CN113456683B

CN113456683B - 野马追的医药用途

Info

Publication number: CN113456683B
Application number: CN202011216100.XA
Authority: CN
Inventors: 曾克武; 屠鹏飞; 张晓雯
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-11-04
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2040-11-04
Also published as: CN113456683A

Abstract

本发明涉及野马追、野马追提取物及其有效部位和活性成分的医药新用途，具体涉及野马追、野马追提取物及其有效部位和野马追倍半萜内酯在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中应用。

Description

野马追的医药用途

技术领域

本发明属于医学和药学领域，具体涉及野马追的医药新用途。

背景技术

脑神经元损伤会引起一系列严重的疾病，其中包括神经退行性疾病、脑卒中后功能障碍等。

阿尔兹海默症(Alzheimer disease，AD)和帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是神经退行性疾病中发病率最高的两类疾病，分别对应于中医学的呆症与颤症。阿尔兹海默症的核心临床表现为患者会出现不同程度的认知功能障碍及行为受限。帕金森病的临床表现为静止性运动障碍、姿势步态障碍及运动迟缓等。由于对上述疾病的发病原因尚没有清楚明确的认识，临床上真正有效的药物十分稀少，大多上市的药物只能提供部分的改善作用，并伴随着不同程度的副作用。

脑卒中(cerebral stroke)又称“中风”、“脑血管意外”(cerebralvascularaccident，CVA)，是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性卒中和出血性卒中。调查显示，城乡合计脑卒中已成为我国第一位死亡原因，也是中国成年人残疾的首要原因。脑卒中后由于高级中枢神经元的损伤，导致患者出现不同程度的运动功能障碍、认知障碍、吞咽障碍、平衡障碍等。

随人口老龄化的加剧，阿兹海默症、帕金森病等神经退行性疾病，以及脑卒中导致的脑损伤日益增加，给患者和社会造成严重的负担。临床上对上述疾病的治疗需求远未得到满足。

研究发现，脑内神经炎症与神经退行性疾病(如阿兹海默病、帕金森症以及多发性硬化等)以及脑卒中的发生、发展有密切关系。小胶质细胞和星形胶质细胞是脑内的免疫细胞，它们在脑损伤和神经退行性疾病发生发展中被生理性和/或非生理性激活，释放大量炎症因子，导致神经元的损伤、变形甚至死亡，使得神经退行性疾病进一步发展，加重脑卒中后的脑损伤。抑制脑内神经炎症为神经退行性疾病的治疗以及脑卒中后脑损伤的恢复提供了一条可能的路径。

但是活性物质是否能够通过血脑屏障，在脑内达到有效的浓度从而发挥作用仍是未知和需要实验证实的。

野马追是菊科植物轮叶泽兰(Eupatorium lindleyanum DC.)的干燥地上部分，其味苦、性平，归肝、脾经，具有化痰止咳、清热解毒、利尿消肿、降压的功效，传统上用于治疗感冒、咳嗽多痰、扁桃体炎、慢性气管炎、支气管炎等。其枝叶入药有解表祛湿、和中化湿之效，主治劳伤咳嗽、无名肿痛等。现代药理学研究发现野马追可止咳、祛痰、平喘，对急性肺损伤、循环系统等疾病具有较好的疗效，同时可降血压、降血脂、预防动脉粥样硬化，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等药理作用。江舟等通过静脉注射油酸诱导大鼠急性肺损伤模型，发现野马追提取液能明显降低中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)和丙二醛(MDA)的含量，说明野马追对急性肺损伤有明显的保护作用(江舟，等.野马追对大鼠急性肺损伤保护作用研究[J].中国药房，2007，18(27)：2094)。仲欢欢等利用角叉菜胶致小鼠足肿胀模型发现，野马追水煎液能够明显抑制以组织液渗出、肿胀为主要表现的急性炎症反应，具有消肿抗炎作用(仲欢欢，等.野马追化学成分及其抗炎活性[J].中成药，2017，39(2)：329-333)。

