CN113438897A - 一种检测有害物质的方法 - Google Patents

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CN113438897A CN201980091844.2A CN201980091844A CN113438897A CN 113438897 A CN113438897 A CN 113438897A CN 201980091844 A CN201980091844 A CN 201980091844A CN 113438897 A CN113438897 A CN 113438897A
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阿南萨·萨莎·什克尔·艾哈迈德
德尼·哈托诺
郭梦涵
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Abstract

本发明涉及定量确定怀疑存在于原始样品中的3‑单氯丙二醇(3‑mcpd)、3‑mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯的合计量的方法。

Description

一种检测有害物质的方法
发明领域
本发明涉及检测食用食品诸如食用油中的有害物质。
背景技术
在本说明书中对先前公开的文献的列举或讨论不应当必要地认为承认该文献是现有技术的一部分或是公知常识。
氯丙醇，如3-单氯丙二醇(3-mcpd)及其衍生物是食源性污染物，可以在各种富含脂肪酸的食品加工期间形成。3-mcpd在甘油、氯离子和热的存在下形成，并且它们的代谢物与促进睾丸和肾毒性的机制有关。另外，3-mcpd的脂肪酸酯还普遍存在于各种食物类型和食物成分中，尤其是精制食用油中。
与3-mcpd酯类似，在精制食用油中也可能检测到显著浓度的缩水甘油或缩水甘油脂肪酸酯(GE)。已将GE确定为一类新的食品加工污染物，并且它们包含末端环氧化物基团，与各种脂肪酸组合物。此外，GE还与致癌病变的形成有关。
由于这些污染物构成的固有风险，国际癌症研究机构(International Agencyfor Research on Cancer，IARC)已将3-mcpd和缩水甘油分别归类为“可能对人致癌”(组2B)和“很可能对人致癌”(组2A)。另外，监管机构和当前的行业路线图已旨在到2019年9月将3-mcpd和GE的水平分别降低至低于2ppm和1ppm。
因此，为了满足各种监管机构执行的严格要求，有必要获得易于量化这样的污染物的量化方法。用于量化3-mcpd、缩水甘油及其各自酯的当前方法涉及使用气相色谱/质谱仪(GC/MS)，如美国油脂化学家协会(American Oil Chemists’Society)批准的官方方法中(在AOCS官方方法Cd 29a-13、29b-13和29c-13中)所述的。这样的方法需要冗长且乏味的样品制备，并且需要制备用于校准仪器的标准品。另外，使用GC/MS涉及高成本，并且需要具有专业技术知识的人员来操作。
鉴于上述情况，用于确定3-mcpd和缩水甘油(及其衍生物)的存在的当前测试方法仍然有问题。因此，需要新的稳健检测方法，允许快速且灵敏地定量样品中的3-mcpd和/或缩水甘油。更重要的是，该方法必须准确、经济且易于执行。
发明内容
在本发明的第一方面，提供了定量确定怀疑存在于原始样品中的3-单氯丙二醇(3-mcpd)、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯的合计量的方法，所述方法包括：
(a)测量组合样品的光学特性，所述组合样品包括含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油、缩水甘油酯中的一种或多种的第一样品的反应产物，并且通过比较测量的光学特性与一个或多个标准或校准曲线来定量确定3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯的合计量。
在本发明的实施方式中，所述方法可以进一步包括以下步骤：
(b)通过测量3-单氯丙二醇样品的光学特性来定量确定原始样品中3-单氯丙二醇和3-mcpd酯的量，所述3-单氯丙二醇样品包括含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的包含3-单氯丙二醇和/或3-mcpd酯的第二样品的反应产物，其中所述第二样品已被处理以去除存在于所述原始样品中的任何缩水甘油和缩水甘油酯。如将认识到，原始样品中缩水甘油酯和/或缩水甘油的量可以通过以下确定：从步骤(a)中确定的合计量中减去步骤(b)中确定的3-单氯丙二醇和/或3-mcpd酯的量。
