强烈的抑制作用，其抑制效果比二者单独给药的叠加更为显著。相对于模型对照组的老鼠，10nmol/kgPB-119，60nmol/kgPB-721和60nmol/kgPB-722单独给药组累计摄食分别下降了25.14％，2.36％和9.11％。10nmol/kgPB-119和60nmol/kgPB-721的复方给药组累计摄食下降了61.44％,而10nmol/kgPB-119和60nmol/kgPB-722的复方给药组累计摄食下降了50.56％。
血清甘油三酯，血清总胆固醇和肝脏甘油三脂结果见图21，图22和图23。模型对照组DIO小鼠的总胆固醇和肝脏甘油三脂水平均明显高于正常对照组，表现出较明显的脂代谢紊乱状态。10nmol/kgPB-119和60nmol/kgPB-721,60nmol/kgPB-722单独长期给药对DIO小鼠的血清甘油三脂水平没有明显改善。而同等剂量PB-119和PB-721或是PB-119和PB-722的复方给药组小鼠的血清甘油三脂水平和模型对照组相比明显下降(p<0.05)，其下降率分别为32.58％和22.83％。
DIO小鼠肝脏甘油三酯含量明显高于正常对照小鼠(p<0.01)。10nmol/kgPB-119单独给药组小鼠肝脏甘油三酯含量与模型对照组相比，下降了12.67％(p>0.05)；60nmol/kgPB-721,60nmol/kg PB-722单独给药组和复方给药组小鼠肝脏甘油三酯含量和模型对照相比明显下降(p<0.01)，接近正常对照小鼠的肝脏甘油三酯水平，下降率分别为73.29％，76.84％，64.47％和74.48％。
DIO小鼠血清总胆固醇含量明显高于正常对照小鼠(P<0.001)。10nmol/kg PB-119和60nmol/kgPB-721,60nmol/kgPB-722单独长期给药组DIO小鼠的血清总胆固醇含量有所下降(p<0.05)，下降率分别为39.35％，60.86％和60.56％。而同等剂量PB-119和PB-721或是PB-119和PB-722的复方给药组小鼠的血清总胆固醇含量和模型对照组相比明显下降(p<0.001)，其下降率达到了90.85％和91.88％。
以上描述地仅是优选实施方案，其只作为示例而不限制实施本发明所必需特征的组合。所提供的标题并不意指限制本发明的多种实施方案。术语例如“包含”、“含”和“包括”不意在限制。此外，除非另有说明，没有数词修饰时包括复数形式，以及“或”、“或者”意指“和/或”。除非本文另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的意思与本领域技术人员通常理解的相同。
本申请中提及的所有公开物和专利通过引用方式并入本文。不脱离本发明的范围和精神，本发明的所描述的方法和组合物的多种修饰和变体对于本领域技术人员是显而易见的。虽然通过具体的优选实施方式描述了本发明，但是应该理解所要求保护的本发明不应该被不适当地局限于这些具体实施方式。事实上，那些对于相关领域技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的多种变体意在包括在随附的权利要求的范围内。
序列表
<110> 派格生物医药(苏州)股份有限公司
<120> 包含GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的组合物及其用途
<130> MP21009826F
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Cys
35
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 3
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (12)
<223> Xaa（12）=Lys(-Cys)
<400> 3
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Xaa Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 4
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Cys Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 5
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys
20 25 30
<210> 6
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> UNSURE
<222> (24)
<223> Xaa（24）=Gln(-CH2CH2SH)
<400> 6
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Xaa Trp Leu Met Asn Thr
20 25
<210> 7
<211> 39
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser
20 25 30
Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser
35

Claims (15)

1.一种包含药物有效量的GLP-1受体激动剂和胰高血糖素受体激动剂的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂一起与亲水性聚合物形成缀合物。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂与所述胰高血糖素受体激动剂通过一个所述亲水性聚合物共价连接形成缀合物。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述亲水性聚合物的分子量为2kDa至60kDa，5kDa至50kDa，优选10kDa至40kDa，更优选20kDa至40kDa，特别地15kDa至30kDa，更特别地21kDa至29kDa。