经研究发现，野马追的化学成分主要有倍半萜内酯类、黄酮类、挥发油、甾体类、有机酸等，此外还含有二萜类、三萜类、微量元素、氨基酸及一些其他成分。据报道，野马追倍半萜类化合物具有较强的抗癌及抗炎生理活性。野马追倍半萜类化合物主要包括愈创木烷型、吉马烷型、桉烷型、杜松烷型，其中以愈创木烷型和吉马烷型居多(陆梦圆，等.中药野马追化学成分及药理作用研究进展[J].中国民族民间医药，019，28(9)：37-42)。野马追内酯A(Eupalinolide A)和野马追内酯B(Eupalinolide B)是野马追中具有代表性的吉玛烷型倍半萜内酯类活性化合物，其结构式如I和II所示：

仲欢欢等发现野马追内酯A和B对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放的TNF-α、IL-6具有抑制作用，并且呈现出一定剂量依赖性。

但迄今还未见关于野马追及其提取物或活性成分改善认知障碍、运动障碍的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供野马追在治疗脑神经元损伤引起的神经退行性疾病和脑卒中后的功能障碍等方面的新的医药用途。

为了实现上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：

野马追在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中的应用。

优选地，野马追作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中的应用。

野马追提取物在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中应用。

优选地，野马追提取物作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中的应用。

优选地，所述野马追提取物是指采用本领域能够接受的极性或非极性溶剂，按照本领域常规方法从野马追地上部分提取分离得到的包括多种化学成分的液态或固态物质。

具体地，采用本领域能够接受的极性或非极性溶剂，从野马追地上部分经加热或不加热的提取方法，经过或不经过浓缩，得到的含有或不含有提取溶剂的野马追提取物为野马追总提取物，包括但不限于野马追水总提取物、野马追乙醇总提取物、野马追乙醚总提取物、野马追乙酸乙酯总提取物、野马追总挥发油，等等。

本发明所述野马追提取物还包括上述野马追总提取物经过本领域常规的分离手段，如溶剂萃取、树脂吸附/解析附、柱层析、液相色谱等，得到的一类或多类化学成分相对集中的提取物，如野马追倍半萜内酯部位、野马追黄酮部位、野马追生物碱部位等。

本申请说明书中，如无特殊说明，所述“乙醇”是指体积百分比浓度≤100％的乙醇的水溶液，如10％乙醇、20％乙醇、30％乙醇、40％乙醇、50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、75％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇，等等。

作为一个优选的实施方案，本发明提供野马追倍半萜内酯部位在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中应用。

作为一个优选的实施方案，所述野马追倍半萜内酯部位作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中应用。

优选地，所述野马追倍半萜内酯部位包含结构式III所示的化合物，

本发明还有一个目的在于提供如结构式III所示的化合物、其立体异构体、其外消旋体、以及它们的盐在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中应用；

优选地，所述结构式III所示的化合物、其立体异构体、其外消旋体、以及它们的盐作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中应用。

作为一个优选的实施方案，所述结构式III所示的化合物选自结构式I的野马追内酯A和/或结构式II的野马追内酯B，

优选地，所述脑神经元损伤引起的疾病选自神经退行性疾病和脑卒中后遗症中的一种或多种。

优选地，所述神经退行性疾病选自阿尔兹海默症、帕金森病和多发性硬化症中的一种或多种。

优选地，所述脑卒中后遗症包括脑卒中后运动功能障碍、认知障碍、吞咽障碍和平衡障碍等的一种或多种。

优选地，所述预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病是指防止所述疾病发生、消除已发生的疾病症状、延缓已发生的疾病发展和/或逆转病理过程。

优选地，所述预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物可以和选自他克林、利斯的明、美金刚、

多奈哌齐、加兰他敏、左旋多巴、安齐来、森福罗、息宁、盐酸罗匹尼罗、泰舒达、善为、美多芭、咪多吡、金思平、达灵复中的一种或多种合用。

优选地，所述预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物还包括药学上可以接受的辅料。

优选地，所述预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物可以是口服制剂，也可以是非口服制剂。

更优选的，所述口服制剂可以选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、粉剂、口腔膜剂和口服液中的一种或多种。

