CN113440532A - 一种褐藻寡糖的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种褐藻寡糖或其药学上可接受的盐在制备用于治疗急性肾脏损伤的药物中的用途，其中所述褐藻寡糖为褐藻二糖、褐藻三糖和/或褐藻四糖。本发明还提供了一种褐藻寡糖或其药学上可接受的盐在制备用于阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变的药物中的用途。本发明的褐藻寡糖治疗急性肾脏损伤动物后，血清肌酐水平显著下降，肾脏的尿浓缩功能恢复明显，明显降低肾小管损伤因子(KIM‑1、NGAL)水平，炎症因子表达显著下降，肾脏病理改变显著改善，并随剂量增加，治疗作用增强。因此，本发明的褐藻寡糖具有较强的治疗急性肾脏损伤的功效。此外，发生急性肾脏损伤时，使用本发明的褐藻寡糖能够保护肾脏功能，阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变。
Description
技术领域
本发明涉及一种褐藻寡糖的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
糖类(Carbohydrate)与核酸、蛋白质一起并称为三大生命物质。褐藻胶主要存在于海带、马尾藻以及巨藻的细胞壁中，是一类直链、无分枝，具负电荷的多糖类化合物。褐藻胶是由β-D-(1,4)-甘露糖醛酸(Mannuronic acid，M)和α-L-(1,4)-古洛糖醛酸(Guluronicacid，G)组成的二元线型嵌段化合物。其分子中主要存在三种结构片段：β-D-(1,4)-甘露糖醛酸互相连接构成的聚甘露糖醛酸(Polymannuronate，PM)；α-L-(1,4)-古洛糖醛酸互相连接构成的聚古洛糖醛酸(Polyguluronate，PG)；M和G交替共聚形成的PMG片段。
褐藻胶的高粘度和成凝胶等特性使其作为凝固剂、增稠剂、稳定剂等广泛应用于食品、化工、医药、纺织等工业生产中。在医药领域，褐藻胶因其独特的理化性质和良好的生物相容性，在医用生物材料和药物缓控释材料方面具有广泛的应用。研究还发现褐藻胶具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等生物活性，但褐藻胶由于分子量大，凝胶性强，不容易被吸收，使其应用方面受到很大的限制。而寡糖由于结构明确、活性显著、吸收性好、副作用小等特点，已引起了人们的重视。
近年来，褐藻胶寡糖因结构独特，其活性研究成为了糖类药物研究中的热点，其生物活性研究取得了重要进展。人们研究发现，褐藻胶寡糖及其衍生物具有多种生物活性，例如抗氧化性、抗肿瘤、抗凝血、免疫调节、神经保护、抗炎活性、抗病毒活性、抗老年痴呆、抗尿路结石、抗糖尿病等。
糖类是一类高度复杂同时又变化多端的生物大分子。不像寡核苷酸和多肽，糖类不只是线性的寡聚体，而通常是分支的。在哺乳动物细胞上发现的常见的9种单糖可以连接成比20种天然存在的氨基酸或4种核苷酸相连接更具有多样性的结构。糖类化合物结构的这种复杂性使得从天然来源中获取纯的糖类化合物非常困难。不论化学裂解或酶法裂解，均难以分离得到均一聚合度的寡聚糖或多聚糖。迄今为止，几乎所有的研究采用的寡糖或多聚糖均为聚合度接近的一系列糖的混合物，这为其活性研究、代谢、毒理以及药物的质量研究等带来非常大的困难。
发明人前期的研究针对目前糖类研究的难点，开发了一系列专一性较强的褐藻胶裂解酶，可以分别将褐藻胶分解为纯度较高，非还原性末端具有共轭双键，聚合度均一的褐藻二糖、三糖或四糖；经过酶灭活，离心取上清液，浓缩后，再以凝胶柱或离子交换树脂进一步纯化为均一聚合度的褐藻二糖、三糖或四糖。所述褐藻二糖为ΔG和/或ΔM两种结构及其任意比例的组合；褐藻三糖为ΔGG、ΔGM、ΔMM和ΔMG四种结构及其任意比例的组合；褐藻四糖为ΔGGG、ΔGGM、ΔGMG、ΔGMM、ΔMMG、ΔMMM、ΔMGG和ΔMGM八种结构及其任意比例的组合；所有寡糖均为单糖1,4 位糖苷键连接；G代表α-L-古洛糖醛酸；M代表β-D-甘露糖醛酸；Δ表示α-L-古洛糖醛酸和/或β-D-甘露糖醛酸4,5位发生β-消除，生成非还原端4,5 位为共轭双键的不饱和单糖；各单糖的结构如下所示：
以ΔGM为例，相应褐藻三糖的结构如下：
急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)，以往称为急性肾衰竭，是指由多种病因引起的短时间内，肾功能快速下降而出现的临床综合征，表现为血清肌酐的快速增加及尿量的减少。据统计，全世界每年约有10％～20％的住院患者被诊断为AKI，ICU患者中甚至超过50％，其中85％的患者来自发展中国家。AKI可增加住院患者死亡率、延长住院时间、增加治疗费用，还可增加心血管事件、远期慢性肾脏病(CKD)和终末期肾脏病(ESRD) 的患病风险。尽管肾脏病学界对AKI日趋重视，但目前仍无特异治疗，发病率和死亡率仍然很高，AKI病人心血管事件发病率为38％，如心功能衰竭(风险增高58％)，急性心梗(风险增高40％)、高血压(风险增高22％)、中风(风险增高15％)等，AKI已成为威胁人类健康的世界性公共卫生问题。
当前尚无有效药物可以逆转AKI肾损伤。同一些继发性慢性肾脏疾病如高血压肾病等不同，AKI是肾实质(肾小球、肾小管及间质等)的原发性病变，病因复杂(如缺血、缺氧、毒物、药物、感染等等)，病程进展快速，部分病人会进展到慢性肾脏疾病并伴随如心血管疾病的并发症。早期诊断、及时干预能最大限度地减轻肾损伤、促进肾功能恢复。尽早识别并纠正可逆病因、维持内环境稳定、营养支持、防止并发症及肾脏替代治疗等，仍然是当前针对AKI的主要治疗策略。而高血压肾病是由于血压长期升高引起肾脏血管的病变，肾脏毛细血管变厚、增粗、肾小球纤维化、血管管腔变窄、肾动脉硬化、肾实质缺血、肾单位减少等。肾实质的改变会导致肾脏的血液滤过功能降低，肾功能下降。这是一种长期的、由血压持续升高所引起的肾脏继发性疾病，病程较长，控制血压是基本的治疗措施。当前治疗高血压肾病主要采用的是控制血压的疗法，然而，这种疗法不适用于治疗AKI。鉴于AKI的发病原因复杂，确定一种能使所有AKI 病人受益的单一疗法十分具有挑战性。
本发明针对褐藻寡糖进行了进一步研究，并提供一种褐藻寡糖在治疗急性肾脏损伤中的应用。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种褐藻寡糖的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一方面，本发明提供一种褐藻寡糖或其药学上可接受的盐在制备用于治疗急性肾脏损伤的药物中的用途，其中所述褐藻寡糖为褐藻二糖、褐藻三糖和/或褐藻四糖。
在本发明的某些实施方案中，所述褐藻寡糖是由单糖G、M和/或Δ通过1,4位糖苷键连接构成的；其中，G表示α-L-古洛糖醛酸，M表示β-D- 甘露糖醛酸，Δ表示α-L-古洛糖醛酸或β-D-甘露糖醛酸的4,5位发生β-消除，生成4,5位为共轭双键的不饱和单糖。
在本发明的某些实施方案中，所述褐藻二糖选自ΔG、ΔM或其组合。
在本发明的某些实施方案中，所述褐藻三糖选自ΔGG、ΔGM、ΔMM 和ΔMG中的一种或多种。
在本发明的某些实施方案中，所述褐藻四糖选自ΔGGG、ΔGGM、ΔGMG、ΔGMM、ΔMMG、ΔMMM、ΔMGG和ΔMGM中的一种或多种。
在本发明的某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和/或铵盐。
在本发明的某些实施方案中，所述急性肾脏损伤是由血液灌注不足、感染或药物的肾脏毒性导致的。
另一方面，本发明提供一种褐藻寡糖或其药学上可接受的盐在制备用于阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变的药物中的用途，其中所述褐藻寡糖为褐藻二糖、褐藻三糖和/或褐藻四糖。
在本发明的某些实施方案中，所述褐藻寡糖是由单糖G、M和/或Δ通过1,4位糖苷键连接构成的；其中，G表示α-L-古洛糖醛酸，M表示β-D- 甘露糖醛酸，Δ表示α-L-古洛糖醛酸或β-D-甘露糖醛酸的4,5位发生β-消除，生成4,5位为共轭双键的不饱和单糖。
在本发明的某些实施方案中，所述褐藻二糖选自ΔG、ΔM或其组合；所述褐藻三糖选自ΔGG、ΔGM、ΔMM和ΔMG中的一种或多种；和/或所述褐藻四糖选自ΔGGG、ΔGGM、ΔGMG、ΔGMM、ΔMMG、ΔMMM、ΔMGG 和ΔMGM中的一种或多种。
