CN113456666B - 一种双载型peg化脂质体及其应用 - Google Patents
一种双载型peg化脂质体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种双载型PEG化脂质体及其应用，以PEG化脂质体为药物储库，以顺铂前药顺‑二氯·反‑二(丁二酸氢根)·顺‑二氨合铂(Ⅳ)(DSCP)和L‑丁硫氨酸‑(S,R)‑亚砜亚胺(L‑BSO)为模型药物。本发明中双载型PEG化脂质体的内水相空腔可同时包载水溶性的DSCP和水溶性的L‑BSO，L‑BSO是γ‑谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCL)的抑制剂，可通过抑制GCL的活性，下调谷胱甘肽(GSH)的合成，增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，逆转肿瘤耐药，进而提高抗肿瘤效果。所得双载型聚乙二醇(PEG)化脂质体粒径小，稳定性好，包封率较高，安全性高，可用于静脉注射，有较大的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于药物制剂新剂型领域，涉及DSCP和L-BSO双载型PEG化脂质体的制备及其在肿瘤治疗中的应用。
背景技术
癌症严重威胁着人类的健康，已成为导致全球民众死亡的第二大因素。化疗是癌症治疗中最常用、最有效的策略之一。顺铂作为一线抗肿瘤药物被广泛应用于多种实体肿瘤的治疗，但其因明显的毒副作用和耐药性，临床应用受到严重限制。与正常细胞相比，由于肿瘤细胞过量产生还原型谷胱甘肽(GSH)(2-10mM)，导致肿瘤细胞内的高还原性微环境，近年来研究表明，这些高浓度的GSH能使铂类药物失活。L-丁硫氨酸-(S,R)-亚砜亚胺(L-BSO)是GSH合成过程中的限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCL)的抑制剂。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种双载型PEG化脂质体及其应用，双载型PEG化脂质体可同时包载两种水溶性药物DSCP和L-BSO，通过抑制GCL活性，降低胞内GSH浓度进而逆转肿瘤顺铂耐药性，从而表现出较好的体外抗肿瘤效果。
一种双载型PEG化脂质体，以PEG化脂质体为药物储库，以顺铂前药和L-丁硫氨酸-(S,R)-亚砜亚胺为模型药物。
优选地，由采用薄膜水化-挤出法制备得到。
优选地，所述顺铂前药和L-丁硫氨酸-(S,R)-亚砜亚胺的摩尔比为12:1-1:12。
优选地，所述薄膜水化-挤出法具体为：将蛋黄卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2K)溶解于二氯甲烷中，旋干成膜，加入所述顺铂前药和L-丁硫氨酸-(S,R)-亚砜亚胺的混合水溶液水化处理，再经脂质体挤出器挤出得到粒径均一的脂质体颗粒，将所述脂质体颗粒离心过滤去除游离药物，得到所述双载型PEG化脂质体(即DSCP/L-BSO Lip)。通过细胞存活率CCK-8实验考察不同摩尔比下DSCP和L-BSO的混合溶液对乳腺癌顺铂耐药(4T1/DDP)细胞存活率的影响，选择最优的摩尔比作为DSCP和L-BSO的投料摩尔比。采用薄膜水化-挤出法制得尺寸小于200nm的脂质体，并用超滤离心法去除游离药物。
优选地，所述顺铂前药和L-丁硫氨酸-(S,R)-亚砜亚胺的摩尔比为1:12。
优选地，所述脂质体颗粒小于200nm。
一双载型PEG化脂质体在肿瘤治疗中的应用。
优选地，所述双载型PEG化脂质体用于肿瘤顺铂耐药的治疗中。
优选地，作用机制是通过抑制限速酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性，下调胞内还原型谷胱甘肽浓度。
本发明通过抑制GCL活性，下调GSH的合成，增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，进而提高抗肿瘤效果。选择的模型药物是水溶性的顺铂前药(顺-二氯反-二羟基顺-二氨合铂(Ⅳ)，DSCP)和L-BSO，依据脂质体封闭的囊状结构(可包载亲水药物)，良好的生物相容性和生物降解性，在二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-甲氧基聚乙二醇2000(DSPE-mPEG2K)的作用下，采用薄膜水化-挤出法制备DSCP和L-BSO双载型聚乙二醇(PEG)化脂质体，该脂质体具有粒径小、包封率较高和稳定性较好，可通过抑制GSH的合成，进而增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，达到协同治疗肿瘤的效果。
