CN113453685A - 使用口服给药的二氧戊环核苷酸与抗pd1或抗pdl1单克隆抗体的组合治疗肝癌的方法 - Google Patents

Abstract

式I的化合物或其药学上可接受的盐在治疗哺乳动物的肝癌中的用途，其特征在于，与阻断PD‑L1和/或PD‑L2与PD‑1结合的单克隆抗体同时或序贯治疗哺乳动物。

Description

使用口服给药的二氧戊环核苷酸与抗PD1或抗PDL1单克隆抗 体的组合治疗肝癌的方法

I.领域

本文提供了使用口服给药的二氧戊环核苷酸MIV-818、其非对映异构体或其药学上可接受的盐与肠胃外给药的抗PD1或抗PDL1单克隆抗体的组合治疗肝脏中的原发性或转移性癌症的方法。本文还提供了MIV-818或其药学上可接受的盐的口服组合物，其被配制用于与抗PD1或抗PDL1单克隆抗体同时或序贯给予患有肝肿瘤的哺乳动物。

II.背景

原发性肝癌是全球第五大最常确诊的癌症，也是癌症死亡的第二大原因。肝癌是生长在肝脏表面或内部的恶性肿瘤。它们由肝脏本身或肝脏内的结构，包括血管或胆管形成。

肝癌的主要原因是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的病毒感染。癌症形成通常继发于由这些病毒引起的肝硬化。出于该原因，肝癌的最高发病率发生在这些病毒流行的地方，包括东亚和撒哈拉以南的非洲。位于肝脏的其他癌症包括肝转移瘤，也称为继发性肝癌，这是一种起源于身体其他部位的器官并迁移到肝脏的癌症。肝脏是转移性疾病的常见部位，因为它具有丰富的双重血液供应(肝动脉和门静脉)。肝脏中的转移性肿瘤的发现率是原发肿瘤的20倍。在所有病例的50％中，原发肿瘤是胃肠道肿瘤。其他常见部位包括乳房、卵巢、支气管和肾脏。

最常见的肝癌是肝细胞癌(HCC)，占所有原发性肝癌的约75％。HCC是一种由肝细胞形成的癌症，所述肝细胞被称为变成恶性的肝细胞。另一种类型的由肝细胞形成的癌症是肝母细胞瘤，它是由未成熟的肝细胞特异性形成的。它是一种罕见的恶性肿瘤，主要发生于儿童，占儿童所有癌症的约1％，占15岁以下所有原发性肝癌的79％。

肝癌也可以由肝脏内的其他结构，例如胆管、血管和免疫细胞形成。胆管的癌症(胆管癌和胆管细胞囊腺癌)占原发性肝癌的约6％。还有一种HCC的变体类型，其由HCC和胆管癌二者组成。肝血管肿瘤包括血管肉瘤和血管内皮瘤。胚胎肉瘤和纤维肉瘤是由一类称为间充质的结缔组织产生的。由肝脏中的肌肉产生的癌症是平滑肌肉瘤和横纹肌肉瘤。其他不太常见的肝癌包括癌肉瘤、畸胎瘤、卵黄囊瘤、类癌瘤和淋巴瘤。淋巴瘤通常具有向肝脏的弥漫性浸润，但在极少数情况下也可能形成肝脏肿块。

手术切除通常是非肝硬化肝脏的首选治疗方法。在肝硬化肝脏切除的情况下，如肝功能衰竭的并发症的风险会增加。在过去的几十年里，切除后的5年生存率有了很大的提高，目前可以超过50％。由于初始肿瘤的扩散或新肿瘤的形成，切除后的复发率超过70％。肝移植也可以用于可以耐受这种形式的治疗且肿瘤符合特定标准(例如米兰标准)的HCC病例。不到30-40％的患有HCC的个体符合手术和移植条件，因为癌症通常是在晚期检测到的。此外，HCC在等待肝移植期间可以进展，这最终会阻碍移植。

经皮消融是唯一可以提供治愈的非手术治疗。有多种形式的经皮消融，包括将化学物质注入肝脏(乙醇或乙酸)或使用射频消融、微波、激光或冷冻疗法产生极端温度。其中，射频消融在HCC中是享有最高声誉的一种，但其局限性包括分别由于发热和热同步效应而无法治疗靠近其他器官和血管的肿瘤。

全身性化疗不常用于HCC，但局部化疗可以用于称为经动脉化疗栓塞(TACE)的过程中。在该过程中，给予细胞毒性药物，如多柔比星或顺铂与碘油，并用明胶海绵或其他颗粒阻断供应肝脏的动脉。由于大多数全身性药物对HCC的治疗无效，因此对参与肝癌产生的分子途径的研究产生了索拉非尼，这是一种在某些情况下防止细胞增殖和血细胞生长的靶向治疗药物。

放疗不常用于HCC，因为肝脏对辐射不耐受。即使使用现代技术为肝脏的特定区域提供良好靶向的辐射，对周围肝组织的附带损害也是一个问题，这凸显对更好的“保肝”方案的需求。放疗加化疗栓塞、局部化疗、全身性化疗或靶向治疗药物的双重治疗可能显示优于单独的放疗的益处。

国际专利申请WO2016/030335公开了口服给药的肝脏靶向二氧戊环核苷酸，包括以下化合物：

该化合物也称为MIV-818。

免疫监视的完整功能在控制肿瘤转化的外生长方面的重要性已广为人知。已发现肿瘤细胞上PD-L1(程序性死亡配体1)的高表达与包括卵巢癌在内的各种癌症类型的不良预后和生存相关。临床前数据表明PD-1(程序性死亡-1或程序性细胞死亡-1)通路是卵巢癌的可行靶点。EOC中PD-1/PD-L1抑制的临床数据有限，但在抗-PD-L1抗体BMS-936559的1期研究中，17名EOC患者中有一名具有目标反应。

使用针对T细胞上的PD-1受体或肿瘤细胞上的其配体(PD-L1)的抗体抑制免疫检查点已在一些但不是所有肿瘤，包括黑色素瘤和非小细胞肺癌中显示出有希望的抗肿瘤活性。

PD-1拮抗剂纳武单抗，一种全人源免疫球蛋白G4单克隆抗体，于2017年9月被FDA批准用于治疗肝癌，但仅作为索拉非尼失败后的二线治疗。

派姆单抗，也称为MK-3475和Keytruda，是一种针对人细胞表面受体PD-1的人源化单克隆IgG4抗体，具有潜在的免疫增强活性。给药后，派姆单抗与激活的T细胞表面上表达的抑制性信号传导受体PD-1结合，并通过其配体阻断与PD-1的结合和PD-1的激活，这导致T细胞介导的针对肿瘤细胞的免疫反应的激活。PD-1的配体包括在抗原呈递细胞(APC)上表达并在某些癌细胞上过表达的PD-L1，以及主要在APC上表达的PD-L2。激活的PD-1通过抑制PI3K/Akt途径负调节T细胞活化。然而，有肺转移性肝癌患者中出现派姆单抗诱导的肝衰竭的报道(Wu等人，Medicine(Baltimore)2017 96(51):e9431)。

对于原发性和继发性肝癌，特别是在先前的治疗性治疗后复发或先前的治疗性治疗难治的那些的治疗仍然存在明显未满足的需求。

III.发明概述

本发明的第一方面提供下式的化合物、其非对映异构体或其药学上可接受的盐在治疗哺乳动物的肝癌中的用途，

其特征在于，与阻断PD-L1和/或PD-L2与PD-1结合的单克隆抗体同时或序贯治疗哺乳动物。

本发明的第二方面提供了一种用于治疗患有原发性或继发性肝肿瘤的哺乳动物的方法的化合物，其中所述化合物具有下式、为其非对映异构体或其药学上可接受的盐：

其中所述方法包括周期性给予受试者治疗有效量的所述化合物、其非对映异构体或其药学上可接受的盐，和治疗有效量的抗PD1或抗PDL1单克隆抗体，其中所述化合物或其药学上可接受的盐口服给药。

本发明至少部分基于以下发现：MIV-818除了对肝癌细胞具有直接的抗肿瘤作用外，还可以刺激免疫系统。免疫系统的这种激活增强了抗PD1或抗PDL1单克隆抗体的功效和/或耐受性，从而在肝癌(例如HCC)区域内提供了意想不到的增强的抗肿瘤活性。我们设想这种有益的相互作用甚至可以扩展到肝转移瘤的治疗。

不希望受理论束缚，我们进一步设想由于远位效应，MIV-818与药剂如PD1和PDL1拮抗剂的组合的意想不到的免疫刺激可能导致针对除了肝脏的原发病变以外的肝外肿瘤病变的抗肿瘤活性的增强，由此在肝脏局部激活免疫系统，然后迁移并攻击远处的病变。

为方便起见，在本说明书中，下式的化合物、其非对映异构体或其药学上可接受的盐将通常可互换地称为“MIV-818”。

在一些附图中，MIV-818被称为MDR_MV087313。

MIV-818的一个优选实施方案是具有以下结构的非对映异构体：

MIV-818通常口服给药，吸收到血液中，并通过首过代谢在肝脏中集中。MIV-818在人血浆中稳定，但遗憾的是在啮齿动物血液中代谢非常快。这又意味着，基本上所有通常用于实体瘤肿瘤学的体内模型根本不可使用，这些体内模型包括旨在评估PK/PD、功效、机制和与检查点抑制剂(如PD-1拮抗剂)联合治疗的协同作用的模型。因此，如实施例中所概述的，部分地由复杂的机制模型引出了对口服给药的MIV-808和肠胃外给药的PD-1拮抗剂之间的当前的相互作用的说明。

在某些实施方案中，肝癌或肿瘤是选自肝细胞癌(HCC)、肝母细胞瘤、胆管癌或胆管细胞囊腺癌的原发性肝肿瘤，尤其是HCC。

在某些实施方案中，肝癌或肿瘤是继发性肝肿瘤，例如源自胃道、乳腺、卵巢、支气管或肾中的原发性肿瘤的那些。

在某些实施方案中，MIV-818被配制成口服剂型，例如片剂或胶囊。在一个实施方案中，向有其需要的哺乳动物，通常是人口服给予MIV-818。在一个实施方案中，向有其需要的哺乳动物给予MIV-818持续一段时间。在一个实施方案中，向有其需要的受试者周期性给予MIV-818(例如给药一天或多天，然后是休息期)。在一个实施方案中，在多个给药周期内向有其需要的哺乳动物给予MIV-818。