在本发明的某些实施方案中，所述药学上可接受的盐为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和/或铵盐；和/或所述急性肾脏损伤是由血液灌注不足、感染或药物的肾脏毒性导致的。
本发明的均一聚合度的褐藻二糖、三糖和四糖，对于糖类原料药的质量控制、药理、毒理等分析研究，均具有革命性进步。
研究发现，在缺血再灌注(I/R)、内毒素磷脂多糖(LPS)和抗肿瘤药物顺铂诱导的急性肾脏损伤动物模型上，褐藻二糖、三糖、四糖都有非常明显的保护作用。本发明的褐藻寡糖治疗急性肾脏损伤动物后，血清肌酐水平显著下降，肾脏的尿浓缩功能恢复明显，明显降低肾小管损伤因子 (KIM-1、NGAL)水平，炎症因子表达显著下降，肾脏病理改变显著改善，并随剂量增加，治疗作用增强。本发明的褐藻寡糖能明显抑制细胞自噬、内质网应激及细胞凋亡的发生，显示其具有很好的细胞保护作用，能够防止肾脏上皮细胞的损伤，维持细胞稳态，维护肾脏功能。因此，本发明的褐藻寡糖具有较强的治疗急性肾脏损伤的功效。此外，发生急性肾脏损伤时，使用本发明的褐藻寡糖能够保护肾脏功能，阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变。本发明所提供的褐藻寡糖类药物，来源于海洋藻类，无任何毒副作用，可长期使用。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了褐藻二糖在230nm波长下的高效液相色谱图；
图2示出了褐藻二糖的核磁氢谱图(1HNMR，溶剂D2O)；
图3示出了褐藻二糖的高分辨质谱图(HRMS(ESI))；
图4示出了褐藻三糖在230nm波长下的高效液相色谱图；
图5示出了褐藻三糖的核磁氢谱图(1HNMR，溶剂为D2O)；
图6示出了褐藻三糖的高分辨质谱图(HRMS(ESI))；
图7示出了褐藻四糖在230nm波长下的高效液相色谱图；
图8示出了褐藻四糖的核磁氢谱图(1HNMR，溶剂为D2O)；
图9示出了褐藻四糖的高分辨质谱图(HRMS(ESI))；
图10示出了褐藻二糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠血清肌酐水平的影响；
图11示出了褐藻二糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠尿量的影响；
图12示出了褐藻二糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠肾脏组织中Kim-1和NGAL的mRNA水平的影响；
图13示出了褐藻二糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图14示出了褐藻三糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠血清肌酐水平的影响；
图15示出了褐藻三糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠尿量的影响；
图16示出了褐藻三糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠肾脏组织中Kim-1和NGAL的mRNA水平的影响；
图17示出了褐藻三糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图18示出了褐藻三糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠肾脏组织损伤的病理切片的影响；
图19示出了褐藻四糖和混合糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠血清肌酐水平的影响；
图20示出了褐藻四糖和混合糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠尿量的影响；
图21示出了褐藻四糖和和混合糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠肾脏组织中Kim-1和NGAL的mRNA水平的影响；
图22示出了褐藻四糖对急性缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图23示出了褐藻二糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠血清肌酐水平的影响；
图24示出了褐藻二糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠肾脏组织中Kim-1和NGAL的mRNA水平的影响；
图25示出了褐藻二糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图26示出了褐藻二糖及地塞米松对照品对内毒素磷脂多糖(LPS) 引起的小鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图27示出了褐藻三糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠血清肌酐水平的影响；
图28示出了褐藻三糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠肾脏组织中Kim-1和NGAL的mRNA水平的影响；
图29示出了褐藻三糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图30示出了褐藻三糖及地塞米松对照品对内毒素磷脂多糖(LPS) 引起的小鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图31示出了褐藻三糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠肾脏组织损伤的病理切片的影响；
图32示出了褐藻四糖及混合糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠血清肌酐水平的影响；
图33示出了褐藻四糖及混合糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠肾脏组织中Kim-1和NGAL的mRNA水平的影响；
图34示出了褐藻四糖及混合糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图35示出了褐藻四糖、混合糖及地塞米松对照品对内毒素磷脂多糖 (LPS)引起的小鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图36示出了褐藻三糖对顺铂引起的小鼠血清肌酐水平的影响；
图37示出了褐藻三糖对顺铂引起的小鼠尿量的影响；
图38示出了褐藻三糖对顺铂引起的小鼠肾脏组织中Kim-1和NGAL 的mRNA水平的影响；
图39示出了褐藻三糖对顺铂引起的小鼠肾脏组织中炎症指标的影响；
图40示出了本发明实施例4和实施例5中所用的混合糖的质谱图；
图41示出了褐藻三糖对顺铂引起损伤的人肾小管上皮细胞(HK2 cell)中自噬指标的影响；
图42示出了褐藻三糖对顺铂引起损伤的人肾小管上皮细胞(HK2 cell)中内质网应激指标的影响；
图43示出了褐藻三糖对顺铂引起损伤的人肾小管上皮细胞(HK2 cell)中调亡指标的影响；
图44示出了褐藻三糖对长期缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠血清肌酐水平的影响；
图45示出了褐藻三糖对长期缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠尿量的影响；
图46示出了褐藻三糖对长期缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠肾脏组织中尿渗透压的影响；
图47示出了褐藻三糖对长期缺血再灌注(I/R)损伤引起的大鼠肾脏组织中水通道蛋白的影响；
图48示出了单侧输尿管梗阻(UUO)损伤对大鼠肾脏中纤维化蛋白的影响；
图49示出了褐藻三糖对单侧输尿管梗阻(UUO)损伤引起的大鼠肾脏中纤维化蛋白的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释和说明性的，绝不意味着以任何方式限制本发明的范围。
实施例1均一聚合度褐藻二糖的制备及其结构鉴定