综上所述，本发明制备的DSCP/L-BSO Lip可同时包载两种水溶性药物DSCP和L-BSO，通过抑制GCL活性，降低胞内GSH浓度进而逆转肿瘤顺铂耐药性，从而表现出较好的体外抗肿瘤效果，制备方法简便，粒径较小且均一，包封率高，稳定性好。体外细胞实验和体内药动学行为考察证明本发明的DSCP/L-BSO Lip具有较好的抗肿瘤效果，安全性高，可用于静脉注射，有较大的市场应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1DSCP和L-BSO混合溶液与小鼠乳腺癌顺铂耐药(4T1/DDP)细胞作用48h的细胞毒；
图2为本发明实施例2DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip的外观图；
图3(A)为本发明实施例3DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip经粒径测定仪测定得到的粒径分布图，图3(B)为本发明实施例3DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip经粒径测定仪测定得到的zeta电位图；
图4为本发明实施例4DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip的透射电镜图；
图5为本发明实施例5DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip的物理稳定性考察图；
图6为本发明实施例7DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip的体外释放试验数据；
图7为本发明实施例8不同制剂与小鼠乳腺癌顺铂耐药细胞和小鼠乳腺癌(4T1)细胞作用48h的细胞毒；
图8为本发明实施例9不同制剂处理小鼠乳腺癌顺铂耐药细胞和小鼠乳腺癌(4T1)细胞24h后胞内GSH的浓度。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
DSCP和L-BSO投料比的筛选：
配制不同比例DSCP和L-BSO混合溶液：称取适量的DSCP和L-BSO，采用去离子水溶解，按照不同摩尔比(12:1、6:1、3:1、1:1、1:3、1:6、1:12)配制一组DSCP和L-BSO的混合溶液。
采用CCK-8实验考察不同比例DSCP和L-BSO的混合溶液对4T1/DDP细胞存活率的影响：将DSCP和L-BSO的混合溶液在无菌操作台中经0.22μm无菌滤膜过滤除菌，采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释。取处于对数生长期的4T1/DDP细胞，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释成3×104个/cells/mL接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h。弃去培养基，加入不同比例实验组(DSCP:L-BSO：12:1、6:1、3:1、1:1、1:3、1:6、1:12，其中DSCP的浓度为30μM)，实验设阴性对照组(给药浓度为0)，每组平行6个孔。给药48h后，倒出培养基，加入不含血清的培养基稀释10倍的CCK-8溶液，每孔100μL，3h后用酶标仪在450nm测定OD值，计算各组细胞生存率。结果见图1(A)所示。
同时，L-BSO溶液剂对4T1/DDP细胞存活率的实验和上述过程相同，除了不加入DSCP(结果如图1(B)所示)。
图1结果表明，L-BSO的细胞毒性较小，当DSCP和L-BSO混合溶液的摩尔比为1:12时，4T1/DDP细胞的存活率最低，协同抗肿瘤效果最好。因此，选择1:12作为DSCP和L-BSO的投料摩尔比。
实施例2：
DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip的制备与外观比较：
根据实施例1的结果，分别称量DSCP 4mg和L-BSO 20mg，溶于4mL去离子水，形成DSCP和L-BSO的混合溶液。
采用薄膜水化-挤出法制备目标尺寸大小(示例性地，小于200nm)的脂质体，并用超滤离心法去除游离药物。薄膜水化-挤出法具体如下：称取蛋黄卵磷脂127.77mg，胆固醇42.53mg和DSPE-mPEG2K42.51 mg置于250mL茄形瓶中，加入20mLCH2Cl2形成脂质体溶液，旋蒸除去CH2Cl2，制成均一的脂质体膜，25℃真空干燥，加入DSCP和L-BSO混合溶液(含4mgDSCP和20mg L-BSO的去离子水溶液)，磁力搅拌5min，再加入4mL去离子水，磁力搅拌2.5h，即得到粗制的DSCP/L-BSO Lip。将其过0.22μm滤膜，采用脂质体挤出器(200nm膜)挤出20次，即得到具有乳光的DSCP/L-BSO Lip。采用超滤离心管，3000rpm离心20min去除游离药物，即得所需的DSCP/L-BSO Lip。