在某些实施方案中，PD-1抑制剂是抗-PD-1抗体。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，抗体是人源化抗体。在具体实施方案中，抗-PD-1单克隆抗体是派姆单抗。

在某些实施方案中，肝癌或肝肿瘤是复发的或难治的。在某些实施方案中，患有疾病或障碍的哺乳动物对先前的治疗没有反应。在某些实施方案中，先前的治疗包括索拉非尼、瑞戈非尼(regorafenib)或多纳非尼(donafenib)。

在某些实施方案中，抗PD1单克隆抗体是人源化单克隆IgG4抗体。在一个实施方案中，人源化单克隆IgG4抗体是派姆单抗。

在某些实施方案中，抗PDL1单克隆抗体是人源化单克隆IgG1抗体。在一个实施方案中，人源化单克隆IgG1抗体是德瓦鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)。

在一个实施方案中，抗PD1单克隆抗体是派姆单抗、MK-3475、匹地利珠单抗(pidilizumab)或纳武单抗(BMS-936558、MDX-1106或ONO-4538)。

在一个实施方案中，抗PDL1单克隆抗体是BMS-936559、阿特珠单抗(MPDL3280A)或德瓦鲁单抗(MEDI4736)。

在一个实施方案中，抗PD-L1单克隆抗体是Bavencio(阿维单抗(avelumab))。

在一个实施方案中，抗PD-1单克隆抗体是卡瑞利珠单抗(camrelizumab)(SHR1210)。

在一个实施方案中，抗PD-1单克隆抗体是替雷利珠单抗(tislelizumab)(BGBA317)。

在某些实施方案中，MIV-818在28天周期中连续给药21天，然后连续7天休息。在某些实施方案中，MIV-818在21天周期中连续给药14天，然后连续7天休息。

在某些实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第7天和第21天给药。在某些实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第8天和第21天给药。在某些实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期的第1天给药。在某些实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在21天周期的第1天给药。

在某些实施方案中，MIV-818在28天周期中连续给药21天，然后连续7天休息，并且抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期的第7天和第21天给药。在某些实施方案中，MIV-818在28天周期中连续给药21天，然后连续休息7天，并且抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期的第8天和第21天给药。在某些实施方案中，MIV-818在28天周期中连续给药21天，然后连续休息7天，并且抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期的第1天给药。

在具体实施方案中，肝癌为HCC。在更具体的实施方案中，HCC是复发的或难治的。在具体实施方案中，HCC对使用索拉非尼、瑞戈非尼或多纳非尼的治疗没有反应或不再有反应。

在某些实施方案中，MIV-818在21天周期中连续给药14天，然后连续休息7天，并且抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在21天周期的第1天给药。

在某些实施方案中，MIV-818以约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约500mg或约600mg的量口服给药。在某些实施方案中，MIV-818以每天约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg或约600mg的量口服给药。

在另一个实施方案中，MIV-818以每天约600mg的量给药。在另一个实施方案中，MIV-818以每天约500mg的量给药。在另一个实施方案中，MIV-818以每天约400mg的量给药。在一个实施方案中，MIV-818以每天约300mg的量给药。在另一个实施方案中，MIV-818以每天约200mg的量给药。在另一个实施方案中，MIV-818以每天约100mg的量给药。在另一个实施方案中，MIV-818以每天约50mg的量给药。

在某些实施方案中，MIV-818每天给药一次。在某些实施方案中，MIV-818每天给药两次。在一个实施方案中，MIV-818以约200mg、约150mg或约100mg的量每天给药两次。在一个实施方案中，MIV-818以约200mg的量每天给药两次。在一个实施方案中，MIV-818以约150mg的量每天给药两次。在一个实施方案中，MIV-818以约100mg的量每天给药两次。

在某些实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体肠胃外给药。在某些实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以约0.5mg/Kg(每千克受试者的质量约0.5mg的抗PD1/抗PDL1单克隆抗体)、约1mg/Kg、约2mg/Kg、约3mg/Kg、约4mg/Kg、约5mg/Kg、约6mg/Kg、约7mg/Kg、约8mg/Kg、约9mg/Kg、约10mg/Kg、约11mg/Kg、约12mg/Kg、约13mg/Kg、约14mg/Kg、约15mg/Kg、约16mg/Kg、约17mg/Kg、约18mg/Kg、约19mg/Kg或约20mg/Kg的量给药。

在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约20mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约19mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约18mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约17mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约16mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约15mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约14mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约13mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约12mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约11mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约10mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约9mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约8mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约7mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约6mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1或抗PDL1单克隆抗体以约5mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约4mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约3mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约2mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约1mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约0.5mg/Kg的量静脉内给药。

在具体实施方案中，抗PD1或抗PDL1单克隆抗体以每天约1500mg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1或抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第1天以每天约1500mg的量给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第1天、28天周期中的第7天和第21天或在28天周期中的第8天和第21天以每天约10mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第1天以每天约10mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第7天和第21天以每天约10mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第8天和第21天以每天约10mg/Kg的量静脉内给药。在具体实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第7天和第21天以每天约5mg/Kg的量静脉内给药。

在一个实施方案中，抗PD1单克隆抗体是派姆单抗并且作为30分钟静脉内输液给药。

在一个实施方案中，抗PD1单克隆抗体是MK-3475并且作为30分钟静脉内输液给药。

在一个实施方案中，抗PD1单克隆抗体是匹地利珠单抗并且作为30分钟静脉内输液给药。

在一个实施方案中，抗PD1单克隆抗体是纳武单抗(BMS-936558、MDX-1106或ONO-4538)并且作为30分钟静脉内输液给药。

在一个实施方案中，抗PDL1单克隆抗体是阿特珠单抗(MPDL3280A)并且作为30分钟静脉内输液给药。

在一个实施方案中，抗PDL1单克隆抗体是德瓦鲁单抗(MEDI4736)并且作为30分钟静脉内输液给药。

在一个实施方案中，德瓦鲁单抗(MEDI4736)在每个28天治疗周期的第1天作为单次1500mg静脉内输液给药。

在某些实施方案中，MIV-818是固体剂量单位的形式，例如胶囊、片剂或囊片。

在某些实施方案中，该方法还包括与MIV-818和PD-1拮抗剂序贯或同时给予治疗有效量的另外的活性剂，例如索拉非尼、瑞戈非尼或多纳非尼。

在具体实施方案中，受试者是人。

IV.附图简述

参考以下实施例和附图说明本发明的方面，其中：

图1是描绘MIV-818在肿瘤免疫微环境的复杂细胞培养模型中的作用的BioMAP读数，如实施例1中进一步描述的；

图2是1000nM MIV-818和50ug/ml派姆单抗的组合的BioMAP读数；

图3是叠加在相应的单一药剂上的1000nM MIV-818/50ug派姆单抗的组合的BioMAP读数；

图4是叠加在相应的单一药剂上的200nM MIV-818/10ug/ml派姆单抗的组合的BioMAP读数；

图5是叠加在相应的单一药剂上的40nM MIV-818/2ug/ml派姆单抗的组合的BioMAP读数；

图6是叠加在相应的单一药剂上的8nM MIV-818/0.4ug/ml派姆单抗的组合的BioMAP读数；

图7是用于比较的派姆单抗的剂量反应的BioMAP读数；

图8是显示在肿瘤微环境的细胞培养模型中组分MIV-818和派姆单抗对基质IFNγ的剂量和效应之间的关系的图；

图9是显示在肿瘤微环境的细胞培养模型中组分MIV-818和派姆单抗对血管IFNγ的剂量和效应之间的关系的图；

图10是显示在肿瘤微环境的细胞培养模型中组分MIV-818和派姆单抗对基质IL17A的剂量和效应之间的关系的图；

图11是对应于图10的图，但显示血管IL-17A基本上不受组合的影响；

图12是显示在肿瘤微环境的细胞培养模型中组分MIV-818和派姆单抗对基质TNFα的剂量和效应之间的关系的图；

图13是对应于图12的图，但显示血管TNFα基本上不受组合的影响；

图14是显示在肿瘤微环境的细胞培养模型中组分MIV-818和派姆单抗对基质IL-6的剂量和效应之间的关系的图；

图15是对应于图14的图，但显示血管IL6基本上不受组合的影响；

图16是显示MIV-818以剂量依赖性方式增强IL-2表达以及与派姆单抗组合增强的图；

图17是显示通过MIV-818和派姆单抗的组合增加的PBMC介导的肿瘤细胞杀伤的图；

图18是显示合成核苷前体的方案；

图19是显示磷酰胺试剂与核苷前体偶联的方案。

V.详述

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文中提及的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文。

A.定义

在说明书和所附权利要求书中使用的不定冠词“一(a)”和“一(an)”以及定冠词“该(the)”包括复数和单数指称，除非上下文另有明确规定。

术语“约”或“大约”是指由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差，这部分取决于该值是如何测量或确定的。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”是指在1、2、3或4个标准偏差以内。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0.05％以内。

如本文所用的且除非另有说明，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指疾病或障碍的根除或改善，或与该疾病或障碍相关的一种或多种症状的根除或改善。在某些实施方案中，术语是指由于向患有这样的疾病或障碍的受试者给予一种或多种预防剂或治疗剂而导致的疾病或障碍的扩散或恶化的最小化。在一些实施方案中，该术语是指在特定疾病的症状发作后，在有或没有一种或多种另外的活性剂的情况下给予本文提供的化合物或剂型。

如本文所用的且除非另有说明，否则术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指预防疾病或障碍或其一种或多种症状的发生、复发或扩散。在某些实施方案中，术语是指在症状出现之前，在有或没有一种或多种其他另外的活性剂的情况下，用本文提供的化合物或剂型治疗或给药，特别是对处于本文提供的疾病或障碍风险中的受试者治疗或给药。这些术语包括抑制或减轻特定疾病的症状。在某些实施方案中，具有疾病家族史的受试者尤其是预防方案的候选者。此外，具有复发症状史的受试者也是预防的潜在候选者。在这方面，术语“预防”可以与术语“预防性治疗”互换使用。