将100g采购的褐藻胶(购自青岛明月海藻集团有限公司)溶于水，在一定温度下，加入褐藻糖裂解酶(获得自中国海洋大学)，经过一定时间的裂解后，高速离心机离心，取上层清液。将清液再以凝胶柱纯化，去除少量的杂质寡糖和多糖及非糖类杂质，得到纯度95％以上的褐藻二糖钠盐60g。将所得褐藻二糖钠盐用高效液相色谱法(HPLC，230nm)进行纯度检测，并用核磁氢谱(1HNMR)和高分辨质谱(HRMS-ESI)进行结构鉴定。
HPLC：纯度99.06％，RT＝13.6min(相关谱图见图1)；
1HNMR谱图见图2；
HRMS(ESI)m/z:C12H15O12{(M-H)-}，计算值为351.0569，实测值为351.0572(M-H)-。(相关谱图见图3)；
褐藻二糖钠盐，如果分子中两个羧基均为钠盐，则钠离子理论含量为 11.58％；实际离子色谱法检测，钠离子含量为10.3％。如用炽灼残渣法检测，则钠离子以硫酸钠的形式存在，理论残渣比例应该为35.77％；实际炽灼残渣检测，残渣为34.3％；两种检测方法所得结果均比较接近，说明化合物羧酸官能团确为钠盐形式。但实测值均略小于理论值，可能是因为其钠盐为弱酸强碱盐，有少部分羧酸仍呈游离状态。
实施例2均一聚合度褐藻三糖的制备及其结构鉴定
将100g采购的褐藻胶溶于水，在一定温度下，加入褐藻糖裂解酶(获得自中国海洋大学)，经过一定时间的裂解后，高速离心机离心，取上层清液。将清液再以凝胶柱纯化，去除少量的杂质寡糖和多糖及非糖类杂质，得到纯度95％以上的褐藻三糖钠盐70g。将所得褐藻三糖钠盐用高效液相色谱法(HPLC，230nm)进行纯度检测，并用核磁氢谱(1HNMR)和高分辨质谱(HRMS-ESI)进行结构鉴定。
HPLC：纯度100％，RT＝17.43min(相关谱图见图4)；
1HNMR谱图见图5；
HRMS(ESI)m/z:C18H23O18{(M-H)-}，计算值为527.0890，实测值为527.0891(M-H)-。(相关谱图见图6)；
褐藻三糖钠盐，如果分子中三个羧基均为钠盐，则钠离子理论含量为 11.59％；实际离子色谱法检测，钠离子含量为9.9％。如用炽灼残渣法检测，则钠离子以硫酸钠的形式存在，理论残渣比例应该为35.80％；实测炽灼残渣为33.01％。两种检测方式，所得结果均比较接近，说明化合物羧酸官能团确为钠盐形式。但实测值均略小于理论值，可能是因为其钠盐为弱酸强碱盐，有少部分羧酸仍呈游离状态。
实施例3均一聚合度褐藻四糖的制备及其结构鉴定
将100g采购的褐藻胶溶于水，在一定温度下，加入褐藻糖裂解酶(获得自中国海洋大学)，经过一定时间的裂解后，高速离心机离心，取上层清液。将清液再以凝胶柱纯化，去除少量的杂质寡糖和多糖及非糖类杂质，得到纯度95％以上的褐藻四糖钠盐55g。将所得褐藻四糖钠盐用高效液相色谱法(HPLC，230nm)进行纯度检测，并用核磁氢谱(1HNMR)和高分辨质谱(HRMS-ESI)进行结构鉴定。
HPLC：纯度99.71％，RT＝18.71min(相关谱图见图7)；
1HNMR谱图见图8；
HRMS(ESI)m/z：C24H31O24{(M-H)-}，计算值为703.1211，实测值为703.1207(M-H)-。(相关谱图见图9)；
褐藻四糖钠盐，如果分子中四个羧基均为钠盐，则钠离子理论含量为 11.59％；实测离子色谱法检测，钠离子含量为9.8％。如用炽灼残渣法检测，则钠离子以硫酸钠的形式存在，理论残渣比例应该为35.80％；实测炽灼残渣，残渣为32.5％。两种检测方式，所得结果均比较接近，说明化合物羧酸官能团确为钠盐形式。但实测值均略小于理论值，可能是因为其钠盐为弱酸强碱盐，有少部分羧酸仍呈游离状态。
实施例4均一聚合度褐藻寡糖对缺血再灌注(I/R)引起的大鼠急性肾脏损伤(acute kidney injury,AKI)的影响
缺血再灌注导致的肾脏损伤是模拟临床血液灌注不足导致的急性肾脏损伤的标准动物模型。发明人利用大鼠缺血再灌注模型，分别给药实施例1～3制备的均一聚合度的褐藻寡糖及其混合物，并与空白组和模型不给药组进行对比，考察各均一聚合度褐藻寡糖的治疗效果。
一、褐藻二糖对缺血再灌注引起的大鼠急性肾脏损伤的影响
选取Sprague Dawley大鼠，中山大学实验动物中心购买，220-250克雄性大鼠30只，术前收集24小时尿量测定无异常，将造模大鼠进行随机分组，分为假手术组、模型组、褐藻二糖0.01、0.05、0.1g/kg/天三个剂量组(每组6只)。在本发明中，褐藻二糖简称为“AOS2”。药物采用灌胃给药，模型组、假手术组均灌服同体积生理盐水。手术当天，大鼠以3％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，常规消毒皮肤，从腹部开口，暴露左右侧肾脏，假手术组仅对肾脏进行检查，然后逐层缝合创口，结束手术；模型组及造模给药组使用大号动脉夹夹闭双侧的肾脏肾蒂，然后复位肾脏，以纱布覆盖创口并滴加少量生理盐水补液。45min后，松开双侧动脉夹，然后逐层缝合创口，结束手术。将手术后大鼠放置于37℃加热垫上等待大鼠复苏后放回代谢笼，期间检测大鼠体重、进食量、饮水量及尿量。术后常规饲养， 24小时后处死大鼠取材。血样收集从大鼠的下腔静脉处取血，离心后收集上层血清，然后使用南京建成的肌酐测定试剂盒使用试剂盒法测定大鼠血清肌酐(Serum creatinine)，实验结果采用t值法进行统计学处理，结果见图10。所收集的24小时尿量结果见图11。取材时分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，皮质保存于trizol中，使用时采用trizol法提取皮质中的 mRNA，检测AKI生物标记物(KIM-1、NGAL)的mRNA表达，结果见图12。加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，运用免疫印迹技术(western blotting)检测肾脏皮质组织中的炎症因子(p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β)，结果见图13。
图10显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠血清肌酐水平显著升高，不同剂量的AOS2不同程度地降低血清肌酐，提示AOS2具有肾脏保护作用。*表示与sham(假手术组)相比，p<0.05，#表示与I/R组(模型组)相比，p<0.05。
此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后肾脏的滤过功能发生障碍，血清肌酐显著增高。三种不同剂量的AOS2治疗后血清肌酐显著下降，提示肾小球功能有一定程度的恢复。特别是给药剂量为0.1g/kg/天时，血清肌酐基本可恢复至正常水平，说明AOS2对急性肾脏损害具有显著的治疗效果，其治疗效果具有一定程度的剂量依赖性。
图11显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠尿量增加，不同剂量的AOS2降低大鼠尿量，提示AOS2具有肾脏保护作用。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R组相比，p<0.05。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后肾脏的尿浓缩功能发生障碍，尿量显著增多。给予三种不同剂量的AOS2治疗后尿量有所下降，说明肾小管重吸收功能有一定程度的恢复。
图12显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠肾脏组织中急性肾脏损伤(AKI)指标(即肾小管损伤指标)Kim-1和NGAL的mRNA水平升高，剂量为0.1g/kg/天的AOS2明显降低了两个指标的表达，提示AOS2 具有肾脏保护作用。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R组相比， p<0.05。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后急性肾脏损伤(AKI) 指标KIM-1及NGAL表达呈显著性增高，提示肾小管损伤，0.1g/kg/天的 AOS2可以明显降低两种指标，说明AOS2对缺血再灌注引起的急性肾脏损伤有显著的保护作用。