在上述方面和实施方式的实施方式中，含有吡啶环的合适化合物可以独立地选自：
(i)式I的化合物：
Figure BDA0003206930400000031
其中：
R1表示NO2、CN、SO3R4、CO2R5、CONR6R7；
R2和R3独立地表示卤素、C1-4烷基或OR8；
R4至R7独立地表示C1-10烷基；以及
R8表示C1-4烷基；
(ii)式II的化合物:
Figure BDA0003206930400000032
其中：
X表示H C1-4烷基、–COOH或COOR9a；
Y表示H、C1-4烷基、OR9b或NR10R11、SO3R12、CN、NO2、CO2R13、CONR14R15；
Z表示H、COR16或-(CH2)nAr；
W表示H、CH2OR17；
V表示H、C1-4烷基、–COOH或COOR18；
R9a和R9b至R18表示H或C1-4烷基；
Ar表示芳香族环体系；以及
n为1至10；或
(iii)式III的化合物:
Figure BDA0003206930400000041
其中，A和BB表示H、C1-4烷基、OR19或NR20R21、SO3R22、CN、NO2、CO2R23、CONR24R25；以及
R19至R25表示H或C1-4烷基，前提是当A为H时，则BB不为H，以及当BB为H时，则A不为H。例如，含有吡啶环的合适化合物可以选自：
Figure BDA0003206930400000042
Figure BDA0003206930400000043
或更特别地，4-(4-硝基苄基)吡啶。
在上述方面和实施方式的实施方式中，所述组合样品可以通过以下获得：
(ai)在水性溶剂混合物的存在下，使含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的第一样品反应，以提供反应样品；
(bi)通过添加显色剂在样品中显色以提供显色样品；
(ci)通过以下来分离含有吡啶环的合适化合物与3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的反应产物：将有机溶剂与所述显色样品混合，然后使所述有机溶剂和水性溶剂分层并收集有机层作为所述组合样品。
在本发明的实施方式中，步骤(ai)的水性溶剂混合物可以包括水和缓冲剂，其中水性溶剂混合物的pH为4至7，任选地，其中缓冲剂为柠檬酸钠缓冲剂。在本发明的进一步实施方式中，步骤(bi)中的显色剂可以是无机碱水溶液，任选地，其中：
(ia)所述显色剂可以为碳酸钾水溶液；和/或
(ib)所述显色剂的浓度可以为500nM至1M；和/或
(ic)可以以足以提供具有至少11的pH值的显色样品的量添加无机碱水溶液。
在本发明的又进一步的实施方式中，向步骤(ci)中的显色样品中添加的有机溶剂可以选自苯乙酮、二乙醚、甲苯、乙酸乙酯中的一种或多种，任选地，其中所述有机溶剂为乙酸乙酯。
在涉及确定分离出缩水甘油和缩水甘油酯的原始样品中3-单氯丙二醇和3-mcpd酯的量的本发明的实施方式中，所述3-单氯丙二醇样品可以通过以下获得：
(aii)在水性溶剂混合物的存在下，使含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的第二样品反应，以提供反应样品，其中所述第二样品已被处理以去除存在于所述原始样品中的任何缩水甘油和缩水甘油酯；
(bii)通过添加显色剂使所述反应样品显色以提供显色样品；
(cii)通过以下来分离含有吡啶环的合适化合物与3-单氯丙二醇和/或3-mcpd酯的反应产物：将有机溶剂与所述显色样品混合，然后使所述有机溶剂和水性溶剂分层并收集有机层作为所述3-单氯丙二醇样品。
在本发明的实施方式中，步骤(aii)的水性溶剂混合物可以包括水和缓冲剂，其中水性溶剂混合物的pH为4至7，任选地，其中缓冲剂为柠檬酸钠缓冲剂。在本发明的进一步实施方式中，步骤(bii)中的显色剂，所述显色剂可以是无机碱水溶液，任选地，其中：(iia)所述显色剂为碳酸钾水溶液；和/或(iib)所述显色剂的浓度为500nM至1M。在本发明的又进一步的实施方式中，向步骤(cii)中的显色样品中添加的有机溶剂可以选自苯乙酮、二乙醚、甲苯、乙酸乙酯中的一种或多种，任选地，其中所述有机溶剂为乙酸乙酯。