如本文所用的且除非另有说明，否则术语“管理(manage)”、管理(managing)”和管理(management)”是指预防或减缓疾病或障碍或其一种或多种症状的进展、扩散或恶化。通常，受试者从预防剂和/或治疗剂中获得的有益效果不导致疾病或病症的治愈。在这方面，术语“管理”包括治疗患有特定疾病的受试者以试图预防疾病的复发或使之最小化。

如本文所用的，通过给予特定药物组合物改善特定障碍的症状是指可归因于组合物的给药或与组合物的给药相关的任何减轻，无论是永久的或暂时的、持久的或短暂的。

如本文所用的且除非另有说明，术语化合物的“治疗有效量”和“有效量”是指足以在疾病或障碍的治疗或管理中提供治疗益处或延迟一种或更多种与疾病或障碍相关的症状或使之最小化的量。化合物的“治疗有效量”和“有效量”是指单独或与一种或多种其他药剂组合的治疗剂的量，其在疾病或障碍的治疗或管理中提供治疗益处。术语“治疗有效量”和“有效量”可以包括改善整体治疗、减少或避免疾病或障碍的症状或原因、或增强另一种治疗剂的治疗功效的量。

如本文所用的且除非另有说明，化合物的“预防有效量”是足以预防疾病或障碍或防止其复发的量。化合物的预防有效量是指单独或与一种或多种其他药剂组合的治疗剂的量，其提供预防疾病的预防益处。术语“预防有效量”可以包括改善整体预防或增强另一种预防剂的预防功效的量。

如本文所用的，“肿瘤”是指赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌性细胞和组织。

如本文所用的，“赘生性”是指任何形式的失调或不受调节的细胞生长，无论是恶性的还是良性的，导致异常组织生长。因此，“赘生性细胞”包括具有失调的或不受调节的细胞生长的恶性和良性细胞。

术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物的生理状况，其通常以不受调节的细胞生长为特征。癌症的实例包括实体瘤，例如HCC。

如本文所用的且除非另有说明，否则术语“增殖性”障碍或疾病是指多细胞生物体中一个或多个细胞亚群的不希望的细胞增殖，导致对多细胞生物体的伤害(即不适或预期寿命降低)。例如，如本文所用的，增殖性障碍或疾病包括赘生性障碍和其他增殖性障碍。

如本文所用的且除非另有说明，否则术语“复发的”是指在治疗后癌症已缓解的受试者具有癌细胞恢复的情况。

如本文所用的且除非另有说明，否则术语“难治性”或“抗性”是指受试者即使在强化治疗后体内仍有残留癌细胞的情况。

如本文所用的，术语“组合物”、“制剂”和“剂型”旨在包括包含指定的(多种)成分(以指定量，如果指明的话)的组合物以及任何(多种)产品，其直接或间接地由指定的(多种)量的指定的(多种)成分的组合产生。“药物的”或“药学上可接受的”是指组合物、制剂或剂型中的任何(多种)稀释剂、(多种)赋形剂或(多种)载体与其他(多种)成分相容并且对其接受者无害。除非另有说明，术语“组合物”、“制剂”和“剂型”在本文中可互换使用。

术语“速释”，当在本文中针对本文提供的组合物、制剂或剂型使用时，是指组合物、制剂或剂型不包含用于在口服给药后使API的一些或全部从组合物、制剂或剂型在胃外的空间和/或时间释放延迟的组分(例如包衣)。在某些实施方案中，速释组合物、制剂或剂型是在口服给药后在胃中基本上释放API的速释组合物、制剂或剂型。在具体实施方案中，速释组合物、制剂或剂型是非延迟释放的速释组合物、制剂或剂型。在具体实施方案中，速释组合物、制剂或剂型是不包含肠溶衣的组合物、制剂或剂型。

术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在具体实施方案中，受试者是人。

术语“共同给药””和“与……组合”包括在没有特定时间限制的情况下共同、同时或依次给予两种或更多种治疗剂。在一个实施方案中，药剂同时存在于细胞或受试者体内或同时发挥其生物学或治疗作用。在一个实施方案中，治疗剂在相同的组合物或单位剂型中。在其他实施方案中，治疗剂在分开的组合物或单位剂型中。在某些实施方案中，可在第二治疗剂给药之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之前)、同时或之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)给予第一治疗剂。

术语“同位素组成”是指给定原子位置存在的每种同位素的量，并且“天然同位素组成”是指给定原子位置天然存在的同位素组成或丰度。包含其天然同位素组成的原子位置在本文中也可称为“非富集的”。除非另有说明，本文所述化合物的原子位置意在代表该原子的任何稳定同位素。例如，除非另有说明，当位置被具体指定为“H”或“氢”时，该位置被理解为在其天然同位素组成中具有氢。

术语“同位素富集的”是指具有不同于该原子的天然同位素组成的同位素组成的原子位置。“同位素富集的”还可以指包含至少这样的一个原子位置的化合物，该原子位置具有不同于该原子的天然同位素组成的同位素组成。如本文所用的，“同位素体”是同位素富集的化合物。

术语“同位素富集”是指在分子中的给定原子位置处代替该原子的天然同位素组成的特定同位素的掺入量的百分比。例如，给定位置处的1％的氘富集意味着给定样品中1％的分子在指定位置含有氘。由于氘的天然存在的分布为约0.0156％，因此使用非富集起始原料合成的化合物中的任何位置处的氘富集为约0.0156％。

术语“同位素富集因子”是指指定同位素的同位素组成与天然同位素组成之比。

关于本文提供的化合物，当特定原子位置被指定为具有氘或“D”时，应理解在该位置处的氘的丰度显著大于为约0.015％的氘的天然丰度。在具体实施方案中，指定为具有氘的位置通常在每个指定的氘位置处具有至少1000(15％氘掺入)、至少2000(30％氘掺入)、至少3000(45％氘掺入)、至少3500(52.5％氘掺入)、至少4000(60％氘掺入)、至少4500(67.5％氘掺入)、至少5000(75％氘掺入)、至少5500(82.5％氘掺入)、至少6000(90％氘掺入)、至少6333.3(95％氘掺入)、至少6466.7(97％氘掺入)、至少6600(99％氘掺入)或至少6633.3(99.5％氘掺入)的最小同位素富集因子。

本文提供的化合物的同位素富集和同位素富集因子可以使用本领域普通技术人员已知的常规分析方法确定，这些常规分析方法包括例如质谱、核磁共振光谱和晶体学。

B.MIV-818

MIV-818的合成在WO2016/030335中示出。简言之，核苷前体的制备如图18所示，并与磷酰胺试剂偶联，如图19所示。

MIV-818通常为>75％，例如>90％，优选>95％，更优选至少95％ee的非对映异构体：

供选择地，可以使用磷处的外消旋体，并且通常制备起来将更便宜。

C.药物制剂

1.概述

本文的实施方案包括包含MIV-818的药物制剂和组合物，其中制剂和组合物被制备成用于口服给药。如本文所提供的，具体实施方案涉及MIV-818在制备用于治疗特定医学适应症的药物制剂和组合物中的用途。本文提供的包含MIV-818的药物制剂和组合物旨在用于有其需要的受试者的口服递送。口服递送形式包括但不限于片剂、胶囊、囊片、溶液、混悬剂和糖浆，并且还可以包括可以被包封或可以不被包封的多个颗粒、珠粒、粉末或丸粒。这样的形式在本文中还可以被称为包含MIV-818的“药芯”。

本文的具体实施方案提供了固体口服剂型，所述固体口服剂型为片剂或胶囊。在某些实施方案中，制剂是包含MIV-818的片剂。在某些实施方案中，制剂是包含MIV-818的胶囊。在某些实施方案中，本文提供的片剂或胶囊任选地包含一种或多种赋形剂，例如助流剂、稀释剂、润滑剂、着色剂、崩解剂、造粒剂、粘合剂、聚合物和包衣剂。在某些实施方案中，制剂是速释片剂。在某些实施方案中，制剂是例如基本上在肠道中释放API的控释片剂。在某些实施方案中，制剂是硬明胶胶囊。在某些实施方案中，制剂是软明胶胶囊。在某些实施方案中，胶囊是羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊。在某些实施方案中，制剂是速释胶囊。在某些实施方案中，制剂是例如基本上在肠道中释放API的速释或控释胶囊。

在具体实施方案中，可以使用药物制剂领域的技术人员已知的常规方法制备制剂，如相关教科书中所述的。参见例如，REMINGTON,THE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY,第20版,Lippincott Williams&Wilkins,(2000)；ANSEL等人,PHARMACEUTICALDOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,第7版,Lippincott Williams&Wilkins,(1999)；GIBSON,PHARMACEUTICAL PREFORMULATION AND FORMULATION,CRC出版社(2001)。

在具体实施方案中，制剂中的MIV-818的具体量为例如约10mg、约20mg、约40mg、约60mg、约80mg、约100mg、约120mg、约140mg、约160mg、约180mg、约200mg、约220mg、至少约240mg、约260mg、约280mg、约300mg、约320mg、约340mg、约360mg、约380mg、约400mg、约420mg、约440mg、约460mg、约480mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1000mg、约1100mg、约1200mg、约1300mg、约1400mg、约1500mg、约1600mg、约1700mg、约1800mg、约1900mg、约2000mg、约2100mg、约2200mg、约2300mg、约2400mg、约2500mg、约3000mg、约4000mg或约5000mg。

在具体实施方案中，制剂中的MIV-818的具体量为例如至少约10mg、至少约20mg、至少约40mg、至少约60mg、至少约80mg、至少约100mg、至少约120mg、至少约140mg、至少约160mg、至少约180mg、至少约200mg、至少约220mg、至少约240mg、至少约260mg、至少约280mg、至少约300mg、至少约320mg、至少约340mg、至少约360mg、至少约380mg、至少约400mg、至少约420mg、至少约440mg、至少约460mg、至少约480mg、至少约500mg、至少约600mg、至少约700mg、至少约800mg、至少约900mg、至少约1000mg、至少约1100mg、至少约1200mg、至少约1300mg、至少约1400mg、至少约1500mg、至少约1600mg、至少约1700mg、至少约1800mg、至少约1900mg、至少约2000mg、至少约2100mg、至少约2200mg、至少约2300mg、至少约2400mg、至少约2500mg、至少约3000mg、至少约4000mg或至少约5000mg。