图13显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，不同剂量的AOS2不同程度地抑制肾脏炎症反应，提示AOS2 具有肾脏保护作用。I/R+AOS2-L剂量为0.01g/kg/天；I/R+AOS2-M剂量为 0.05g/kg/天；I/R+AOS2-H剂量为0.1g/kg/天。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后肾脏炎症指标如TLR4、p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β显著上升，AOS2治疗减少炎症因子的产生，并呈一定的剂量依赖性，说明 AOS2的抗炎作用显著。
二、褐藻三糖对缺血再灌注引起的大鼠急性肾脏损伤的影响
使用与褐藻二糖相同的实验方法，考察褐藻三糖对缺血再灌注引起的大鼠急性肾脏损伤的影响。在本发明中，褐藻三糖简称为“AOS3”。使用南京建成的肌酐测定试剂盒使用试剂盒法测定大鼠血清肌酐，实验结果采用 t值法进行统计学处理，结果见图14。所收集的24小时尿量结果见图15。取材时分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，皮质保存于trizol中，使用时采用trizol法提取皮质中的mRNA，检测AKI生物标记物(KIM-1、NGAL)的mRNA表达，结果见图16。加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，运用免疫印迹技术(western blotting)检测肾脏皮质组织中的炎症因子(p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β)，结果见图17。此外，在最后一次取血后将动物处死，取肾固定于4％甲醛溶液中，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜观察一般肾组织形态，结果见图18。
图14显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠血清肌酐水平显著升高，不同剂量的AOS3不同程度地降低血清肌酐，提示AOS3具有肾脏保护作用。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R组相比，p<0.05。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后肾脏的滤过功能发生障碍，血清肌酐显著增高。三种不同剂量的AOS3治疗后血清肌酐显著下降，提示肾小球功能有一定程度的恢复。特别是给药剂量为0.1g/kg/天时，血清肌酐基本可恢复至正常水平，其治疗效果具有一定程度的剂量依赖性。
图15显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠尿量增加，不同剂量的AOS3降低大鼠尿量，提示AOS3具有肾脏保护作用。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R组相比，p<0.05。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后肾脏的尿浓缩功能发生障碍，尿量显著增多。三种不同剂量的AOS3治疗后尿量均有所下降，尤其是0.1g/kg/天的剂量给药，大鼠第二天的尿量基本恢复至接近正常水平，提示肾小管功能有一定程度的恢复。其治疗效果具有一定程度的剂量依赖性。
图16显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠肾脏组织中急性肾脏损伤(AKI)指标(即肾小管损伤指标)Kim-1和NGAL的mRNA水平升高，剂量为0.1g/kg/天的AOS明显降低两个指标的表达，提示AOS3具有肾脏保护作用。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R组相比，p<0.05。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后急性肾脏损伤(AKI)指标KIM-1 及NGAL表达呈显著性增高，0.1g/kg/天的AOS3可以明显降低两种指标，显示出AOS3对缺血再灌注引起的急性肾脏损伤有显著的保护作用。
图17显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，不同剂量的AOS3不同程度地抑制肾脏炎症反应，提示AOS3 具有肾脏保护作用。I/R+AOS3-L表示剂量为0.01g/kg/天；I/R+AOS3-M表示剂量为0.05g/kg/天；I/R+AOS3-H表示剂量为0.1g/kg/天。此结果表明： I/R组大鼠在缺血再灌注术后，肾脏炎症指标TLR4、p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β显著上升，不同剂量的AOS3治疗均可减少炎症因子的产生，并呈一定的剂量依赖性，说明褐藻三糖具有明显的抗炎作用。
图18显示了肾脏组织病理表现：假手术组(SHAM)：肾小球形态、系膜细胞和肾小管基本正常；I/R组肾小球发生萎缩脱落，系膜细胞和基质减少产生空洞，肾小管广泛扩张，管腔扩大，大量上皮细胞出现水肿、坏死和脱落，可见空泡样变性；I/R+AOS3(0.1g/kg/天)组肾小球和肾小管病变轻微。这些结果提示，I/R组肾小球和肾小管病变非常明显，而同样缺血再灌注后，再给予AOS3(0.1g/kg/天)治疗，肾脏损伤则非常轻微。说明AOS3对于缺血再灌注引起的大鼠肾脏形态学改变具有很好的保护作用。
三、褐藻四糖及混合糖对缺血再灌注引起的大鼠急性肾脏损伤的影响
使用与褐藻二糖和褐藻三糖相同的实验方式。将造模大鼠进行随机分组，分为假手术组、模型组、褐藻四糖(0.01、0.05、0.1g/kg/天三个剂量) 组和混合糖(聚合度为2-8的混合褐藻寡糖，其质谱图参见图40，获得自中国海洋大学，0.1g/kg/天一个剂量)组(每组6只)。在本发明中，褐藻四糖简称为“AOS4”，混合糖简称为“AOS(混)”。使用南京建成的肌酐测定试剂盒使用试剂盒法测定大鼠血清肌酐，实验结果采用t值法进行统计学处理，结果见图19。所收集的24小时尿量结果见图20。取材时分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，皮质保存于trizol中，使用时采用trizol 法提取皮质中的mRNA，检测AKI生物标记物(KIM-1、NGAL)的mRNA 表达，结果见图21。加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，运用免疫印迹技术(western blotting)检测肾脏皮质组织中的炎症因子 (p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β)，结果见图22。
图19显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠血清肌酐水平显著升高，不同剂量的AOS4和混合糖不同程度地降低血清肌酐，AOS4具有很好的肾脏保护作用。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R组相比， p<0.05。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后肾脏的滤过功能发生障碍，血清肌酐显著增高。三种不同剂量的AOS4和混合糖(0.1g/kg/天)治疗后血清肌酐显著下降，提示肾小球功能都有一定程度的恢复。特别是给药剂量为0.1g/kg/天的褐藻四糖，血清肌酐可恢复至接近正常水平。不同剂量的AOS4，其治疗效果具有一定程度的剂量依赖性。
图20显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠尿量增加，不同剂量的AOS4和混合糖(0.1g/kg/天)降低大鼠尿量，AOS4具有很好的肾脏保护作用。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R组相比，p<0.05。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后肾脏的尿浓缩功能发生障碍，尿量显著增多。三种不同剂量的AOS4和混合糖治疗后尿量有所下降，提示肾小管功能有一定程度的恢复，尤其是AOS4的治疗效果显著好于相同剂量的混合糖，治疗效果呈一定程度的剂量依赖性。