更优选的，所述非口服制剂可以选自注射剂、膏剂、霜剂和栓剂中的一种或多种。

本发明还提供一种预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物，所述药物以结构式III所示的化合物、其立体异构体、其外消旋体、以及它们的盐为唯一活性成分，

优选地，所述药物还包括药学上可以接受的辅料。

优选地，所述药物可以是口服制剂，也可以是非口服制剂。

本发明所述药学上可以接受的辅料，包括药学领域常规的溶剂(如水、乙醇、丙二醇、注射用油等)、稀释剂(如淀粉、糖粉、糊精、乳糖、预胶化淀粉、微晶纤维、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸氢钙、药用碳酸钙等)、甘露醇等、植物油、聚乙二醇等)、粘合剂(如水、乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素和乙基纤维素、羟丙甲纤维素等)、崩解剂(如干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠等)、润滑剂(如硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇类、月桂醇硫酸镁等)、吸收促进剂(如表面活性剂、Azone(月桂氮卓酮)、EDTA、水杨酸、氨基酸乙胺衍生物、乙酰醋酸酯类、β-二羧酸酯、芳香族酸性化合物、脂肪族酸等)、防腐剂(如苯甲酸、羟丙丁酯、羟丙甲酯、苯酚、间甲酚等)、矫味剂(如蔗糖、甜菊素等)等。

本发明提供所述预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物，施予对象是有需求的哺乳动物，更优选为有需求的人。当所述药物施予给人时，折合成生药，剂量可以在10～500g/天范围内。

药理实验表明，野马追提取物对LPS诱导的BV-2神经小胶质细胞炎症模型有显著的抑制活性。野马追内酯B能够显著改善认知障碍小鼠空间记忆能力，显示野马追内酯B能明显改善老年痴呆小鼠的认知能力。野马追内酯B可以显著改善MPTP(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶)所致的小鼠自发活动下降，因此野马追内酯B能明显改善帕金森模型小鼠的肢体协调性，增加小鼠的运动。野马追内酯A和野马追内酯B还具有抗神经炎症作用，野马追内酯B能够促进核因子Nrf2核转位激活，通过上调HO-1、CAT蛋白表达抑制由小胶质细胞介导的神经炎症，从而发挥预防、改善和/或治疗脑神经元损伤、神经退行性疾病和/或脑神经炎症相关的疾病(如阿尔兹海默症、帕金森病、脑卒中后认知障碍和/或运动障碍等)的作用。

本发明提供的野马追及其提取物和活性成分的医药新用途能够为临床治疗上述疾病提供一种新的选择。

附图说明

以下结合附图，对本发明做进一步说明。

在以下的附图说明及各附图中，为了便于表示，用“EB”代表野马追内酯B，“EA”代表野马追内酯A，“MPTP”代表1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)，“YMZ”代表实施例6中评价的野马追提取物，“LPS”代表革兰氏阴性菌脂多糖。

在后面的实施例中，上述字母缩写也分别代表了相同的含义。

图1示出了Morris水迷宫实验结果，显示了野马追内酯B(EB)对认知障碍小鼠空间记忆能力的影响。图中标注“正常”组为对照组，“模型”组为模型组，“给药”组为野马追内酯B 50mg/kg剂量组。横轴为实验天数，纵轴为找到平台的时间，即逃避潜伏期。*表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与正常组比较，P＜0.05。

图2示出了转棒实验结果，示出了野马追内酯B(EB)对MPTP诱导的帕金森小鼠自主活动的影响。横轴为实验天数，纵轴为每分钟内掉落频率。*表示与模型组比较，P＜0.05；**表示与模型组比较，P＜0.01；##表示与正常组比较，P＜0.05。

图3示出了野马追内酯B对认知障碍小鼠海马区损伤神经元和小胶质细胞特异性蛋白(Iba-1)表达的影响。左图为尼氏染色结果，图中标注“正常”组为对照组，“模型”组为模型组，“给药”组为野马追内酯B 50mg/kg剂量组。细长三角箭头指示损伤神经元胞体，等边三角箭头指示正常神经元胞体，长箭头指示神经元突触。