在某些实施方案中，所述制剂是片剂，其中片剂是使用标准的、本领域公认的片剂加工过程和设备制备的。在某些实施方案中，形成片剂的方法是直接压制包含单独的、或与一种或多种赋形剂例如载体、添加剂、聚合物等组合的MIV-818的粉末状、结晶和/或颗粒状组合物。在某些实施方案中，作为直接压制的替代方案，可使用湿法制粒或干法制粒工艺制备片剂。在某些实施方案中，从湿的或以其他方式易处理的材料开始，将片剂模印而不是压制。在某些实施方案中，使用压制和造粒技术。

在某些实施方案中，所述制剂是胶囊，其中胶囊可以使用标准的、本领域公认的胶囊加工过程和设备制备。在某些实施方案中，可以制备软明胶胶囊，其中所述胶囊含有MIV-818和植物油或非水性、水混溶性材料例如聚乙二醇等的混合物。在某些实施方案中，可制备硬明胶胶囊，其含有与固体粉状载体组合的MIV-818颗粒，所述固体粉状载体例如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、马铃薯淀粉、玉米淀粉、支链淀粉、纤维素衍生物或明胶。在某些实施方案中，硬明胶胶囊壳可以由包含明胶和少量增塑剂例如甘油的胶囊组合物制备。在某些实施方案中，作为明胶的替代物，胶囊壳可由碳水化合物材料制成。在某些实施方案中，胶囊组合物可以根据需要另外包含聚合物、着色剂、调味剂和遮光剂。在某些实施方案中，胶囊包含HPMC。

在某些实施方案中，本文提供的药物制剂是包含MIV-818的压制片。除了MIV-818外，片剂任选地包含一种或多种赋形剂，包括(a)稀释剂或填充剂，其可以为制剂增加必要的体积以制备期望尺寸的片剂；(b)粘合剂或胶粘剂，其可以促进制剂颗粒的粘附，从而能够制备颗粒并保持最终片剂的完整性；(c)崩解剂或崩解试剂，其在给药后可以促进片剂分裂成更小的颗粒以提高药物利用度；(d)抗粘剂、助流剂、润滑剂或润滑试剂，它们可以增强压片材料向压片模具中的流动，使冲头和模具的磨损最小化，防止填充材料粘到冲头和模具上，并产生有光泽的片剂；和(e)其他辅料，例如着色剂和香料。压制后，本文提供的片剂可以用本文所述的各种材料包衣。

在某些实施方案中，本文提供的药物制剂是MIV-818的多重压制片。通过对填充材料进行多于单次的压制来制备多重压制片。结果可以是多层片或片内片，内片是包含MIV-818和任选的一种或多种赋形剂的芯，外部部分是壳，其中壳包含一种或多种赋形剂，并且可以包含或可以不包含另外的MIV-818。分层片剂可以通过最初在模具中压实一部分填充材料，然后压实另外的填充材料并压制以形成两层或三层片剂来制备，这取决于分开填充的数量。每一层可以含有由于化学或物理不相容的原因而彼此分开的不同的治疗剂，或含有用于分级药物释放的相同治疗剂，或仅用于多层片剂的独特外观。填充物的每个部分的着色可以不同，以制备外观独特的片剂。在制备以压制片作为内部芯的片剂时，可使用特殊机器将预制片精确放置在模具内，用于随后压制周围的填充材料。

在某些实施方案中，MIV-818的压制片可以用着色或未着色的糖层包衣。包衣可以是水溶性的并且在口服后迅速溶解。糖衣可以用于保护包封的药物免受环境影响并对令人不快的味道或气味提供屏障的目的。糖衣还可以改善压制片的外观，并允许压印识别制造商的信息。在某些实施方案中，糖衣片可以比原始未包衣片大且重50％。片剂的包糖衣可以分为以下任选的步骤：(1)防水和密封(如果需要)；(2)包底衣；(3)平滑和最终制圆；(4)修形和着色(如果需要)；(5)压印(如果需要)；和(6)抛光。

在某些实施方案中，MIV-818的压制片可以是薄膜包衣的。薄膜包衣片可以是用能够在片剂上形成皮肤样薄膜的聚合物的薄层包衣的压制片。薄膜通常是着色的，并且具有更耐用、体积更小、施用耗时更短的优点。根据其组成，包衣可以设计成在胃肠道内的期望位置破裂并暴露片芯。薄膜包衣工艺将塑料样材料的薄的贴身包衣覆盖在压制片上，可以制备出与原始压制片具有基本相同的重量、形状和尺寸的包衣片。可以对薄膜包衣进行着色以使片剂具有吸引力和独特性。薄膜包衣溶液可以是非水性的或水性的。在具体实施方案中，非水性溶液可以任选地包含以下类型的材料中的一种或多种以向片剂提供期望的包衣：(1)能够产生在常规包衣条件下可再现的并且适用于各种片剂形状的光滑薄膜的成膜剂，例如邻苯二甲酸乙酸纤维素；(2)为薄膜提供水溶性或渗透性以确保体液渗透和药物治疗利用度的共混物质(alloying substance)，例如聚乙二醇；(3)使包衣产生柔性和弹性从而提供耐久性的增塑剂，例如蓖麻油；(4)在施用过程中增强薄膜的铺展性的表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇衍生物；(5)使包衣片剂的外观具有吸引力和独特性的遮光剂和着色剂，例如作为遮光剂的二氧化钛，作为着色剂的FD&C或D&C染料；(6)提高受试者对片剂的可接受性的甜味剂、调味剂或芳香剂(aroma)，例如作为甜味剂的糖精，作为调味剂和芳香剂的香兰素；(7)无需单独的抛光操作即可为片剂提供光泽的光泽剂(glossant)，例如蜂蜡；和(8)实现其他组分在片剂上扩散，同时实现快速蒸发以允许有效而快速的操作的挥发性溶剂，例如醇-丙酮混合物。在某些实施方案中，水性薄膜包衣制剂可以包含以下中的一种或多种：(1)成膜聚合物，例如纤维素醚聚合物，如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素和甲基纤维素；(2)增塑剂，例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、邻苯二甲酸二乙酯和次乙酸二丁酯；(3)着色剂和遮光剂，例如FD&C或D&C色淀和氧化铁颜料；或(4)溶媒，例如水。

在某些实施方案中，MIV-818的压制片可以是压制包衣的。颗粒或粉末形式的包衣材料可以用特殊的压片机压制到药物的片芯上。

在某些实施方案中，药物制剂是MIV-818的明胶包衣片。明胶包衣片是一种胶囊形状的压制片，其使得包衣产品比用等量粉末填充的胶囊更小。明胶包衣有助于吞咽，并且与未密封的胶囊相比，明胶包衣的片剂可以更容易防拆封。

在某些实施方案中，压制片可以通过湿法制粒来制备。湿法制粒是一种广泛采用的压制片生产方法，在具体实施方案中，需要一个或多个以下步骤：(1)称重和共混成分；(2)制备软材；(3)将软材过筛成丸粒或颗粒；(4)干燥颗粒；(5)通过干筛分级颗粒；(6)加入润滑剂并共混；和(7)通过压制制片。

在某些实施方案中，压制片可以通过干法制粒来制备。通过干法制粒法，将粉末混合物压实形成大块，然后破碎或分级形成颗粒。但该方法无论是活性成分还是稀释剂都具有粘结性。在称量和混合成分后，可以将粉末混合物块化(slug)或压制成大的扁平片或丸。然后用手或磨机破碎块料，并使其通过具有期望目数的筛网进行分级。按常规方式加入润滑剂，通过压制制备片剂。供选择地，代替块化，可以使用粉末压实机通过在高压辊之间挤压粉末来增加粉末的密度。然后将压制的材料破碎、分级和润滑，并以通常的方式通过压制制备片剂。碾压法通常优于块化法(slugging)。碾压制剂中使用的粘合剂包括甲基纤维素或羟甲基纤维素，并且可以产生良好的片剂硬度和脆碎度。

在某些实施方案中，压制片可以通过直接压制制备。一些粒状化学品具有自由流动和内聚的特性，这使它们能够直接在压片机中被压制，无需湿法或干法制粒。对于不具备这种特性的化学品，可以使用特殊的药物赋形剂，其赋予通过直接压制制备片剂所必需的特性。具体的制片赋形剂包括，例如

填充剂，例如喷雾干燥的乳糖、α-一水合乳糖的微晶、蔗糖-转化糖-玉米淀粉混合物、微晶纤维素、结晶麦芽糖和磷酸二钙；

崩解剂，例如直接压片淀粉、羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素纤维和交联聚乙烯吡咯烷酮；

润滑剂，如硬脂酸镁和滑石粉；和

助流剂，如气相二氧化硅。

在某些实施方案中，本文提供的片剂可以通过模印来制备。模印片的基质通常是有或没有部分粉状蔗糖的细粉状乳糖的混合物。在制备填充物时，通过几何稀释将药物与基质均匀混合。可以用仅足以润湿粉末的水和醇的混合物润湿粉末混合物，从而可以将其压实。水对一部分乳糖/蔗糖基质的溶剂作用影响干燥后粉末混合物的粘合。醇部分加速了干燥过程。

在某些实施方案中，本文提供的药物制剂包含MIV-818和任选的一种或多种赋形剂以形成“药芯”。任选的赋形剂包括例如稀释剂(膨胀剂)、润滑剂、崩解剂、填充剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂、着色剂、调味剂、粘合剂、赋形剂载体、助流剂、渗透促进赋形剂、增塑剂等，例如，如本领域已知的。本领域技术人员将理解，一些物质在药物组合物中起到不止一种作用。例如，一些物质是在压制后有助于使片剂保持在一起的粘合剂，但也是在片剂到达目标递送部位时有助于使片剂分裂的崩解剂。赋形剂和用量的选择可以由制剂科学家根据经验和对本领域可用的标准过程和参考文献的考虑而容易地确定。