图21显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠肾脏组织中急性肾脏损伤(AKI)指标(即肾小管损伤指标)Kim-1和NGAL的mRNA水平升高，剂量为0.1g/kg/天的褐藻四糖明显降低两个指标的表达，提示其具有较好的肾脏保护作用。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R组相比， p<0.05。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后急性肾脏损伤(AKI) 指标KIM-1及NGAL表达呈显著性增高，0.1g/kg/天的AOS4可以明显降低两种指标，说明AOS4对缺血再灌注引起的急性肾脏损伤有很好的保护作用。
图22显示急性缺血再灌注(I/R)损伤引起大鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，不同剂量的AOS4可以不同程度地抑制肾脏炎症反应，提示 AOS4具有肾脏保护作用。I/R+AOS4-L表示剂量为0.01g/kg/天； I/R+AOS4-M表示剂量为0.05g/kg/天；I/R+AOS4-H表示剂量为0.1g/kg/天；I/R+AOS(混)-H表示剂量为0.1g/kg/天。此结果表明：I/R组大鼠在缺血再灌注术后肾脏炎症指标如TLR4、p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β显著上升，AOS4的治疗能明显减少炎症因子的产生，并呈一定的剂量依赖性，显示AOS4具有抗炎作用。
实验结论
缺血再灌注导致的肾脏损伤是模拟临床血液灌注不足导致的急性肾脏损伤的标准动物模型。褐藻二糖、三糖、四糖在给药不同剂量(0.01、 0.05、0.1g/kg/天)治疗后，大鼠血清肌酐水平显著下降，其中0.1g/kg/天剂量时血清肌酐水平均可基本恢复到正常值；给药治疗后，肾脏的尿浓缩功能恢复明显转好，尿量减少，其中0.1g/kg/天剂量组明显降低肾脏损伤因子(KIM-1、NGAL)水平，炎症因子表达显著下降，肾脏病理改变显著改善，并随剂量增加，治疗作用增强。综上所述，血清肌酐、尿量、炎症因子等不同指标的检测结果都显示，褐藻二糖、三糖、四糖均对缺血再灌注引起的大鼠急性肾脏损伤有很好的保护作用，并且与聚合度为2-8的混合褐藻寡糖相比，均一聚合度的褐藻二糖、三糖和四糖的治疗效果显著更好。
实施例5均一聚合度褐藻寡糖对内毒素磷脂多糖(LPS)引起的小鼠急性肾脏损伤的影响
内毒素磷脂多糖处理导致的肾脏损伤是模拟临床感染所致的急性肾脏损伤的标准动物模型。我们利用小鼠内毒素磷脂多糖模型，分别给予不同均一聚合度的褐藻寡糖及其混合物，并与空白组和模型不给药组进行对比，考察各均一聚合度褐藻寡糖的治疗效果。
一、褐藻二糖(AOS2)对LPS引起的小鼠急性肾脏损伤的影响
选取22-28克雄性C57/Bl6小鼠24只，术前收集24小时尿量测定无异常，将造模小鼠进行随机分组，分为对照组、模型组、模型+给药组(AOS2 0.1g/kg/天)和模型+阳性对照组(醋酸地塞米松0.1g/kg/天)每组6只，样品采用灌胃给药，模型组、对照组均灌服同体积生理盐水，地塞米松采用腹腔注射给药。采用LPS进行造模来诱导脓毒血症型急性肾脏损伤的发生，造模时各模型组腹腔注射LPS 15mg/kg，对照组腹腔注射等量生理盐水。造模后立刻将小鼠放回小鼠代谢笼进行观察，期间检测小鼠体重、进食量、饮水量及尿量。24小时后处死小鼠取材，收集尿液，血样收集从小鼠的下腔静脉处取血，离心后收集上层血清，然后使用南京建成的肌酐测定试剂盒使用试剂盒法测定小鼠血清肌酐，实验结果采用t值法进行统计学处理，结果见图23。取材时分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，皮质保存于trizol中，使用时采用trizol法提取皮质中的mRNA，使用Qpcr 法检测AKI生物标记物(KIM-1、NGAL，结果见图24)及炎症因子(IL-1β、 IL-18、TNF-α、MCP-1，结果见图25)的mRNA表达。加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，运用免疫印迹技术(westernblotting) 检测肾脏皮质组织中的炎症因子(p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β)，结果见图26。
图23显示LPS处理引起小鼠血清肌酐水平显著升高，AOS2明显降低血清肌酐，与地塞米松有同等的降低血清肌酐效果，提示褐藻二糖具有肾脏保护作用。Dex表示地塞米松，*表示与CTL(对照组)相比，p<0.05， #表示与LPS组(模型组)相比，p<0.05。此结果表明：与对照组相比，小鼠在腹腔注射LPS后血清肌酐显著增高，AOS2给药组小鼠血清肌酐明显下降，基本可恢复至正常水平，说明褐藻二糖对LPS引起的小鼠肾脏功能下降具有显著的保护作用。
图24显示LPS处理引起小鼠肾脏组织中急性肾脏损伤(AKI)指标 (即肾小管损伤指标)Kim-1和NGAL的mRNA水平升高，提示褐藻二糖具有肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与LPS组相比， p<0.05。此结果表明：小鼠在腹腔注射LPS后AKI指标(KIM-1、NGAL) 显著增高，AOS2治疗后，KIM-1及NGAL的产生显著减少，说明AOS2 对于LPS引起的小鼠肾脏损伤具有明显的保护作用。
图25显示LPS处理引起小鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，AOS2 比较明显地抑制肾脏炎症反应，提示褐藻二糖具有肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与LPS组相比，p<0.05。此结果表明：小鼠在腹腔注射LPS后炎症因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1)基因表达显著增高，AOS2治疗明显减低炎症因子的产生，提示褐藻二糖对于LPS 引起的小鼠急性肾脏损伤具有良好的保护作用。
图26显示LPS处理引起小鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，AOS2 明显抑制肾脏炎症反应，效果与阳性对照的地塞米松接近，提示AOS2具有肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与LPS组相比，p<0.05。此结果表明：LPS处理后，小鼠肾脏炎症指标如TLR4、p-NFκB/NFκB、 pro-IL-1β/IL-1β蛋白表达显著上升，AOS2治疗显著减少了炎症因子的产生，其效果与地塞米松作用接近，显示AOS2具有明显的抗炎作用。
二、褐藻三糖(AOS3)对LPS引起的小鼠急性肾脏损伤的影响
采用与褐藻二糖相同的实验方式。使用南京建成的肌酐测定试剂盒使用试剂盒法测定小鼠血清肌酐，实验结果采用t值法进行统计学处理，结果见图27。取材时分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，皮质保存于trizol 中，使用时采用trizol法提取皮质中的mRNA，使用Qpcr法检测AKI生物标记物(KIM-1、NGAL，结果见图28)及炎症因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1，结果见图29)的mRNA表达。加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，运用免疫印迹技术检测肾脏皮质组织中的炎症因子(p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β)，结果见图30。此外，在最后一次取血后将动物处死，取肾固定于4％甲醛溶液中，常规石蜡包埋，切片， HE染色，光镜观察一般肾组织形态，结果见图31。
图27显示LPS处理引起小鼠血清肌酐水平显著升高，AOS3明显降低血清肌酐，与地塞米松有同等的降低血清肌酐效果，提示褐藻三糖具有肾脏保护作用。Dex表示地塞米松，*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与 LPS组相比，p<0.05。此结果表明：与对照组相比，小鼠在腹腔注射LPS 后血清肌酐显著增高，AOS3给药组小鼠血清肌酐明显下降，基本可恢复至正常水平，提示褐藻三糖对LPS引起的小鼠肾脏功能下降具有显著的保护作用。