图4示出了野马追内酯B对MPTP诱导的帕金森小鼠黑质酪氨酸羟化酶(TH)和小胶质细胞特异性蛋白(Iba-1)表达的影响。图中标注“正常”为对照组，“模型”为模型组，“低剂量”为野马追内酯B10mg/kg剂量组，“高剂量”为野马追内酯B 50mg/kg剂量组。

图5示出了野马追内酯B(EB)和野马追内酯A(EA)对LPS诱导的神经小胶质细胞BV-2一氧化氮因子释放的影响。**表示与模型组比较，P＜0.01；##表示与正常组比较，P＜0.01。

图6示出了实施例5中野马追内酯B(EB)神经保护作用的分子机理，野马追内酯B促进Nrf2的核转移，引发了一系列炎症调节因子—过氧化氢酶(CAT)，血红素加氧酶1(HO-1)的表达。

图7示出了实施例6中野马追提取物(YMZ)对LPS诱导的BV-2神经小胶质细胞炎症模型的影响。YMZ可以显著拮抗LPS诱导的一氧化氮因子释放以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)蛋白表达量的增加。*表示与模型组比较，P＜0.05；**表示与模型组比较，P＜0.01；##表示与正常组比较，P＜0.05。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

如无特殊说明，下述实施例所用原料、试剂、设备、仪器均通过公开的商业渠道购买得到，下述实施例所用方法均为本领域常规方法。其中部分原料、试剂、设备的来源途径为：

野马追内酯B购自宝鸡辰光生物科技有限公司，含量经HPLC鉴定纯度达到98％以上；

野马追内酯A购自宝鸡辰光生物科技有限公司，含量经HPLC鉴定纯度达到98％以上；

野马追购自四川省宁南县上务旭村，经北京大学医学部天然药物学系曾克武助理教授鉴定。

实施例1野马追内酯B对认知障碍小鼠空间记忆能力的影响。

1.1受试动物：20只SPF级雄性12月龄APP/PS1双转基因AD小鼠，体质量30-35g，10只SPF级雄性12月龄正常对照小鼠，体质量30-35g，北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2受试药物：

野马追内酯B(EB)，溶解于0.5％的CMCNa溶液里配制成5mg/ml的药物溶液。

1.3动物分组及处理：

适应性饲养一周后，将小鼠随机分为3组(正常组，模型组，给药组)。给药组按照50mg/kg的剂量给药，正常组和模型组给以20ml/kg的CMCNa溶液。各组给药体积均为20ml/kg，每日下午灌胃1次，持续给药30d。

1.4行为学检测

Morris水迷宫实验灌胃结束后首先对动物进行定位航行试验5d。首先，在水池中第4象限的中心位置放置平台，每只动物每天接受4次试验。当动物被放池中时，立刻点击软件中的开始按钮，开始记录动物的游泳轨迹。软件将在动物找到平台后自动停止记录，若动物60s未能找到平台，则将动物引导至平台上。以动物入水后到找到平台的时间，即逃避潜伏期作为观测指标，最后一次为正式实验。用均数±标准差来表示实验数据，结果采用SPSS16.0统计软件来进行单因素方差分析(ANOVA)，以及组间t检验。#P＜0.05；模型组与给药组比较，*P＜0.05。

1.5检测结果

实验4天各组小鼠平台潜伏期(s)：*表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与正常组比较，P＜0.05。

实验数据示出：APP/PS1小鼠相对于正常小鼠逃避潜伏期明显延长可，而野马追内酯B可以显著改善APP/PS1小鼠的空间记忆能力，这显示野马追内酯B能明显改善老年痴呆小鼠的认知能力(图1)。