在某些实施方案中，本文提供的制剂包含一种或多种粘合剂。粘合剂可以用于例如赋予片剂内聚特性，从而确保片剂在压制后保持完整。合适的粘合剂包括但不限于淀粉(包括玉米淀粉和预胶化淀粉)、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖和乳糖)、聚乙二醇、丙二醇、蜡以及天然和合成树胶，例如，阿拉伯胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素聚合物(包括羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素等)、铝硅酸镁盐(veegum)、卡波姆(例如卡波普)、糊精钠、瓜尔胶、氢化植物油、硅酸镁铝、麦芽糖糊精、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮(例如，KOLLIDON、PLASDONE)、微晶纤维素等。粘合剂还包括例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、卡波姆、角叉菜胶、邻苯二甲酸乙酸纤维素、角豆胶、壳聚糖、糖粉、共聚维酮、葡萄糖结合剂(dextrate)、糊精、右旋糖、乙基纤维素、明胶、山嵛酸甘油酯、瓜尔豆胶、羟乙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基淀粉、羟丙甲纤维素、菊粉、乳糖、硅酸铝镁、麦芽糊精、麦芽糖、甲基纤维素、泊洛沙姆、聚卡波非、聚葡萄糖、聚环氧乙烷、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮、海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、淀粉、预胶化淀粉、硬脂酸、蔗糖和玉米蛋白。

如果确定是合适的，粘合剂相对于药芯的量可以是药芯的约2％w/w、药芯的约4％w/w、药芯的约6％w/w、药芯的约8％w/w、药芯的约10％w/w、药芯的约12％w/w、药芯的约14％w/w、药芯的约16％w/w、药芯的约18％w/w、药芯的约20％w/w、药芯的约22％w/w、药芯的约24％w/w、药芯的约26％w/w、药芯的约28％w/w、药芯的约30％w/w、药芯的约32％w/w、药芯的约34％w/w、药芯的约36％w/w、药芯的约38％w/w、药芯的约40％w/w、药芯的约42％w/w、药芯的约44％w/w、药芯的约46％w/w、药芯的约48％w/w、药芯的约50％w/w、药芯的约52％w/w、药芯的约54％w/w、药芯的约56％w/w、药芯的约58％w/w、药芯的约60％w/w、药芯的约62％w/w、药芯的约64％w/w、药芯的约66％w/w、药芯的约68％w/w、药芯的约70％w/w、药芯的约72％w/w、药芯的约74％w/w、药芯的约76％w/w、药芯的约78％w/w、药芯的约80％w/w、药芯的约82％w/w、药芯的约84％w/w、药芯的约86％w/w、药芯的约88％w/w、药芯的约90％w/w、药芯的约92％w/w、药芯的约94％w/w、药芯的约96％w/w、药芯的约98％w/w或更多。在某些实施方案中，具体粘合剂的合适量由本领域普通技术人员确定。

在某些实施方案中，本文提供的制剂包含一种或多种稀释剂。可以使用稀释剂，例如增加体积，从而最终提供实用尺寸的片剂。合适的稀释剂包括磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、纤维素、高岭土、甘露醇、氯化钠、干淀粉、微晶纤维素(例如AVICEL)、微细纤维素、预胶化淀粉、碳酸钙、硫酸钙、糖、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、磷酸氢钙二水合物、磷酸三钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖糊精、甘露醇、聚甲基丙烯酸酯(例如，EUDRAGIT)、氯化钾、氯化钠、山梨糖醇和滑石粉等。稀释剂还包括例如海藻酸铵、碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、乙酸纤维素、可压缩糖、糖粉、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、赤藓糖醇、乙基纤维素、果糖、富马酸、棕榈酰硬脂酸甘油酯、异麦芽酮糖醇、高岭土、乳糖醇、乳糖、甘露醇、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖糊精、麦芽糖、中链甘油三酯、微晶纤维素、微晶硅化纤维素、粉状纤维素、聚葡萄糖、聚甲基丙烯酸酯、二甲基硅油、海藻酸钠、氯化钠、山梨糖醇、淀粉、预胶化淀粉、蔗糖、磺丁基醚-环糊精、滑石粉、黄蓍胶、海藻糖和木糖醇。

稀释剂可以按计算量使用以获得片剂或胶囊的期望体积；在某些实施方案中，稀释剂的使用量为药芯的约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约22％或更多、约24％或更多、约26％或更多、约28％或更多、约30％或更多、约32％或更多、约34％或更多、约36％或更多、约38％或更多、约40％或更多、约42％或更多、约44％或更多、约46％或更多、约48％或更多、约50％或更多、约52％或更多、约54％或更多、约56％或更多、约58％或更多、约60％或更多、约62％或更多、约64％或更多、约68％或更多、约70％或更多、约72％或更多、约74％或更多、约76％或更多、约78％或更多、约80％或更多、约85％或更多、约90％或更多或约95％或更多，重量/重量；药芯的约10％至约90％w/w；药芯的约20％至约80％w/w；药芯的约30％至约70％w/w；药芯的约40％至约60％w/w。在某些实施方案中，具体稀释剂的合适量由本领域普通技术人员确定。

在某些实施方案中，本文提供的制剂包含一种或多种润滑剂。润滑剂可以用于例如促进片剂制备；合适的润滑剂的实例包括例如植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油，甘油，硬脂酸镁，硬脂酸钙和硬脂酸。在某些实施方案中，硬脂酸盐(如果存在)占包含药物的芯的不超过约2重量％。润滑剂的另外的实例包括例如硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、山嵛酸甘油酯、棕榈酰硬脂酸甘油酯、月桂基硫酸镁、硬脂酸镁、肉豆蔻酸、棕榈酸、泊洛沙姆、聚乙二醇、苯甲酸钾、苯甲酸钠、氯化钠、十二烷基硫酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、滑石粉和硬脂酸锌。在具体实施方案中，润滑剂是硬脂酸镁。

在某些实施方案中，润滑剂相对于药芯的存在量为药芯的约0.2％w/w、药芯的约0.4％w/w、药芯的约0.6％w/w、药芯的约0.8％w/w、药芯的约1.0％w/w、药芯的约1.2％w/w、药芯的约1.4％w/w、药芯的约1.6％w/w、药芯的约1.8％w/w、药芯的约2.0％w/w、药芯的约2.2％w/w、药芯的约2.4％w/w、药芯的约2.6％w/w、药芯的约2.8％w/w、药芯的约3.0％w/w、药芯的约3.5％w/w、药芯的约4％w/w、药芯的约4.5％w/w、药芯的约5％w/w、药芯的约6％w/w、药芯的约7％w/w、药芯的约8％w/w、药芯的约10％w/w、药芯的约12％w/w、药芯的约14％w/w、药芯的约16％w/w、药芯的约18％w/w、药芯的约20％w/w、药芯的约25％w/w、药芯的约30％w/w、药芯的约35％w/w、药芯的约40％w/w、药芯的约0.2％至约10％w/w、药芯的约0.5％至约5％w/w或药芯的约1％至约3％w/w。在某些实施方案中，具体润滑剂的合适量由本领域普通技术人员确定。

在某些实施方案中，本文提供的制剂包含一种或多种崩解剂。崩解剂可以用于例如促进片剂的崩解，并且可以是例如淀粉、粘土、纤维素、藻胶、树胶或交联聚合物。崩解剂还包括例如海藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠(例如AC-DI-SOL、PRIMELLOSE)、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮(例如KOLLIDON、POLYPLASDONE)、瓜尔胶、硅酸铝镁、甲基纤维素、微晶纤维素、波拉克林钾、粉状纤维素、预胶化淀粉、海藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠(例如，EXPLOTAB)和淀粉。另外的崩解剂包括例如海藻酸钙、壳聚糖、多库酯钠、羟丙基纤维素和聚维酮。

在某些实施方案中，崩解剂相对于药芯的存在量为药芯的约1％w/w、药芯的约2％w/w、药芯的约3％w/w、药芯的约4％w/w、药芯的约5％w/w、药芯的约6％w/w、药芯的约7％w/w、药芯的约8％w/w、药芯的约9％w/w、药芯的约10％w/w、药芯的约12％w/w、药芯的约14％w/w、药芯的约16％w/w、药芯的约18％w/w、药芯的约20％w/w、药芯的约22％w/w、药芯的约24％w/w、药芯的约26％w/w、药芯的约28％w/w、药芯的约30％w/w、药芯的约32％w/w、大于药芯的约32％w/w、药芯的约1％至约10％w/w、药芯的约2％至约8％w/w、药芯的约3％至约7％w/w或药芯的约4％至约6％w/w。在某些实施方案中，具体崩解剂的合适量由本领域普通技术人员确定。

在某些实施方案中，本文提供的制剂包含一种或多种稳定剂。稳定剂(也称为吸收促进剂)可以用于例如抑制或延迟药物分解反应，包括例如氧化反应。稳定剂包括例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素ETPGS)、阿拉伯胶、白蛋白、海藻酸、硬脂酸铝、海藻酸铵、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、膨润土、丁羟甲苯、海藻酸钙、硬脂酸钙、羧甲基纤维素钙、角叉菜胶、角豆胶、胶体二氧化硅、环糊精、二乙醇胺、乙二胺四乙酸盐、乙基纤维素、乙二醇、棕榈酰硬脂酸酯、单硬脂酸甘油酯、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、转化糖、卵磷脂、硅酸铝镁、单乙醇胺、果胶、泊洛沙姆、聚乙烯醇、海藻酸钾、波拉克林钾、聚维酮、没食子酸丙酯、丙二醇、海藻酸丙二醇酯、棉子糖、乙酸钠、海藻酸钠、硼酸钠、羧甲基纤维素钠、硬脂酰富马酸钠、山梨糖醇、硬脂醇、磺丁基-b-环糊精、海藻糖、白蜡、黄原胶、木糖醇、黄蜡和乙酸锌。