4.如前述任一权利要求所述的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂选自Exendin-4、Exendin-3和GLP-1；优选地，所述Exendin-4、Exendin-3和GLP-1的序列相比于野生型序列在一个或更多个位点上被修饰，所述修饰为半胱氨酸添加或替换；更优选地，所述GLP-1受体激动剂为SEQ ID NO.5所示序列。
5.如前述任一权利要求所述的药物组合物，其中所述胰高血糖素受体激动剂是胰高血糖素，所述胰高血糖素的序列相比于野生型胰高血糖素序列在一个或更多个位点上被修饰。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述修饰是在赖氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸或天冬酰胺的侧链上引入可用于偶联的官能团；所述用于偶联的官能团选自巯基、叠氮基、马来酰亚胺基、氨基、炔基、乙烯基砜、卤素和醛基；优选地，所述修饰选自：在SEQ IDNO:2的12位赖氨酸的侧链上添加半胱氨酸、在SEQ ID NO:2的12位赖氨酸的侧链上添加巯基乙酸、在SEQ ID NO:2的12位赖氨酸的侧链上添加巯基丙酸、在SEQ ID NO:2的24位谷氨酰胺的侧链上添加半胱氨酸、在SEQ ID NO:2的24位谷氨酰胺的侧链上添加巯基乙基、在SEQ ID NO:2的24位谷氨酰胺的侧链上添加巯基丙基以及在SEQ ID NO:2的24位谷氨酰胺的侧链上添加巯基丙酸。
7.如权利要求5所述的药物组合物，其中所述修饰为半胱氨酸添加或替换；优选地，所述半胱氨酸添加或替换选自SEQ ID NO:2的24位谷氨酰胺替换为半胱氨酸、SEQ ID NO:2的12位赖氨酸替换为半胱氨酸和SEQ ID NO:2的29位之后添加半胱氨酸。
8.如权利要求1-4任一所述的药物组合物，其中胰高血糖素受体激动剂选自：如SEQ IDNO:3所示序列，并且其在第12位赖氨酸侧链氨基通过酰胺键连接有半胱氨酸基团；如SEQID NO:4所示序列；如SEQ ID NO:5所示序列；以及，如SEQ ID NO:6所示序列，并且其中第24位谷氨酰胺的侧链-CO-NH2被修饰成-CO-NH-CH2CH2-SH。
9.如前述任一权利要求所述的药物组合物，其中所述亲水性聚合物选自以下聚合物：多糖、多肽、聚亚烷基二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚唑啉、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、马来酸丙烯酸共聚物、聚酯、聚缩醛、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚亚氨碳酸酯、聚酰胺、乙烯基醚马来酸酐共聚物、苯乙烯马来酸酐共聚物以及以上聚合物的共聚物；优选所述亲水性聚合物为聚亚烷基二醇；更优选所述亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)。
10.如前述任一权利要求所述的药物组合物，其中所述GLP-1受体激动剂和所述胰高血糖素受体激动剂的摩尔比为1:0.01至1:100，更优选1:0.03至1:50，最优选1:0.1至1:30，特别地1:0.5至1:20，更特别地1:1至1:10。
11.具有通式X1-Z1-Y-Z2-X2的缀合物，其中X1表示GLP-1受体激动剂，X2表示胰高血糖素受体激动剂，Y表示亲水性聚合物，Z1表示第一接头，和Z2表示第二接头。
12.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述第一接头和所述第二接头分别独立地包含被活化的反应性基团，所述反应性基团为马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜、二硫键、巯基、醛基、羰基、O-取代羟氨、活性酯、烯基、炔基、叠氮基或其他具有高化学反应活性的基团，更优选地，所述反应性基团选自：马来酰亚胺、卤素、乙烯基砜和二硫键。
13.根据权利要求11所述的缀合物，其选自：PB-716、PB-717、PB-718、PB-719和PB-720；
PB-716为PB-105-PEG-40KD-(ppMAL)2-PB-703；
PB-717为PB-105-PEG-30KD-(ppMAL)2-PB-703；
PB-718为PB-105-PEG-25KD-(ppMAL)2-PB-703；
PB-719为PB-105-PEG-20KD-(ppMAL)2-PB-703；
PB-720为PB-105-PEG-10KD-(ppMAL)2-PB-703；
其中PB-105的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，PB-703的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
14.如权利要求1-10任一所述的组合物或权利要求11-13任一所述的缀合物在制备用于预防或治疗非酒精性脂肪性肝病、减肥和/或降脂、降血糖的药物中的用途。
15.如权利要求1-10任一所述的组合物或权利要求11-13任一所述的缀合物在制备用于抑制对象食欲、降低血清总胆固醇含量和/或降低肝脏中甘油三酯含量的药物中的用途。
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