实施例2野马追内酯B对MPTP诱导小鼠行为学的改善作用。

2.1受试动物：8-12周龄，22g以上的雄性C57/BL小鼠40只，北京维通利华实验动物技术有限公司。

2.2受试药物：

2.3动物分组及处理：

提前训练3天，将运动不协调的小鼠剔除，随机分为4组(正常组，模型组，低剂量、高剂量组)每组10只。正式实验前，连续两周每天灌胃给药1次，给药剂量分别为10和50mg/kg。除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余3组均腹腔注射MPTP 30mg/kg，正式实验前5天起每天处理1次，于第5天在腹腔注射MPTP 1h后将各组小鼠进行行为学检测。

2.4行为学检测

转棒实验使用YLS-4C型转棒式疲劳仪测试小鼠的转棒行为表现，研究药物对动作协调性和抗疲劳特性的影响。测试前连续训练3d，每天2次，转速为12r/min，训练时间180s。正式测试时，将小鼠置于转棒上，设置转速35r/min，测试小鼠从转棒开始旋转到第一次离开转棒的时间(小鼠运动潜伏期)；记录小鼠掉落转棒的次数。测试时间为180s，每只小鼠重复测3次，每次测试间隔30min，3次结果取平均值，进行统计学分析。用均数±标准差来表示实验数据，结果采用SPSS 16.0统计软件来进行单因素方差分析(ANOVA)，以及组间t检验。P＜0.05具有显著统计学差异。

2.5检测结果

各组小鼠转棒掉落评率比较(次/分钟)：*表示与模型组比较，P＜0.05；**表示与模型组比较，P＜0.01；##表示与正常组比较，P＜0.05。

实验数据示出：

MPTP可明显降低小鼠的自发活动地处，而野马追内酯B可以显著改善MPTP所致的小鼠自发活动下降，这显示野马追内酯B能明显改善帕金森模型小鼠的肢体协调性，增加小鼠的运动(图2)。

实施例3野马追内酯B对认知障碍小鼠海马区损伤神经元和小胶质细胞特异性蛋白(Iba-1)表达的影响。

3.1动物分组及处理

本实施例的动物分组及处理如实施例1“1.3”项下所述。当Morris水迷宫实验结束后，每组随机取3只小鼠进行免疫组化检测。用4％水合氯醛麻醉固定，打开胸腔，分别用生理盐水和4％多聚甲醛固定，开颅取脑。置于4％多聚甲醛中固定一天，用水冲洗，去除组织内固定液及结晶沉淀。将组织依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min。用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂先放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。切片后将蜡片于温水中中展平，捞至玻片上铺正，将载玻片放入45℃温箱中干燥。对玻片进行烘烤，56℃下2h，其后浸入二甲苯洗涤。用含5％山羊血清的TBST缓冲液进行封闭，室温1h。按照一抗说明书上推荐的稀释液及比例进行稀释，4℃孵育过夜。TBST清洗3次，每次5min。二抗孵育后即可进行检测。

3.2检测结果

尼氏染色结果显示，相对于正常组小鼠，APP/PS1小鼠大脑皮层及海马区神经元有明显损伤，表现为突触缩短或消失，胞体皱缩变圆等。而给予野马追内酯B保护可以使神经元有一定程度的恢复，说明野马追内酯B有一定的神经元保护作用。另外，APP/PS1模型小鼠大脑皮层及海马区的Iba-1免疫阳性小胶质细胞显著增加，而野马追内酯B可显著性降低Iba-1免疫阳性小胶质细胞，说明野马追内酯B可以通过抑制小胶质细胞反应性增生来抑制炎症反应(图3)。

实施例4野马追内酯B对MPTP诱导帕金森小鼠脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)和小胶质细胞特异性蛋白(Iba-1)表达的影响。

4.1动物分组及处理

本实施例的动物分组及处理如实施例2的“2.3”项下所述。当转棒实验结束后，每组随机取3只小鼠进行免疫组化检测。用4％水合氯醛麻醉固定，打开胸腔，分别用生理盐水和4％多聚甲醛固定，开颅取脑。置于4％多聚甲醛中固定一天，用水冲洗，去除组织内固定液及结晶沉淀。将组织依次经70％、80％、90％各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95％、100％各2次，每次20min。用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂先放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。切片后将蜡片于温水中中展平，捞至玻片上铺正，将载玻片放入45℃温箱中干燥。对玻片进行烘烤，56℃下2h，其后浸入二甲苯洗涤。用含5％山羊血清的TBST进行封闭，室温1h。按照一抗说明书上推荐的稀释液及比例进行稀释，4℃孵育过夜。TBST清洗3次，每次5min。二抗孵育后即可进行检测。