在某些实施方案中，稳定剂相对于药芯的存在量为药芯的约1％w/w、药芯的约2％w/w、药芯的约3％w/w、药芯的约4％w/w、药芯的约5％w/w、药芯的约6％w/w、药芯的约7％w/w、药芯的约8％w/w、药芯的约9％w/w、药芯的约10％w/w、药芯的约12％w/w、药芯的约14％w/w、药芯的约16％w/w、药芯的约18％w/w、药芯的约20％w/w、药芯的约22％w/w、药芯的约24％w/w、药芯的约26％w/w、药芯的约28％w/w、药芯的约30％w/w、药芯的约32％w/w、药芯的约1％至约10％w/w、药芯的约2％至约8％w/w、药芯的约3％至约7％w/w或药芯的约4％至约6％w/w。在某些实施方案中，具体稳定剂的合适量由本领域普通技术人员确定。

在某些实施方案中，本文提供的制剂包含一种或多种助流剂。助流剂可以用于例如改善粉末组合物或颗粒的流动特性或改善给药的准确性。可以用作助流剂的赋形剂包括例如胶体二氧化硅、三硅酸镁、粉状纤维素、淀粉、磷酸三钙、硅酸钙、粉状纤维素、胶体二氧化硅、硅酸镁、三硅酸镁、二氧化硅、淀粉、磷酸三钙和滑石。

在某些实施方案中，助流剂相对于药芯的存在量为小于药芯的约1％w/w、药芯的约1％w/w、药芯的约2％w/w、药芯的约3％w/w、药芯的约4％w/w、药芯的约5％w/w、药芯的约6％w/w、药芯的约7％w/w、药芯的约8％w/w、药芯的约9％w/w、药芯的约10％w/w、药芯的约12％w/w、药芯的约14％w/w、药芯的约16％w/w、药芯的约18％w/w、药芯的约20％w/w、药芯的约22％w/w、药芯的约24％w/w、药芯的约26％w/w、药芯的约28％w/w、药芯的约30％w/w、药芯的约32％w/w、药芯的约1％至约10％w/w、药芯的约2％至约8％w/w、药芯的约3％至约7％w/w或药芯的约4％至约6％w/w。在某些实施方案中，具体助流剂的合适量由本领域普通技术人员确定。

在某些实施方案中，本文提供的制剂包含一种或多种渗透促进剂(也称为例如渗透性增强剂)。在某些实施方案中，渗透促进剂增强MIV-818通过胃肠壁的摄取。在某些实施方案中，渗透促进剂改变MIV-818进入血流的的速率和/或量。在具体实施方案中，d-α-生育酚聚乙二醇-1000琥珀酸酯(维生素E TPGS)用作渗透促进剂。在具体实施方案中，使用一种或多种其他合适的渗透促进剂，包括例如本领域已知的任何渗透促进剂。合适的渗透促进剂的具体实例包括，例如以下列出的那些：

其他可用的渗透促进剂包括例如醇、二甲亚砜、单油酸甘油酯、糖原质、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、羊毛脂、亚油酸、肉豆蔻酸、油酸、油醇、棕榈酸、聚氧乙烯烷基醚、2-吡咯烷酮、月桂基硫酸钠和百里酚。

在某些实施方案中，渗透促进剂以相对于制剂总重量按重量计约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％、约3％、约3.1％、约3.2％、约3.3％、约3.4％、约3.5％、约3.6％、约3.7％、约3.8％、约3.9％、约4％、约4.1％约4.2％、约4.3％、约4.4％、约4.5％、约4.6％、约4.7％、约4.8％、约4.9％、约5％、约5.1％约5.2％、约5.3％、约5.4％、约5.5％、约5.6％、约5.7％、约5.8％、约5.9％、约6％、约6.1％、约6.2％、约6.3％、约6.4％、约6.5％、约6.6％、约6.7％、约6.8％、约6.9％、约7％、约7.1％、约7.2％、约7.3％、约7.4％、约7.5％、约7.6％、约7.7％、约7.8％、约7.9％、约8％、约8.1％、约8.2％、约8.3％、约8.4％、约8.5％、约8.6％、约8.7％、约8.8％、约8.9％、约9％、约9.1％、约9.2％、约9.3％、约9.4％、约9.5％、约9.6％、约9.7％、约9.8％、约9.9％、约10％、大于约10％、大于约12％、大于约14％、大于约16％、大于约18％、大于约20％、大于约25％、大于约30％、大于约35％、大于约40％、大于约45％或大于约50％的量存在于制剂中。在某些实施方案中，本文提供的合适的渗透促进剂的合适量由本领域技术人员确定。

不希望受限于任何特定理论，本文提供的渗透促进剂可以尤其通过促进MIV-818通过胃肠壁的运输(例如，增加其速率或程度)而起作用。一般而言，通过胃肠壁的运动可以通过例如以下发生：被动扩散，例如药物以仅由浓度梯度驱动的方式跨膜运动；载体介导的扩散，例如药物通过嵌入细胞膜的专门运输系统跨细胞膜运动；细胞旁扩散，例如药物通过在两个细胞之间而不是穿过两个细胞的跨膜运动；和跨细胞扩散，例如药物跨细胞的运动。

此外，有许多细胞蛋白能够通过泵出进入细胞的药物来防止药物的细胞内积累。这些有时称为外排泵。一种这样的外排泵涉及p-糖蛋白，它存在于身体的许多不同组织中(例如，肠道、胎盘膜、血脑屏障)。渗透促进剂尤其可以通过促进上述任何过程(例如通过增加膜的流动性、打开细胞之间的紧密连接和/或抑制流出等)来发挥作用。

在一个实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第7天和第21天给药。

在一个实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第1天给药。

在一个实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第8天和第21天给药。

在一个实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在21天周期中的第1天给药。

在一个实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在14天周期中的第1天给药。

在一个实施方案中，MIV-818以每天约50mg、约100mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg或约600mg的量给药。

在一个实施方案中，MIV-818以每天约300mg的量给药。

在一个实施方案中，MIV-818以每天约200mg的量给药。

在一个实施方案中，MIV-818每天给药一次。

在一个实施方案中，MIV-818每天给药两次。

在一个实施方案中，MIV-818以约200mg、约150mg或约100mg的量每天两次给药。在一个实施方案中，MIV-818以约200mg的量每天两次给药。在一个实施方案中，MIV-818以约150mg的量每天两次给药。在一个实施方案中，MIV-818以约100mg的量每天两次给药。

在一个实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体肠胃外给药。

在一个实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每千克受试者质量约0.5mg抗PD1/抗PDL1单克隆抗体、约1mg/Kg、约2mg/Kg、约3mg/Kg、约4mg/Kg、约5mg/Kg、约6mg/Kg、约7mg/Kg、约8mg/Kg、约9mg/Kg、约10mg/Kg、约11mg/Kg、约12mg/Kg、约13mg/Kg、约14mg/Kg、约15mg/Kg、约16mg/Kg、约17mg/Kg、约18mg/Kg、约19mg/Kg或约20mg/Kg的量给药。

在一个实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体以每天约10mg/Kg的量静脉内给药。

在一个实施方案中，抗PD1/抗PDL1单克隆抗体在28天周期中的第7天和第21天或在28天周期中的第8天和第21天以每天约10mg/Kg的量静脉内给药。

在一个实施方案中，抗PD1单克隆抗体是派姆单抗、MK-3475、匹地利珠单抗、纳武单抗(BMS-936558、MDX-1106或ONO-4538)，并且作为30分钟静脉内输液给药。

在一个实施方案中，抗PDL1单克隆抗体是BMS-936559、阿特珠单抗(MPDL3280A)或德瓦鲁单抗(MEDI4736)，并且作为30分钟静脉内输注给药。

在一个实施方案中，在每个28天治疗周期的第1天通过1小时静脉内(IV)输注给予1500mg德瓦鲁单抗(MEDI4736)。

在某些实施方案中，治疗肝肿瘤的方法包括以单次或多次日剂量口服给予包含MIV-818的制剂。在具体实施方案中，包含MIV-818的(多种)制剂每天一次、每天两次、每天三次、每天四次或每天多于四次口服给药。例如，在某些实施方案中，使用包括每天一次、两次、三次或四次给予约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg或约1000mg，持续7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天的治疗周期来给予包含MIV-818的制剂。

在某些实施方案中，治疗方法包括连续低剂量给药。在某些实施方案中，包含MIV-818的制剂使用包括每天两次给予约300mg MIV-818，持续7天的治疗周期给药。在某些实施方案中，包含MIV-818的制剂使用包括每天两次给予约300mg MIV-818，持续14天的治疗周期给药。在某些实施方案中，包含MIV-818的制剂使用包括每天三次给予约300mg MIV-818，持续7天的治疗周期给药。在某些实施方案中，包含MIV-818的制剂使用包括每天三次给予约300mg MIV-818，持续14天的治疗周期给药。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括使用本文提供的一个或多个周期给予包含MIV-818的制剂，并重复一个或多个周期持续例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或超过12个月的时间段。

在某些实施方案中，本文提供的方法包括每天向受试者给予MIV-818的口服制剂，持续7天或更多天、8天或更多天、9天或更多天、10天或更多天、11天或更多天、12天或更多天、13天或更多天、14天或更多天、15天或更多天、16天或更多天、17天或更多天、18天或更多天、19天或更多天、20天或更多天或21天或更多天。

在某些实施方案中，MIV-818的剂量可以为例如约50mg/m²/天至约2000mg/m²/天、约100mg/m²/天至约1000mg/m²/天、约100mg/m²/天至约500mg/m²/天、或约120mg/m²/天至约250mg/m²/天。在某些实施方案中，具体的剂量为例如约120mg/m²/天、约140mg/m²/天、约150mg/m²/天、约180mg/m²/天、约200mg/m²/天、约220mg/m²/天、约240mg/m²/天、约250mg/m²/天、约260mg/m²/天、约280mg/m²/天、约300mg/m²/天、约320mg/m²/天、约350mg/m²/天、约380mg/m²/天、约400mg/m²/天、约450mg/m²/天或约500mg/m²/天。