按照上述相同的方法制备DSCP/L-BSO Lip的对照组DSCP Lip，步骤相同，只需将DSCP和L-BSO的混合溶液换成DSCP单溶液。
取DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip置透光容器中观察外观，如图2所示，可看出DSCPLip和DSCP/L-BSO Lip外观均为乳白色的液体，具有淡蓝色乳光。
实施例3：
采用粒径测定仪测定实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip的粒径和zeta电位。将定实施例2制备的DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip用去离子水稀释10倍，采用MalvernZetasizer粒度仪测定粒径分布和Zeta电位，结果如图3和表1所示，表1为粒径分布和Zeta电位的具体数值。
图3和表1结果表明，DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip的平均粒径分别为143.66±1.25nm和154.88±2.67nm，Zeta电位分别为-42.10±0.12mV和-42.84±0.07mV，PDI分别为0.13±0.01和0.12±0.01。
表1
实施例4：
DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip的透射电镜图，如图4所示。
采用透射电镜(Transmission electron microscopy，TEM)观察实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip的形态。具体过程如下：采用去离子水将实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip稀释300倍，滴加到碳膜覆盖的铜网(200目)上静置1min，自然干燥后用2％的磷钨酸溶液负染2min，在TEM下观察脂质体的形态。
图4结果显示实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip形态圆整，呈球状，分散均匀，大小均一。
实施例5：
DSCP/L-BSO Lip和和对照组DSCP Lip的物理稳定性考察，结果如图5所示。
以粒径为考察指标，考察实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip在10％大鼠血浆pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中的稳定性。具体操作过程是：将1mL实施例2制备的脂质体与9mL 10％大鼠血浆pH 7.4PBS溶液混合均匀后，置于37℃，100rpm摇床中，分别于0.5、2、4、8、12、24、48和72h测定实施例2制备的脂质体的粒径变化，每组平行三次实验。
以粒径为考察指标，采用纯水将实施例2制备的脂质体稀释10倍，考察实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip在4℃储存一个月的长期稳定性。
图5结果表明实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip具有较好的血浆稳定性和长期稳定性，这可能与脂质体表面存在PEG水化层和-40左右的zeta电位有关，脂质体粒子之间存在空间排斥作用，稳定性较高。
实施例6：
DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip的包封率和载药量的测定，测定结果见表2。
DSCP标准曲线的建立：采用高效液相色谱法(HPLC)测定DSCP的浓度。色谱条件：YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇：0.5％磷酸水(45:55，V/V)；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；波长：220nm；进样量：10μL。
配制浓度为1、5、10、25、50和100μg/mL的DSCP水溶液，HPLC测定，以峰面积对质量浓度进行线性拟合，得回归方程y＝0.460x-0.157，R2＝1，表明在1-100μg/mL浓度范围内DSCP线性关系良好。