4.2检测结果

MPTP作用后，黑质TH免疫阳性神经元显著下降，而预先给予野马追内酯B可以使TH阳性神经元有一定程度的增加，说明野马追内酯B有一定的神经元保护作用。另外，MPTP可以使黑质内的Iba-1免疫阳性小胶质细胞显著增加，而野马追内酯B可显著性降低Iba-1免疫阳性小胶质细胞，说明野马追内酯B可以通过抑制小胶质细胞反应性增生来抑制炎症反应(图4)。

实施例5野马追内酯A和野马追内酯B实现抗阿尔兹海默症和帕金森病作用机制研究。

5.1模型建立

本实施例通过LPS诱导的神经小胶质细胞炎症模型，评价野马追内酯A和野马追内酯B抗神经炎活性，进而研究其抗阿尔兹海默症和帕金森病的作用机制。

5.2实验试剂

BV-2神经小胶质细胞系购自中国医学科学院细胞中心，用高糖DMEM培养基(含10％胎牛血清，100U/l青霉素，100μg/l链霉素)进行传代培养，每3天传代1次。革兰氏阴性菌脂多糖(LPS)溶于纯水，配置成1mg/ml的储备液；野马追内酯B溶解于DMSO中，配制成20mM的储备液。

5.3评价方法

一氧化氮释放量评价条件如下：将对数生长期的BV-2细胞以1×10⁵的密度接种于48孔板中，过夜培养至细胞达到对数生长期时处理细胞。设置阴性对照组，炎症模型组，及1、5、10μM 3个剂量浓度组：将空白组更换新鲜培养基，其余组先用LPS(1μg/ml)诱导炎症，给药组同时给以相应浓度的药物处理，培养24h后取上清液，按照NO检测试剂盒说明书操作，用酶标仪在570nm波长下检测NO浓度。弃去剩余培养基后，每孔加入400μl的MTT(0.5mg/ml)溶液，培养4h后，弃去MTT，加入300μl的DMSO，震荡5min后用酶标仪于570nm波长处检测各孔的OD值，计算细胞增值抑制率。用均数±标准差来表示实验数据，结果采用SPSS 16.0统计软件来进行单因素方差分析(ANOVA)，以及组间t检验。P＜0.05具有显著统计学差异。

Western blot实验条件如下：收集各组细胞并用RIPA裂解液(内含蛋白酶抑制剂)裂解细胞，获得总蛋白。然后采用6％-15％ SDS-PAGE分离蛋白，半干法将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭20min，加入一抗(1:1000)，室温孵育2h，充分洗涤，加入二抗(1:1000)，室温孵育1h，充分洗涤后，加ECL试剂显色，在凝胶成像系统上拍照。

5.4试验结果

抗神经炎测试结果表明：与空白对照组相比，LPS使得细胞一氧化氮释放量显著升高，提示造模成功；而野马追内酯A和野马追内酯B作用后，一氧化碳释放水平显著下调，并呈剂量依赖性，这说明野马追内酯A和野马追内酯B可以有效抑制小胶质细胞引发的神经炎症(图5)。

Western blot分析结果表明：与对照组相比，LPS刺激升高了胞浆内转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)的水平；野马追内酯B作用使得胞浆内的Nrf2向胞核内转移。而Nrf2的活化入核引发了一系列炎症调节因子—过氧化氢酶(CAT)，血红素加氧酶1(HO-1)的表达。由此推测，野马追内酯B促进了核因子Nrf2转位激活，通过上调HO-1、CAT蛋白表达起到抗神经炎症效果，从而发挥神经保护作用(图6)。