VI.实施例

实施例1

肿瘤免疫微环境分析的体外模型

如上所述，MIV-818在啮齿动物血浆中极不稳定，因此不能用在反映免疫系统在肿瘤发生和癌症治疗中的作用的标准鼠模型中。因此，我们采用了由Eurofins Scientific子公司DiscoverX(www.discoverx.com)商业提供的肿瘤免疫微环境的复杂细胞培养模型BioMAP。与要求PDL-1单克隆抗体被鼠等价物代替的鼠模型相比，该系统的另一个优势在于它使用人细胞，从而允许使用在小鼠中没有活性的人PDL-1单克隆抗体(例如派姆单抗)。

为了概括多组分TME中显示的复杂信号传导网络，BioMAP Oncology系统在存在特定癌细胞系的情况下将人类原代免疫细胞与原代组织细胞共培养。这些共培养物被亚有丝分裂水平的T细胞受体(TCR)配体刺激，以启动，但未最大程度地激活T细胞和募集到肿瘤内微环境的模型免疫细胞。

有两种BioMAP肿瘤学套组(panel)，其模拟结肠癌(HT-29CRC细胞系)环境下或非小细胞肺癌(NCI-H1299 NSCLC细胞系)环境下的免疫基质(成纤维细胞)和免疫血管(内皮细胞)环境之间的相互作用。Stro肿瘤学系统捕获肿瘤细胞、受刺激的免疫细胞(外周血单核细胞(PBMC))和宿主基质网络(人类新生儿真皮成纤维细胞(HDFn))之间的相互作用。与此同时，Vasc系统捕获肿瘤细胞、激活的免疫细胞和血管组织(人脐静脉内皮细胞(HUVEC))之间的相互作用。为肿瘤学套组选择的生物标志物报告在宿主肿瘤微环境的环境中与炎症、免疫功能、组织重塑和转移相关的活动。统称为肿瘤学CRC套组和肿瘤学NSCLC套组。

BioMAP系统中的人类原代细胞用于早期传代(第4代或更早)，以使对细胞培养条件的适应最小化并保留生理信号传导反应。所有原代细胞汇集自多名供体(n＝3–6)，由商业购买并根据制造商的推荐处理。HT-29CRC细胞系和NCI-H1299 NSCLC细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。使用缩写如下：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、外周血单核细胞(PBMC)、人新生儿真皮成纤维细胞(HDFn)和T细胞受体(TCR)。肿瘤学CRC套组和NSCLC套组两者中的系统都受到亚有丝分裂水平的通过TCR起作用的超抗原(SAg)的刺激，以重现免疫细胞向肿瘤环境的原位募集。这些刺激条件经过优化以激活或启动T细胞，但不驱动T细胞增殖。

每个CRC系统中使用的细胞类型如下：StroHT29系统[HT-29结肠直肠腺癌细胞系+HDFn+PBMC]和VascHT29系统[HT-29结肠直肠腺癌细胞系+HUVEC+PBMC]。不希望受理论束缚，认为鉴于基质组织在HCC中的重要性，并且观察到HT-29也对单独的MIV-818(约0.02uM)敏感，具有与代表性HCC细胞系相当的IC₅₀(例如HepG2约0.02uM)，StroHT29系统特别适合模拟HCC。

所有原代人类细胞都是根据机构审查委员会(IRB)审查的协议获得的，这些协议按照美国卫生和人力资源部的EPA法规40CFR 26和HHS法规45CFR 46的要求运作，用于保护人类研究受试者。

在附图中，生物标志物从左到右为：

StroHT29	VascHT29
		CD106/VCAM-1	CCL2/MCP-1
CD87/uPAR	CD106/VCAM-1
		CEACAM5/CD66e	CD40
胶原蛋白I	CD69
		胶原蛋白III	CD87/uPAR
CXCL10/P-10	CEACAM5/CD66e
		角蛋白20	胶原蛋白IV
MMP-9	CXCL10/P-10
		PAI-I	CXCL9/MIG
PBMC细胞毒性	角蛋白20
		sGranzyme B	PBMC细胞毒性
sIFNg	sGranzyme B
		sIL-10	sIFNg
sIL-17A	sIL-10
		sIL-2	sIL-17A
sIL-6	sIL-2
		SRB	sIL-6
sTNF-α	SRB
		sVEGF	sTNF-α
TMP-2
		tPA
uPA

在图1-7中的每个BioMAP读数中，Y轴是从-1.0延伸到+1.0的对数比。MIV-818编码为MV087313。

贴壁细胞类型在96孔板中培养直至融合，然后加入PBMC。在刺激前1小时以指定浓度添加以DMSO(小分子；终浓度≤0.1％)或PBS(生物制剂)制备的测试药剂，并在培养物中保持48小时。每个板包含药物对照(例如，传统对照测试试剂秋水仙碱)、阴性对照(例如，非刺激条件)和溶媒对照(例如，0.1％DMSO)。直接ELISA用于测量细胞相关的和细胞膜靶标的生物标志物水平。使用

检测、基于微珠的多重免疫分析或捕获ELISA对上清液中的可溶性因子进行定量。测试药剂对细胞活力的影响(细胞毒性)，在指定的时间点，贴壁细胞(48小时)通过磺基罗丹明B(SRB)进行测量，悬液中的细胞(42小时)通过

还原进行测量。所有测试药剂均以标准化格式在4个浓度下进行测试，一式三份。在每个板上包括作为对照的秋水仙碱刺激的孔、溶媒对照处理的孔和没有刺激的孔(n＝3-8)。数据接受标准基于板性能(对照的CV百分比)和阳性对照在与历史对照进行比较的分析中的表现。

数据分析

对于测试药剂处理的样品，对生物标志物测量进行一式三份的分析，并除以溶媒对照样品(来自同一平板的至少6个溶媒对照)的平均值，以生成一个比率，然后将其进行log10转换。使用历史溶媒对照数据以95％的置信区间计算显著性预测包络。统计p值是根据与溶媒对照相比的原始分析值的未配对t检验统计数据计算的。

曲线标注–当测试药剂的至少一个浓度在显著性包络外且与溶媒对照相比效应量>20％(|log10比率|>0.1)以及p值<0.01时，生物标志物活性被标注。当总蛋白质水平下降超过50％(SRB的log10比率<-0.3)时发生细胞毒性条件，并由X轴上方的黑色细箭头表示。从生物标志物活性标注和下游基准分析中排除具有可检测的广泛细胞毒性的测试药剂的浓度。细胞毒性箭头只需要一种浓度来满足用于曲线标注的指定的log10比率阈值，并且不包括p值要求。

叠加分析–将测试药剂的一种浓度的曲线与来自BioMAP肿瘤学套组基准列表的指定的基准化合物的曲线进行比较，或者测试药剂的一种浓度的曲线可以是当前客户项目或先前项目中的另一种化合物的叠加。当两个曲线的读数在显著性包络外且在同一方向上的效应量>20％(|log10比率|>0.1)时，对共同的生物标志物读数进行标注。当一条曲线的读数在显著性包络外且效应量>20％(|log10比率|>0.1)，而另一条曲线的读数在包络内或相反方向时，对差异化的生物标志物进行标注。

分析

现在转向图1，很明显的是，单独施用于两个套组的MIV-818在各种免疫标志物上显示出独特的模式，在特定标志物上显示出良好的剂量反应，表明免疫系统的刺激可以导致抗肿瘤反应。所采用的MIV-818的剂量对应于1uM、200nM、40nM和8nM。HT-29和外周血单核细胞(PBMC)的血管或基质模型的MIV-818处理导致分泌蛋白的多重变化，表明不同途径的变化：

·免疫相关的活性：sIL-6降低；sIL-17A、sIFNγ升高

·炎症相关的活性：VCAM-1、IP-10降低

·基质重塑活性：胶原蛋白III降低

血管生成相关的活性：uPAR降低

这一发现是令人惊讶和兴奋的，因为MIV-818最初是作为一种对肝细胞具有直接活性的细胞毒性药物开发的。这一发现为MIV-818与特定类别的免疫肿瘤药剂(即阻断PD-L1和/或PD-L2与PD-1结合的单克隆抗体)的组合开辟了道路，如以下实例所示。

为了比较，图7描绘了单独的派姆单抗在两个套组上的相应分析，剂量对应于50000ng/ml、10000ng/ml、2000ng/ml和400ng/ml。特别注意的是，与派姆单抗的反应模式(阳性、阴性或无影响)以及剂量反应程度与图1显著不同。

图2是本发明设想的组合—以下储备溶液的BioMAP读数，所述储备溶液代表1000nM MIV-818和50ug/ml派姆单抗连续稀释1倍，(1000nM MIV-818和50ug/ml派姆单抗)

连续稀释0.2倍，(200nM MIV-818和10ug/ml派姆单抗)

连续稀释0.04倍，(40nM MIV-818和2ug/ml派姆单抗)

连续稀释0.008倍，(8nM MIV-818和0.4ug/派姆单抗)

MIV-818和派姆单抗的组合导致一系列细胞因子和分泌蛋白的变化增强，超过和高于单一药剂的作用。

组合的主要活性包括以下：

·免疫相关活性升高：sIL-10、sIL-17A、sGranB、sIL-2、sIFNγ升高；sIL-6被调节

·炎症相关的活性：VCAM-1、IP-10降低；sTNFα升高

图3是组合1000nM MIV-818/50ug派姆单抗组合叠加在相应的单一药剂上的BioMAP读数。特别注意的是，在以下系统中有14种标注的差异化活性：StroHT29(VCAM-1、胶原蛋白III、IP-10、sIFNγ、sIL-17A、sIL-2、sIL-6、sTNFα)和VascHT29(uPAR、IP-10、sIL-10、sIL-2、sIL-6、sTNFα)。

图4是组合200nM MIV-818/10ug/ml派姆单抗叠加在相应的单一药剂上的BioMAP读数；在以下系统中有12种标注的差异化活性：StroHT29(VCAM-1、IP-10、sGranB、sIL-6、sTNFα、sVEGF)和VascHT29(uPAR、IP-10、sIL-17A、sIL-2、sIL-6、sTNFα)。

图5是组合40nM MIV-818/2ug/ml派姆单抗叠加在相应的单一药剂上的BioMAP读数；在以下系统中有10种标注的差异化活性：StroHT29(sGranB、sIFNγ、sIL-10、sIL-17A、sIL-6、sTNFα)和VascHT29(uPAR、sIL-2、sIL-6、sTNFα)。