L-BSO标准曲线的建立：根据文献报道，邻苯二酚与高碘酸钠反应生成相应的邻醌，反应迅速，形成的邻醌是高活性的有色中间体(吸收带约390nm)，容易受到亲核攻击，能与L-BSO发生反应生成有色中间体。实验以邻苯二酚为衍生剂使L-BSO衍生化，利用紫外可见分光光度计对L-BSO衍生物进行检测和定量，具体如下：向2mL样品溶液中添加0.5mL含邻苯二酚的PH 7.4PBS溶液(2.4mM＝0.26mg/mL)，随后添加0.5mL含高碘酸钠的超纯水或PBS溶液(4.8mM＝1.03mg/mL)，60s后在503nm固定波长下测定L-BSO衍生物的吸收。在L-BSO衍生化的过程中，会观察到无色(邻苯二酚)-黄色(邻醌)-红色的颜色变化过程。
配制浓度为1000、800、500、300、200和100μg/mL的L-BSO水溶液，按上述方法测定，以吸光值对质量浓度进行线性拟合，得回归方程y＝0.0008x+0.0541，R2＝0.9962，表明在100-1000μg/mL浓度范围内L-BSO线性关系良好。
DSCP和L-BSO包封率和载药量的测定：采用超滤离心法测定DSCP和L-BSO的包封率和载药量。取3mL实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip至超滤离心管中，3000rpm条件下离心20min，精密吸取滤液并定容，稀释适当倍数后，过0.45μm滤膜，采用高效液相色谱法(HPLC)和紫外-可见分光光度法(UV-Vis)下测定，计算DSCP和L-BSO的包封率(EE)和载药量(DL)。
表2结果表明，实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip，DSCP的EE和DL分别在70％和1％左右；对于L-BSO，在实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip中的EE和DL分别为72.78％和6.37％。从表中可看出，DSCP和L-BSO的包封率均在70％左右，表明DSCP和L-BSO在脂质体中的摩尔比仍在1:12左右，这将有利于表现出较好的协同抗肿瘤作用。
表2
实施例7：
DSCP/L-BSO Lip和对照组DSCP Lip的体外释放考察，结果如图6所示。
采用透析法考察实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip在pH 7.4PBS中的释药行为。精密量取一定体积的实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip分别装入预处理好的透析袋中，平行3份，除去袋内的气泡，两端系好，放入50mLpH 7.4PBS释放介质中，于恒温摇床上震荡(37℃，120r·min-1)，分别在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h时间点取样1mL，并每次补加1mL新鲜的释放介质，0.45μm微孔滤膜过滤后，采用HPLC测定每个时间点的DSCP浓度后，按照公式计算累积释放百分比Q。
式中C1，C2，Ci-1，Ci分别是第1，2，i-1，i等时间点释放介质中DSCP浓度；V1为释放介质总体积，V2为所取样的体积；M为释放前总药量。
图6结果表明在pH 7.4PBS释放介质中，DSCP的释放速度较快，约在4h释放达到80％，与DSCP较好的水溶性有关。
实施例8：
不同制剂的CCK-8实验，结果如图7所示。
采用CCK-8法考察不同制剂在4T1细胞和4T1/DDP的细胞毒性，现以DSCP溶液剂为例：取处于对数生长期的4T1/DDP细胞，用RPMI-1640完全培养液稀释成3×104个/cells/mL接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h。待细胞贴壁后，倒去培养基，加入实验组(DSCP培养液：200、100、75、50、20、10、5、2、1μM)，实验设阴性对照组(给药浓度为0)，每组平行6个空。给药48h后，倒出培养基，加入不含血清培养基稀释10倍的CCK-8溶液100μL，随后观察孔板颜色变化，3h后用酶标仪在450nm测定吸光值，计算各组细胞生存率和IC50值。
同上述操作，考察DSCP和L-BSO混合溶液剂、实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip、空白脂质体在4T1/DDP细胞的细胞毒性，计算各组细胞生存率和IC50值。
同上述操作，采用CCK-8法考察不同浓度DSCP溶液剂、DSCP和L-BSO混合溶液剂、实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip和DSCP Lip、空白脂质体在4T1细胞的细胞毒性，计算各组细胞生存率和IC50值。