图28显示LPS处理引起小鼠肾脏组织中急性肾脏损伤(AKI)指标 (即肾小管损伤指标)Kim-1和NGAL的mRNA水平升高，提示褐藻三糖具有肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与LPS组相比， p<0.05。此结果表明：小鼠在腹腔注射LPS后AKI指标(KIM-1、NGAL) 显著增高，AOS3治疗后，KIM-1及NGAL的产生显著减少，提示AOS3 对于LPS引起的小鼠肾脏损伤具有保护作用。
图29显示LPS处理引起小鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，AOS3 比较明显地抑制肾脏炎症反应，提示褐藻三糖具有肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与LPS组相比，p<0.05。此结果表明：小鼠在腹腔注射LPS后炎症因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1)基因表达显著增高，AOS3治疗明显减低炎症因子的产生，证明褐藻三糖对于LPS 引起的小鼠急性肾脏损伤具有良好的保护作用。
图30显示LPS处理引起小鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，AOS3 明显抑制肾脏炎症反应，效果与阳性对照的地塞米松非常接近，提示AOS3 具有较好的肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与LPS组相比，p<0.05。此结果表明：LPS处理后，小鼠肾脏炎症指标如TLR4、 p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β蛋白表达显著上升，AOS3治疗显著减少炎症因子的产生，其效果与地塞米松作用非常接近，说明AOS3具有较好的抗炎作用。
图31.显示肾脏组织病理表现：对照组：肾小球形态、系膜细胞和肾小管基本正常，LPS组肾小球体积增大，肾间质可见炎性细胞浸润，肾小管广泛扩张，上皮细胞出现水肿、坏死和脱落，可见空泡样变性；LPS+AOS3 组肾小球和肾小管病变较轻微。这些结果显示AOS3对于内毒素磷脂多糖处理诱导的小鼠肾脏形态学改变具有显著的保护作用。
三、褐藻四糖(AOS4)及混合糖对LPS引起的小鼠急性肾脏损伤的影响
采用与褐藻二糖和褐藻三糖相同的实验方式。将造模小鼠进行随机分组，分为对照组、模型组、模型+给药组1(AOS4 0.1g/kg/天)、模型+给药组2(聚合度为2-8的混合褐藻寡糖，其质谱图参见图40，获得自中国海洋大学，0.1g/kg/天)和模型+阳性对照组(醋酸地塞米松0.1g/kg/天) 每组6只，样品采用灌胃给药，模型组、对照组均灌服同体积生理盐水，地塞米松采用腹腔注射给药。使用南京建成的肌酐测定试剂盒使用试剂盒法测定小鼠血清肌酐，实验结果采用t值法进行统计学处理，结果见图32。取材时分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，皮质保存于trizol中，使用时采用trizol法提取皮质中的mRNA，使用Qpcr法检测AKI生物标记物(KIM-1、NGAL，结果见图33)及炎症因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、 MCP-1，结果见图34)的mRNA表达。加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，运用免疫印迹技术检测肾脏皮质组织中的炎症因子 (p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β)，结果见图35。
图32显示LPS处理引起小鼠血清肌酐水平显著升高，混合糖对降低血清肌酐有一定效果，AOS4则明显降低血清肌酐，与地塞米松的降低血清肌酐效果接近，提示褐藻寡糖具有肾脏保护作用。Dex地塞米松，*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与LPS组相比，p<0.05。此结果表明：与对照组相比，小鼠在腹腔注射LPS后血清肌酐显著增高，AOS4和地塞米松给药组小鼠血清肌酐明显下降，基本可恢复至正常水平，说明褐藻四糖对LPS引起的小鼠肾脏功能下降具有显著的保护作用，其效果与地塞米松接近。
图33显示LPS处理引起小鼠肾脏组织中急性肾脏损伤(AKI)指标 (即肾小管损伤指标)Kim-1和NGAL的mRNA水平升高，褐藻四糖和混合糖(剂量0.1g/kg/天)给药后，两个指标均有所降低，尤其是褐藻四糖，使两个指标均明显降低，提示褐藻四糖具有较好的肾脏保护作用。* 表示与CTL相比，p<0.05，#表示与LPS组相比，p<0.05。此结果表明：小鼠在腹腔注射LPS后AKI指标(KIM-1、NGAL)显著增高，AOS4给药治疗后，KIM-1及NGAL的产生显著减少，提示褐藻四糖对于LPS引起的小鼠肾脏损伤具有保护作用。
图34显示LPS处理引起小鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，AOS4 和混合糖比较明显地抑制肾脏炎症反应，其中AOS4具有较好的肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与LPS组相比，p<0.05。此结果表明：小鼠在腹腔注射LPS后炎症因子(IL-1β、IL-18、TNF-α、MCP-1) 基因表达显著增高，AOS4和混合糖治疗可以明显减低炎症因子的产生，其中AOS4对于LPS引起的小鼠急性肾脏损伤具有良好的保护作用。
图35显示LPS处理引起小鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，AOS4 和混合糖明显抑制肾脏炎症反应，效果与阳性对照的地塞米松接近，提示 AOS4具有较好的肾脏保护作用。*表示与CTL组相比，p<0.05，#表示与 LPS组相比，p<0.05。此结果表明：LPS处理后，小鼠肾脏炎症指标如TLR4、p-NFκB/NFκB、pro-IL-1β/IL-1β蛋白表达显著上升，褐藻四糖和混合糖治疗显著减少炎症因子的产生，其效果与地塞米松作用基本一致，说明其具有非常有效的抗炎作用。
实验结论
内毒素磷脂多糖(LPS)处理导致的肾脏损伤是模拟临床感染所致的急性肾脏损伤的标准动物模型。LPS处理的模型组小鼠血清肌酐水平显著升高，褐藻二糖、三糖、四糖0.1g/kg/天治疗小鼠后，血清肌酐水平显著下降；肾脏损伤因子(KIM-1、NGAL)水平及炎症因子表达显著下降，肾脏病理改变显著改善。聚合度为2-8的混合糖对以上指标也均有不同程度的改善，但与褐藻二糖、三糖和四糖有一定差距。这些结果表明均一聚合度的褐藻寡糖对内毒素磷脂多糖引起的急性肾脏损伤有很好的保护作用。
实施例6均一聚合度褐藻寡糖对顺铂(Cisplatin)引起的小鼠急性肾脏损伤的影响
顺铂处理导致的肾脏损伤是模拟临床上药物的直接肾脏毒性作用所致的急性肾脏损伤的标准动物模型。我们利用小鼠顺铂模型，分别给予不同均一聚合度的褐藻寡糖及其混合物，并与空白组和模型不给药组进行对比，考察各均一聚合度褐藻寡糖的治疗效果。
一、褐藻三糖(AOS3)对顺铂引起的小鼠急性肾脏损伤的影响
选取22-28克雄性C57BL/J6小鼠30只，术前收集24小时尿量测定无异常，将造模小鼠进行随机分组，分为对照组(CTL)、模型组(Cis)、模型+给药低剂量组(AOS3 0.05g/kg/天，Cis+AOS3-L)、模型+给药中剂量组(AOS3 0.1g/kg/天，Cis+AOS3-M)和模型+给药高剂量组(AOS3 0.2g/kg/天，Cis+AOS3-H)每组6只，褐藻三糖采用灌胃给药，模型组、对照组均灌服同体积生理盐水。采用顺铂进行造模来诱导药物毒性型急性肾脏损伤的发生，造模时各模型组腹腔注射顺铂20mg/kg，对照组腹腔注射等量生理盐水。造模后立刻将小鼠放回小鼠代谢笼进行观察，期间检测小鼠体重、进食量、饮水量及尿量(结果见图37)。72小时后处死小鼠取材，收集尿液，血样收集从小鼠的下腔静脉处取血，离心后收集上层血清，然后使用南京建成的肌酐测定试剂盒使用试剂盒法测定小鼠血清肌酐，实验结果采用t值法进行统计学处理，结果见图36。取材时分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，皮质保存于trizol中，使用时采用trizol法提取皮质中的mRNA，使用Qpcr法检测AKI生物标记物(KIM-1、NGAL，结果见图38)mRNA表达。加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，运用免疫印迹技术(western blotting)检测肾脏皮质组织中的炎症因子(p-NFκB/NFκB、IL-1β)，结果见图39。