图6是组合8nM MIV-818/0.4ug/ml派姆单抗叠加在相应的单一药剂上的BioMAP读数；在以下系统中有7种标注的差异化活性：StroHT29(sIFNγ、sIL-17A、sIL-6、sVEGF)和VascHT29(uPAR、sIL-10、sTNFα)。

通过绘制单个独特的标志物可以更好地理解图2-6。例如，如图8所示，MIV-818与派姆单抗组合增强了免疫刺激细胞因子IFN-γ，图8是显示组分MIV-818和派姆单抗在肿瘤微环境的细胞培养模型中对基质IFNγ的剂量和比例之间的关系的图。干扰素γ(IFNγ)是一种细胞因子，参与针对感染的先天性和适应性免疫反应。可溶性IFNγ(sIFNγ)表现出依赖于环境的抗肿瘤发生活性和促肿瘤发生活性，并被归类为StroHT29系统中的免疫相关活性，所述StroHT29系统模拟结肠癌细胞系(CRC HT29)环境中免疫基质(成纤维细胞)环境之间的相互作用。

与单独的任一种药剂相比，MIV-818和派姆单抗的组合在基质HT-29系统中显示出明显的剂量反应增强的sIFNγ，表明诱导了增强的抗肿瘤免疫反应。类似地，图9显示了对血管IFNγ的增强的抗肿瘤免疫反应。

图10是显示在肿瘤微环境细胞培养模型中，组分MIV-818和派姆单抗对基质IL17A的剂量与比例之间的关系的图；白细胞介素17A(IL-17A)是一种促炎细胞因子，由激活的T细胞的亚群(Th17细胞)、γδT细胞和中性粒细胞分泌。IL-17A表现出促肿瘤功能(血管生成和转移)和抗肿瘤功能(诱导溶细胞T细胞反应)二者。可溶性IL-17A(sIL-17A)被归类为StroHT29系统中的免疫相关活性，所述StroHT29系统模拟结肠癌细胞系(CRC HT29)环境中免疫基质(成纤维细胞)环境之间的相互作用。

与单独的任一种药剂相比，MIV-818和派姆单抗的组合在基质HT-29系统中显示出明显的剂量反应增强的IL-17A，表明诱导了增强的抗肿瘤免疫反应。相比之下，图11显示血管IL-17A基本上不受该组合的影响，这与Stro HT29套组与HCC特别相关的设想一致，但重要的是没有看到拮抗作用的迹象。

图12是显示在肿瘤微环境的细胞培养模型中，组分MIV-818和派姆单抗对基质TNFα的剂量和比率之间的关系的图。肿瘤坏死因子α(sTNFα)是一种由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、T细胞和NK细胞产生的促炎细胞因子，在涉及全身炎症的疾病中起主要作用。在癌症中，TNFα具有多效作用，这些作用取决于环境，并且包括促进生长、存活、增殖、血管生成和肿瘤细胞死亡。可溶性TNFα(sTNFα)被归类为StroHT29系统中的炎症相关活性，所述StroHT29系统模拟结肠癌细胞系(CRC HT29)环境中免疫基质(成纤维细胞)环境之间的相互作用。

与单独的派姆单抗相比，MIV-818和派姆单抗的组合在基质HT-29系统中显示出明显的剂量反应增强的TNFα，表明诱导了增强的抗肿瘤免疫反应。相比之下，图13表明血管TNFα基本上不受该组合的影响，但重要的是没有看到拮抗作用的迹象。

图14是显示在肿瘤微环境的细胞培养模型中，组分MIV-818和派姆单抗对基质IL-6的剂量和比例之间的关系的图。与使用单独的派姆单抗观察到的增加相比，将MIV-818添加到派姆单抗中导致肿瘤促进细胞因子IL-6减少。白细胞介素6(IL-6)是一种分泌性促炎细胞因子和急性期反应物，由成纤维细胞、内皮细胞、T细胞、B细胞和单核细胞产生。在结直肠癌中，IL-6促进肿瘤细胞的增殖并抑制其凋亡。可溶性IL-6(sIL-6)被归类为StroHT29系统的免疫相关活性，所述StroHT29系统模拟结肠癌细胞系(CRC HT29)环境中的免疫基质(成纤维细胞)环境之间的相互作用。

与单独的派姆单抗相反，单独的和与派姆单抗组合的MIV-818抑制基质HT-29系统中的sIL-6，这导致sIL-6的中度增强。图15表明血管IL6基本上在该系统中不受组合的影响。

实施例2

在免疫刺激的外周血单核细胞(PBMC)培养物中体外刺激IL-2表达

在免疫反应过程中，T细胞增殖和肿瘤细胞杀伤的关键细胞因子是IL-2。可以在由超抗原，例如采用葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激的免疫细胞(PBMC)培养物中测试各种药剂对免疫细胞因子产生的影响。考虑到已知的作用机制，我们惊讶地观察到MIV-818在这样的SEB刺激的培养物中以剂量依赖性方式诱导IL-2表达，并且添加抗PD1检查点抑制剂派姆单抗增强了IL-2表达。这表明MIV-818与抗PD(L)1疗法的组合在治疗癌症时将具有提高的治疗功效。

方法

从三名健康供体中分离出人PBMC，计数并以均匀的密度铺板。在刺激前，将细胞与单独的或与派姆单抗组合的MIV-818以最多六种浓度孵育1小时。包括适当的对照：未刺激的细胞、仅在培养基存在下刺激的细胞(阳性对照)、在溶媒存在下刺激的细胞和在单一浓度的参考化合物存在下刺激的细胞。然后将细胞与单一浓度的葡萄球菌肠毒素B(SEB)孵育五天。通过氚标记的胸苷掺入定量细胞增殖。五天后收集培养物上清液并储存直至通过

分析来分析细胞因子IL-2。建立每个培养条件，一式三份。在每个培养孔上单份进行多重读数。

图16是显示在葡萄球菌肠毒素B刺激的PBMC培养物中细胞因子IL-2增加的图，所述细胞因子IL-2对于加剧T细胞抗肿瘤反应至关重要。IL-2表达由单独的MIV-818诱导，添加派姆单抗时观察到IL-2表达增强。

实施例3

PBMC介导的肿瘤细胞杀伤

作为免疫系统肿瘤细胞杀伤的模型，使用分离的外周血单核细胞(主要是T细胞)的体外模型，其中通过抗CD3抗体刺激T细胞受体(TCR)来激活T细胞。然后T细胞将执行细胞杀伤，并且可以测量向这种共培养物中添加化合物的作用。观察到MIV-818增强PBMC介导的癌细胞杀伤，表明MIV-818诱导与检查点抑制剂活性(派姆单抗)协同作用的效应。

方法

使用了来自三名健康供体的全血。在抗CD3刺激的存在下，在以限定的E:T比率添加到NucLight Red标记的肿瘤靶标之前，以密度梯度分离PBMC并计数。肿瘤细胞-PBMC共培养物与八种浓度的测试化合物一起孵育。包括适当的对照：单独的PBMC、单独的肿瘤细胞、在单一浓度的参考化合物存在下的肿瘤细胞/PBMC。在不存在刺激的PBMC的情况下，所有测试条件也被施加到(plated)肿瘤细胞上，以检测直接与化合物相关的肿瘤细胞毒性。通过对随时间推移的活的NucLight阳性肿瘤细胞计数来评价肿瘤杀伤。此外，胱天蛋白酶3/7染料用于确定凋亡的肿瘤细胞。使用实现实时定量活细胞荧光成像的IncuCyte ZOOM机器分析培养物。共培养物在68小时内成像。建立每个培养条件，一式三份。储存细胞培养上清液用于任选的细胞因子分析。

图17是显示在MIV-818和派姆单抗(凋亡SK-OV-3计数)存在下PBMC介导的肿瘤细胞杀伤活性的图。

从三名健康供体中分离出PBMC，并添加到具有抗CD3刺激和NucLight Red标记的SK-OV-3肿瘤细胞的共培养物中。将培养物与5000nM MIV-818或MIV-818+派姆单抗的组合连同溶媒对照孵育，一式三份。通过使用IncuCyte Zoom软件成像68小时，在共培养系统中监测SK-OV-3凋亡细胞死亡。数据显示为平均值+/-SEM(三名供体)。

上述实施方案仅旨在是示例性的，并且本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定具体化合物、材料和过程的许多等同方案。所有这样的等同方案都被认为在范围内并且被所附权利要求涵盖。

Claims (12)

1.式I的化合物或其药学上可接受的盐在治疗哺乳动物的肝癌中的用途，

其特征在于，与阻断PD-L1和/或PD-L2与PD-1结合的单克隆抗体同时或序贯治疗哺乳动物。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述单克隆抗体是抗PD1单克隆抗体，所述抗PD1单克隆抗体是人源化单克隆IgG4抗体。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述人源化单克隆IgG4抗体是派姆单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)、纳武单抗、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)或替雷利珠单抗(tislelizumab)。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述人源化单克隆IgG4抗体是派姆单抗。

5.根据权利要求3所述的用途，其中所述人源化单克隆IgG4抗体是纳武单抗。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述单克隆抗体是抗PDL1单克隆抗体，所述抗PDL1单克隆抗体是人源化单克隆IgG1抗体。

7.根据权利要求4所述的用途，其中所述IgG1抗体是阿特珠单抗、阿维单抗(avelumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab)。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述IgG1抗体是德瓦鲁单抗。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述癌症是HCC。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述式I的化合物口服给药，单克隆抗体肠胃外给药。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述化合物是至少90％ee的非对映异构体：

或其药学上可接受的盐。

12.一种用于治疗患有原发性或继发性肝肿瘤的哺乳动物的方法，其中所述化合物具有式I：

或为其药学上可接受的盐，其中所述方法包括周期性给予哺乳动物治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受的盐，和治疗有效量的阻断PD-L1或P-L2与PD1结合的单克隆抗体，其中所述化合物或其药学上可接受的盐口服给药，并且所述抗体肠胃外给药。

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