在本发明的实施方式中，所述第一样品可以通过以下获得：
(aiii)向原始样品中添加有机溶剂以形成溶解的样品；
(biii)向所述溶解的样品中添加溶解于具有3至5个碳原子的伯醇的碱，以形成碱性样品；
(ciii)向所述碱性样品中添加溶解于水的酸，并使所述样品进行混合以形成混合样品；
(diii)使所述混合样品分离为有机溶剂层和水性层，并仅收集所述水性层；以及
(eiii)向所述水性层添加缓冲剂以形成所述第一样品。
在本发明的实施方式中，向步骤(aiii)的原始样品中添加的有机溶剂可以为异辛烷和/或氯仿。在本发明的实施方式中，在步骤(biii)中：
(iiia)所述碱可以为氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾)，和/或所述具有3至5个碳原子的伯醇为1-丁醇，任选地，其中所述氢氧化钾在所述具有3至5个碳原子的伯醇中的浓度为1至5wt/vol％；或者
(iiib)所述醇盐可以为金属1-丁醇盐(例如1-丁醇钠或1-丁醇钾)。
在本发明的实施方式中，步骤(ciii)中的溶解于水的酸不是盐酸，任选地，其中：
(A)所述酸为乙酸或H2SO4；和/或
(B)所述酸在水中的浓度为1至3vol％。
在本发明的实施方式中，步骤(eiii)中的缓冲剂可以为柠檬酸钠缓冲剂，并且缓冲剂提供具有4至7的pH的第一样品。
在涉及确定分离出缩水甘油和缩水甘油酯的原始样品中3-单氯丙二醇和3-mcpd酯的量的本发明的又进一步的实施方式中，所述第二样品可以通过以下获得：
(aa)向原始样品中添加有机溶剂以形成溶解的样品；
(bb)使存在于所述溶解的样品中的任何缩水甘油和缩水甘油酯与酸和具有3至5个碳原子的伯醇反应以形成反应的样品；
(cc)向所述反应的样品中添加溶解于具有3至5个碳原子的伯醇的碱以形成中和样品，或向所述反应的样品中添加醇盐碱以形成中和样品，其中所述醇盐具有3至5个碳原子；
(dd)向碱性样品中添加溶解于水的酸，并使所述样品进行混合以形成混合样品；
(ee)使所述混合样品分离为有机溶剂层和水性层，并仅收集所述水性层；以及
(ff)向所述水性层添加缓冲剂以形成所述第二样品。
在本发明的实施方式中，向步骤(aa)中的原始样品中添加的有机溶剂可以为异辛烷和/或氯仿。在本发明的实施方式中，步骤(cc)中的所述碱可以为氢氧化物(例如氢氧化钾或氢氧化钠)，和/或所述具有3至5个碳原子的伯醇为1-丁醇，任选地，其中所述氢氧化钾在所述具有3至5个碳原子的伯醇中的浓度为1至5wt/vol％。
在本发明的实施方式中，步骤(dd)中的溶解于水的酸不是盐酸，任选地，其中：
(Ai)所述酸为乙酸或H2SO4；和/或
(Bi)所述酸在水中的浓度为1至3vol％。
在本发明的实施方式中，步骤(ff)中的缓冲剂可以为柠檬酸钠缓冲剂，并且缓冲剂提供具有4至7的pH的第一样品。
在本发明的实施方式中，在步骤(aa)中使用的所述酸和具有3至5个碳原子的伯醇分别为H2SO4和1-丙醇。
在本发明的实施方式中，测量的光学特性可以选自吸光度、透射率或反射率，任选地，其中测量的光学特性是吸光度。
在本发明的实施方式中，原始样品可以为食用油、食用脂肪或其组合。
附图说明
图1描绘了使用包含以下的标准样品制备的校准曲线：(a)3-mcpd、缩水甘油及其酯的混合物；和(b)3-mcpd及其酯。
图2描绘了3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和/或缩水甘油酯的合计量的样品制备和检测。
图3描绘了3-mcpd酯和缩水甘油酯分别酯交换为3-mcpd和缩水甘油。
图4描绘了3-mcpd和缩水甘油与4-(4-硝基苄基)吡啶(NBP)的反应。
图5描绘了3-mcpd和/或3-mcpd酯的样品制备和检测。
图6描绘了缩水甘油和缩水甘油酯与酸/醇的反应。
具体实施方式
如上文所述，用于确定3-单氯丙二醇和缩水甘油(及其衍生物)的存在的当前测试方法仍然有问题。因此，本发明试图用灵敏、定量且快捷运行的新检测方法来解决这些问题。
首先，需要知道组合物是否包含任何3-单氯丙二醇和缩水甘油(及其衍生物)。因此，提供了定量确定怀疑存在于原始样品中的3-单氯丙二醇(3-mcpd)、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯的合计量的方法，所述方法包括：