图36显示顺铂处理引起小鼠血清肌酐水平显著升高，AOS3明显降低血清肌酐，提示褐藻三糖具有肾脏保护作用。*表示与CTL组(对照组) 相比，p<0.05，#表示与Cis组(模型组)相比，p<0.05。此结果表明：与对照组相比，小鼠在腹腔注射顺铂后血清肌酐显著增高，AOS3给药组小鼠血清肌酐明显下降，基本可恢复至正常水平，说明褐藻三糖对顺铂引起的小鼠肾脏功能下降具有显著的保护作用。
图37显示顺铂引起的小鼠在24h尿量先增加随后72h减少进入少尿期，不同浓度的AOS3给药后在24h先是降低小鼠尿量恢复肾脏功能随后尿量逐渐趋于正常，提示褐藻三糖具有肾脏保护作用。*表示与CTL相比， p<0.05，#表示与模型组相比，p<0.05。此结果表明：模型组小鼠在顺铂注射后肾脏的尿浓缩功能发生障碍，尿量先显著增多随后进入少尿期。三种不同剂量的AOS3治疗后尿量先是有所下降随后趋于正常，提示肾小管功能有一定程度的恢复。并呈一定程度的剂量依赖性。
图38显示顺铂处理引起小鼠肾脏组织中急性肾脏损伤(AKI)指标(即肾小管损伤指标)Kim-1和NGAL的mRNA水平升高，提示褐藻三糖具有肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与模型组相比，p<0.05。此结果表明：小鼠在腹腔注射顺铂后AKI指标(KIM-1、NGAL)显著增高，AOS3治疗后，KIM-1及NGAL的产生显著减少，说明AOS3对于顺铂引起的小鼠肾脏损伤具有明显的保护作用。
图39显示顺铂处理引起小鼠肾脏组织中炎症指标显著增加，AOS3明显抑制肾脏炎症反应，提示AOS3具有肾脏保护作用。*表示与CTL相比， p<0.05，#表示与模型组相比，p<0.05。此结果表明：顺铂处理后，小鼠肾脏炎症指标如TLR4、p-NFκB/NFκB、IL-1β蛋白表达显著上升，AOS3治疗显著减少了炎症因子的产生，显示AOS3具有明显的抗炎作用。
同样地，进一步研究发现，褐藻二糖和褐藻四糖对顺铂引起的小鼠急性肾脏损伤也具有与褐藻三糖类似的功效。
实验结论
顺铂处理的模型组小鼠血清肌酐水平显著升高，褐藻二糖、三糖、四糖0.1g/kg/天治疗小鼠后，血清肌酐水平显著下降；肾脏损伤因子(KIM-1、 NGAL)水平及炎症因子表达显著下降，治疗效果具有浓度依赖性。这些结果表明褐藻二糖、三糖、四糖对顺铂引起的急性肾脏损伤有很好的保护作用。
实施例7褐藻三糖对顺铂(Cisplatin)引起的人肾小管上皮细胞(HK2 cell)损伤的影响
顺铂处理导致的人肾小管上皮细胞损伤是模拟临床上药物肾脏毒性作用所致的急性肾脏损伤的一种常用细胞模型。利用该模型，给药褐藻三糖，并与对照组和模型组进行对比，检验其治疗效果。
在人肾小管上皮细胞中进行细胞实验，模型给药组(Cis+AOS3)细胞中以250μg/ml褐藻三糖(AOS3)进行给药干预，然后以10μg/ml的顺铂进行给药造模，处理24小时；模型组(Cis)不加褐藻三糖干预，只用顺铂进行给药造模；对照组(CTL)则褐藻三糖和顺铂两者均不加。加入细胞裂解液裂解细胞后提取胞浆中的总蛋白，以β-肌动蛋白作内参，运用免疫印迹技术(western blotting)检测人肾小管上皮细胞中的自噬指标(P62、 LC3B，结果见图41)、内质网应激指标(Bip、Chop，结果见图42)以及细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、cleaved-caspase 3，结果见图43)。
图41显示在顺铂导致的人肾小管上皮细胞损伤的模型中细胞自噬指标如P62显著上升、LC3B下降，AOS3治疗能明显减少自噬蛋白P62，使 LC3B的比例上升至正常水平，提示褐藻三糖可能通过影响细胞自噬的发生发挥肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与模型组相比， p<0.05。
图42显示在顺铂导致的人肾小管上皮细胞损伤的模型中细胞内质网应激指标如Bip和Chop显著上升，AOS3治疗能明显减少内质网应激相关蛋白，提示褐藻三糖可能通过影响细胞内质网应激的发生发挥肾脏保护作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与模型组相比，p<0.05。
图43显示在顺铂导致的人肾小管上皮细胞损伤的模型中细胞凋亡指标如cleaved-caspase 3显著上升、Bcl-2/Bax的比例显著下降，AOS3治疗能明显减少凋亡蛋白cleaved-caspase 3，使Bcl-2/Bax的比例上升至正常水平，显示褐藻三糖具有抗凋亡作用。*表示与CTL相比，p<0.05，#表示与模型组相比，p<0.05。
同样地，进一步研究发现，褐藻二糖和褐藻四糖对顺铂引起的人肾小管上皮细胞损伤也具有与褐藻三糖类似的功效。
实验结论
在顺铂导致的人肾小管上皮细胞损伤的模型中，细胞自噬指标表达升高，内质网应激指标升高，提示顺铂诱导细胞损伤，改变细胞稳态，导致细胞凋亡，而褐藻二糖、三糖和四糖能明显抑制细胞自噬、内质网应激及细胞凋亡的发生，显示其具有很好的细胞保护作用，能够防止肾脏上皮细胞的损伤，维持细胞稳态，维护肾脏功能。
实施例8褐藻寡糖对急性肾脏损伤(AKI)向慢性肾脏疾病(CKD) 转变的影响
褐藻三糖对长期缺血再灌注(I/R)所导致的急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变的影响
选取Sprague Dawley大鼠，中山大学实验动物中心购买，220-250克。雄性大鼠18只，术前收集24小时尿量测定无异常，将造模大鼠进行随机分组，分为假手术组(Sham)、模型组(I/R)、模型+褐藻三糖0.1g/kg/天给药组(I/R+AOS3)，每组6只。药物采用灌胃给药，模型组、假手术组均灌服同体积生理盐水，给药组在术中、术后24及48小时均灌胃给药褐藻三糖(0.1g/kg/天)。手术当天，大鼠以10％水合氯醛腹腔麻醉后，常规消毒皮肤，从腹部开口，暴露左右侧肾脏，假手术组仅对肾脏进行检查，然后逐层缝合创口，结束手术；模型组及造模给药组使用大号动脉夹夹闭双侧的肾脏肾蒂，然后复位肾脏，以纱布覆盖创口并滴加少量生理盐水补液。45min后，松开双侧动脉夹，然后逐层缝合创口，结束手术，将大鼠放置于37℃加热垫上等待大鼠复苏后放回代谢笼，期间检测大鼠体重、进食量、饮水量及尿量。术后常规饲养，48天后处死大鼠取材。血样收集从大鼠的下腔静脉处取血，离心后收集上层血清，使用南京建成的肌酐测定试剂盒使用试剂盒法测定大鼠血清肌酐，实验结果采用t值法进行统计学处理，结果见图44。所收集的最后24小时尿量，结果见图45。通过冰点渗透压仪测定尿液中的渗透压，结果见图46。取材时分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，以β-肌动蛋白作内参，运用免疫印迹技术(western blotting)检测肾脏皮质组织中的水通道蛋白AQP2(结果见图47)。
图44显示模型组(I/R组)大鼠在缺血再灌注术后肾脏的滤过功能发生障碍，血清肌酐显著增高。AOS3治疗后血清肌酐显著下降，提示肾小球功能有一定程度的恢复，提示发生急性肾脏损伤时，早期使用AOS3，能保护肾脏功能，阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变。*表示与sham 相比，p<0.05，#表示与I/R相比，p<0.05。
图45显示I/R组大鼠在缺血再灌注术后肾脏的尿浓缩功能发生障碍，尿量显著增多。0.1g/kg/天的AOS3给药，大鼠在48天后的尿量基本恢复至接近正常水平，提示肾小管功能有一定程度的恢复。提示发生急性肾脏损伤时，早期使用AOS3，能保护肾脏功能，阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R相比，p<0.05。
图46显示I/R组大鼠尿液中尿渗透压下降，说明肾脏的尿液浓缩功能发生障碍，AOS3使尿渗透压明显上升也预示着肾脏尿液浓缩功能的恢复。提示发生急性肾脏损伤时，早期使用AOS3，能保护肾脏功能，阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变。*表示与sham相比，p<0.05，#表示与I/R 相比，p<0.05。