图7结果表明空白脂质体安全性良好，对4T1/DDP和4T1细胞的生存率无影响。DSCP溶液剂、DSCP和L-BSO混合溶液剂、实施例2制备的DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip对4T1/DDP和4T1细胞均有明显的抑制作用，同时抑制作用随药物浓度的增大而增强。其中，通过分析上述四组制剂的细胞毒数据，相比于DSCP溶液剂和实施例2制备的DSCP Lip组，DSCP和L-BSO混合溶液剂组与实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip组的IC50值更小，细胞毒性更强，说明DSCP和L-BSO具有协同抗肿瘤作用；与DSCP溶液剂、DSCP和L-BSO混合溶液剂、实施例2制备的DSCP Lip相比，实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip的细胞抑制效果最强，IC50最小，说明实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip具有增强的协同抗肿瘤效果。
实施例9
胞内GSH浓度的测定实验，结果如图8所示。
取处于对数生长期4T1/DDP细胞，用完全培养基稀释2×105个/cells/mL加入到6孔板中，每孔3mL，孵育12h待细胞贴壁后，弃去培养液，加入DSCP溶液剂、DSCP和L-BSO的混合溶液剂、实施例2制备的DSCP Lip和DSCP/L-BSO Lip溶液处理(其中DSCP的浓度为60μM)，每组平行3个孔，置于培养箱孵育24h。弃去含药培养液，加入1-2mL预冷的PBS溶液清洗细胞表面2-3次，吸净PBS。放置于冰上，用细胞刮刀将细胞刮下并收集于超声管，加入适量预冷的细胞裂解液，探头超声裂解细胞。将细胞转移至1.5ml离心管中，随后在13000rpm低温离心10min，小心吸取上清液分管装好暂存于-20℃备用。
采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定细胞蛋白浓度，采用微量还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒测定细胞内GSH的浓度，根据以下公式计算出胞内单位蛋白的GSH浓度：
图8结果显示与4T1细胞相比，顺铂耐药型4T1/DDP细胞具有较高的GSH浓度。不论是4T1细胞还是4T1/DDP细胞，DSCP和L-BSO混合溶液剂处理组胞内GSH浓度较DSCP溶液剂处理组显著下调；同时，实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip处理组胞内较DSCP Lip处理组显著下调，说明L-BSO具有较好的下调胞内GSH的作用。与其他三组相比，实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip处理组胞内GSH浓度最低，说明实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip被肿瘤细胞摄取进入细胞后，释放的L-BSO通过抑制GCL活性下调了细胞内GSH，以及Pt(IV)前药的激活消耗GSH，增加肿瘤细胞对顺铂的敏感性，提高了实施例2制备的DSCP/L-BSO Lip的协同抗肿瘤效果。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种双载型聚乙二醇（PEG）化脂质体，其特征在于，以PEG化脂质体为药物储库，以顺铂前药顺-二氯·反-二（丁二酸氢根）·顺-二氨合铂（Ⅳ）（DSCP）和L-丁硫氨酸-(S,R)-亚砜亚胺（L-BSO）为模型药物；
所述的双载型PEG化脂质体，由采用薄膜水化-挤出法制备得到；
所述薄膜水化-挤出法具体为：将蛋黄卵磷脂、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-mPEG2K）溶解于二氯甲烷中，旋干成膜，加入所述DSCP和L-BSO的混合水溶液水化处理，再经脂质体挤出器挤出得到脂质体颗粒，将所述脂质体颗粒离心过滤去除游离药物，得到所述双载型PEG化脂质体；
所述顺DSCP和L-BSO的摩尔比为1:12。
2.根据权利要求1所述的双载型PEG化脂质体，其特征在于，所述脂质体颗粒小于200nm。
3.根据权利要求1-2任一所述的双载型PEG化脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为顺铂耐药的肿瘤。
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