该独特的作用机理以往未见报道，推测是其抑制小胶质细胞介导的神经炎症所致神经退行性疾病——阿尔兹海默症和帕金森病的作用机制。

实施例6野马追提取物对抗阿尔兹海默症和帕金森病的药理机制研究

本实施例通过LPS诱导的神经小胶质细胞炎症模型，评价野马追提取物抗神经炎活性，进而研究其抗阿尔兹海默症和帕金森病的作用机制。

6.1野马追提取物的制备

将50g野马追药材加10倍体积75％(v/v)乙醇分别加热回流2次，合并回流液，减压浓缩至干燥，得1.6g浸膏，溶解于DMSO中，配制成20mg/ml的储备液。

6.2实验试剂

6.3评价方法

一氧化氮释放量评价条件如下：将对数生长期的BV-2细胞以1×10⁵的密度接种于48孔板中，过夜培养至细胞达到对数生长期时处理细胞。设置阴性对照组，炎症模型组，及12.5、25、50μg/ml 3个剂量浓度组：将空白组更换新鲜培养基，其余组先用LPS(1μg/ml)诱导炎症，给药组同时给以相应浓度的药物处理，培养24h后取上清液，按照NO检测试剂盒说明书操作，用酶标仪在570nm波长下检测NO浓度。弃去剩余培养基后，每孔加入400μl的MTT(0.5mg/ml)溶液，培养4h后，弃去MTT，加入300μl的DMSO，震荡5min后用酶标仪于570nm波长处检测各孔的OD值，计算细胞增值抑制率。用“均数±标准差”来表示实验数据，结果采用SPSS 16.0统计软件来进行单因素方差分析(ANOVA)，以及组间t检验。P＜0.05具有显著统计学差异。

Western blot实验条件如下：收集各组细胞并用RIPA裂解液(内含蛋白酶抑制剂)裂解细胞，获得总蛋白。然后采用6％-15％SDS-PAGE分离蛋白，半干法将蛋白转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭20min，加入一抗(1:1000)，室温孵育2h，充分洗涤，加入二抗(1:1000)，室温孵育1h，充分洗涤后，加ECL试剂显色，在凝胶成像系统上拍照。

6.4试验结果

阴性对照组、炎症模型组和野马追提取物各剂量组的细胞活力没有差异，说明野马追低、中、高各剂量对细胞生长没有影响(图7的左上柱状图)。

与空白对照组相比，LPS使得细胞一氧化氮释放量显著升高，提示造模成功；而野马追提取物作用后，一氧化碳释放水平显著下调，并呈剂量依赖性，这说明野马追提取物可以有效抑制小胶质细胞引发的神经炎症(图7的右上柱状图)。

Western blot分析结果表明：野马追提取物可以显著拮抗LPS诱导的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)蛋白表达量的增加，且具有剂量依赖性趋势，显示出野马追提取物具有良好的抗神经炎症作用(图7的下图)。

总之，本发明提供了野马追及其提取物和单体新医药用途，从而为临床预防、缓解和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病，尤其是脑神经元损伤引起的神经退行性疾病和/或脑卒中后功能障碍提供了新的选择。

Claims

1.野马追提取物作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中的应用，所述脑神经元损伤引起的疾病为帕金森病；所述野马追提取物是野马追乙醇提取物，所述乙醇是指体积百分比浓度≤100%的乙醇的水溶液。

2.结构式II的野马追内酯B及其盐作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物中应用；所述脑神经元损伤引起的疾病为帕金森病

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病是指防止所述疾病发生、消除已发生的疾病症状、延缓已发生的疾病发展和/或逆转病理过程。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物可以和选自他克林、利斯的明、美金刚、多奈哌齐、加兰他敏、左旋多巴、安齐来、森福罗、息宁、盐酸罗匹尼罗、泰舒达、善为、美多芭、咪多吡、金思平、达灵复中的一种或多种合用。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物还包括药学上可以接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗脑神经元损伤引起的疾病的药物是口服制剂或非口服制剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述口服制剂可以选自片剂、胶囊剂、滴丸剂、颗粒剂、粉剂、口腔膜剂和口服液中的一种或多种。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述非口服制剂可以选自注射剂、膏剂、霜剂和栓剂中的一种或多种。