图47显示I/R组大鼠在缺血再灌注术后48天，大鼠肾脏组织中水通道蛋白2(AQP2)显著下降，AQP2主要参与肾脏水重吸收，这说明长期缺血再灌注会导致肾脏中重吸收功能障碍，而给予AOS3后AQP2的上升也说明给药后肾脏功能的恢复，提示发生急性肾脏损伤时，早期使用 AOS3，能保护肾脏功能，阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变。
同样地，进一步研究发现，褐藻二糖和褐藻四糖对长期缺血再灌注 (I/R)所导致的急性肾脏损伤向慢性肾脏损伤的转变也具有与褐藻三糖类似的功效。
实验结论
我们在大鼠通过夹闭大鼠双侧肾脏动脉45min，再灌注48天模拟了 AKI-CKD动物模型，在术中、术后24及48小时分别给药褐藻寡糖(0.1g/kg/ 天)作为早期药物干预治疗疾病，七周之后处死大鼠，检测尿量，尿渗透压和血清肌酐水平。结果显示：与对照组相比，模型组大鼠尿量增加，尿渗透压下降，提示肾脏尿浓缩功能障碍，与此相关，参与肾脏水重吸收的 AQP2表达显著减弱，而在AKI早期用褐藻寡糖干预可显著降低尿量，增加渗透压，增加AQP2表达，恢复肾脏的重吸收功能。血清肌酐浓度反映肾小球滤过功能，由AKI转化为CKD的大鼠，血清肌酐仍然较高，而早期褐藻寡糖干预明显降低血清肌酐，恢复肾小球滤过功能。这些结果提示发生急性肾脏损伤时，早期使用褐藻寡糖，能保护肾脏功能，阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变。
实施例9褐藻寡糖对慢性肾脏疾病的影响
褐藻三糖对单侧输尿管梗阻(UUO)所导致慢性肾脏疾病的影响
选取Sprague Dawley大鼠，中山大学实验动物中心购买，220-250克。雄性大鼠24只，术前收集24小时尿量测定无异常，将造模大鼠进行随机分组，分为假手术组(Sham)、单独给药组(AOS3)、模型组(UUO)、模型+褐藻三糖0.1g/kg/天给药组(UUO+AOS3)，每组6只。手术当天，大鼠以10％水合氯醛腹腔麻醉后，常规消毒皮肤，从膀胱上方2cm处沿腹正中线开口，暴露左侧输尿管，假手术组和单独给药组仅对输尿管进行检查，然后逐层缝合创口，结束手术；模型组及造模给药组使用4-0手术线结扎输尿管后，复位所有脏器，然后逐层缝合创口，结束手术，将大鼠放置于37℃加热垫上等待大鼠复苏后放回代谢笼，期间检测大鼠体重、进食量、饮水量及尿量。术后常规饲养，7天后每组取1只大鼠处死，检验模型建立情况。取材时分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作内参，运用免疫印迹技术(western blotting)检测肾脏皮质组织中的纤维化蛋白 (细胞纤连蛋白、a-SMA，结果见图48)。
剩余每组5只大鼠在术后第7天开始给药。药物采用灌胃给药，给药组在术后7天、8天及9天均灌胃给药AOS3(0.1g/kg/天)，模型组、假手术组均灌服同体积生理盐水。第10天处死大鼠取材。分离双侧肾脏，分离肾脏的皮质和内髓，加入组织裂解液使用超声法匀浆肾脏后提取总蛋白，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶作内参，运用免疫印迹技术(western blotting)检测肾脏皮质组织中的纤维化蛋白(细胞纤连蛋白、a-SMA，结果见图49)。
图48显示与假手术组和单独给药组(尚未给药)相比，模型组和模型给药组(尚未给药)大鼠单侧输尿管梗阻七天后，损伤引起大鼠肾脏组织中纤维化蛋白(细胞纤连蛋白、a-SMA)显著上升，说明肾脏组织呈现典型的纤维化病理改变，因此提示单侧输尿管梗阻所导致慢性肾脏疾病大鼠模型建立成功。
图49显示单侧输尿管梗阻损伤引起大鼠肾脏组织中纤维化蛋白(细胞纤连蛋白、a-SMA)的显著上升，说明肾脏组织呈现典型的纤维化病理改变，但AOS3给药后，同模型组(UUO)动物相比，大鼠肾脏几种纤维化蛋白没有下降，提示AOS3对肾脏纤维化没有治疗作用。
同样地，进一步研究发现，褐藻二糖和褐藻四糖对单侧输尿管梗阻所导致的慢性肾脏损伤的肾脏纤维化没有治疗作用。
实验结论
肾脏纤维化是几乎所有慢性肾脏疾病的最终的共同的病理变化。UUO 是模拟肾脏间质纤维化的经典动物模型，UUO七天后，肾脏组织呈现典型的纤维化病理改变，几种标志物(如细胞纤连蛋白、a-SMA平滑肌肌动蛋白)表达显著增加。发明人发现褐藻寡糖(0.1g/kg/天)连续灌胃三天，同模型组动物相比，大鼠肾脏几种纤维化蛋白都没有下降，提示褐藻寡糖对肾脏纤维化没有改善作用。我们的实验表明，褐藻寡糖有很好的对急性肾脏损害的保护和治疗作用，但对慢性肾脏疾病无明显的改善和治疗作用。
实施例10大鼠单次褐藻三糖灌胃急性经口毒性试验
取SD大鼠雌雄各40只，体重160-180g左右，随机分成4组，分别为阴性对照组(生理盐水)、褐藻三糖低剂量组(0.25g/kg体重)、中剂量组(1.0g/kg体重)和高剂量组(2.0g/kg体重)，剂量分别相当于大鼠药效学起效剂量的25倍、100倍、200倍，每组雌雄各10只，实验前隔夜禁食，不禁水。连续14天观察动物的状况，各组动物无明显差异，精神状态良好，呼吸正常，行为正常，活动量正常，行走步态未观察到任何异常。未出现中毒症状和死亡情况。各组大鼠的初始体重与终末体重无明显差异。肝脏、胰腺、肾脏、胃、卵巢、脑部的病理切片显示各器官无病变产生。血液检查指标正常。以上结果说明，AOS3为实际无毒级。
最后需要在此指出的是：以上仅是本发明的部分优选实施例，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种褐藻寡糖或其药学上可接受的盐在制备用于治疗急性肾脏损伤的药物中的用途，其中所述褐藻寡糖为褐藻二糖、褐藻三糖和/或褐藻四糖。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述褐藻寡糖是由单糖G、M和/或Δ通过1,4位糖苷键连接构成的；其中，G表示α-L-古洛糖醛酸，M表示β-D-甘露糖醛酸，Δ表示α-L-古洛糖醛酸或β-D-甘露糖醛酸的4,5位发生β-消除，生成4,5位为共轭双键的不饱和单糖。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述褐藻二糖选自ΔG、ΔM或其组合。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述褐藻三糖选自ΔGG、ΔGM、ΔMM和ΔMG中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的用途，其中所述褐藻四糖选自ΔGGG、ΔGGM、ΔGMG、ΔGMM、ΔMMG、ΔMMM、ΔMGG和ΔMGM中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述药学上可接受的盐为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和/或铵盐。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中所述急性肾脏损伤是由血液灌注不足、感染或药物的肾脏毒性导致的。
8.一种褐藻寡糖或其药学上可接受的盐在制备用于阻止急性肾脏损伤向慢性肾脏疾病转变的药物中的用途，其中所述褐藻寡糖为褐藻二糖、褐藻三糖和/或褐藻四糖。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述褐藻寡糖是由单糖G、M和/或Δ通过1,4位糖苷键连接构成的；其中，G表示α-L-古洛糖醛酸，M表示β-D-甘露糖醛酸，Δ表示α-L-古洛糖醛酸或β-D-甘露糖醛酸的4,5位发生β-消除，生成4,5位为共轭双键的不饱和单糖；
优选地，所述褐藻二糖选自ΔG、ΔM或其组合；
所述褐藻三糖选自ΔGG、ΔGM、ΔMM和ΔMG中的一种或多种；和/或
所述褐藻四糖选自ΔGGG、ΔGGM、ΔGMG、ΔGMM、ΔMMG、ΔMMM、ΔMGG和ΔMGM中的一种或多种。
10.根据权利要求8或9所述的用途，其中所述药学上可接受的盐为钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和/或铵盐；和/或
所述急性肾脏损伤是由血液灌注不足、感染或药物的肾脏毒性导致的。
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