(a)测量组合样品的光学特性，所述组合样品包括含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油、缩水甘油酯中的一种或多种的第一样品的反应产物，并且通过比较测量的光学特性与一个或多个标准或校准曲线来定量确定3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯的合计量。
在本文的实施方式中，词语“包括/包含/含有”可以被解释为需要所提及的特征，但是不限制其他特征的存在。替代地，词语“包括/包含/含有”也可以涉及以下情形，其中仅所列出的组成/特征是旨在存在的(例如，词语“包括/包含/含有”可以用短语“由……组成”或“基本上由……组成”替换)。明确地设想了较广泛和较狭义的解释两者均可适用于本发明的所有方面和实施方式。换句话说，词语“包括/包含/含有”及其同义词可以用短语“由……组成”或短语“基本上由……组成”或其同义词替换，反之亦然。
如将认识到，上文描述的方法借助3-mcpd的氯原子和/或缩水甘油(及其衍生物)之间的SN2反应起作用，以形成具有足够共轭的新化合物以提供合适的光学特性进行分析。下文的实验部分中提供了如何可以捕获和分析光学特性的进一步细节，其中，吸光度是测量的光学特性。然而，应当理解，作为代替，使用标准技术或类似于吸光度的实例中描述的方法可以使用其它光学特性，诸如透射率或反射率。
当在本文中使用时，术语“3-mcpd的衍生物”是指3-mcpd的酯。当在本文中使用时，术语“3-mcpd酯”是指以下化合物，其中3-单氯丙二醇上的一个或两个醇基团已与羧酸(例如RCO2H)或其酯(例如RCO2R’)反应形成酯基团。对用于与醇形成酯的羧酸/酯基团没有特别限制(例如，R可以具有任何合适的值并且可以是C1-50烷基基团、苯基基团或杂环基团，该基团可以是取代或未取代的。R’基团可以是任何合适的基团，诸如C1-5烷基基团。
当在本文中使用时，术语“缩水甘油的衍生物”是指缩水甘油的酯。当在本文中使用时，术语“缩水甘油酯”是指以下化合物，其中，缩水甘油上的醇基团已与羧酸(例如RCO2H)或其酯(例如RCO2R’)反应形成酯基团。如上，对用于与醇形成酯的羧酸/酯基团没有特别限制。
在本发明的实施方式中，步骤(a)中使用的组合样品可以通过以下获得：
(ai)在水性溶剂混合物的存在下，使含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的第一样品反应，以提供反应样品；
(bi)通过添加显色剂在样品中显色以提供显色样品；以及
(ci)通过以下来分离含有吡啶环的合适化合物与3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的反应产物：将有机溶剂与所述显色样品混合，然后使所述有机溶剂和水性溶剂分层并收集有机层作为所述组合样品。
在上述步骤(ai)中，水性溶剂混合物可以包括水和缓冲剂，其中，水性溶剂混合物的pH为4至7。可以使用任何合适的缓冲剂。例如，缓冲剂可以是柠檬酸钠缓冲剂。
在上述步骤(bi)中，着色剂可以是任何合适的无机碱水溶液。合适的无机碱水溶液的实例包括但不限于碳酸钾水溶液。水性溶液中显色剂的浓度可以具有任何合适的浓度，例如浓度可以为500nM至1M。如将认识到，以足以提供期望效果的量向步骤(ai)的水性溶液添加显色剂，该量可以由技术人员根据常规试错或基于他们在此领域的知识和专业技能来确定。例如，可以以足以提供具有至少11的pH值的显色样品的量添加无机碱水溶液。
在上述步骤(ci)中，向显色样品中添加的有机溶剂可以选自苯乙酮、二乙醚、甲苯、乙酸乙酯中的一种或多种，任选地，其中有机溶剂为乙酸乙酯。如将认识到，溶剂可以单独选择或选择为彼此协同工作。例如，当将二乙醚和/或乙酸乙酯用作有机溶剂时，不混溶的有机层可以形成并与水性层分离。
在本发明的实施方式中，第一样品可以通过以下获得：
(aiii)向原始样品中添加有机溶剂以形成溶解的样品；
(biii)向所述溶解的样品中添加溶解于具有3至5个碳原子的伯醇的碱，或添加具有3至5个碳原子的醇盐，以形成碱性样品；
(ciii)向所述碱性样品中添加溶解于水的酸，并使所述样品进行混合以形成混合样品；
(diii)使所述混合样品分离为有机溶剂层和水性层，并仅收集所述水性层；以及
(eiii)向所述水性层添加缓冲剂以形成所述第一样品。
在上述步骤(aiii)中，可以使用任何合适的有机溶剂。可以使用的合适的有机溶剂的实例包括但不限于异辛烷、氯仿及其组合。
在上述步骤(biii)中，可以使用任何合适的碱。合适的碱的实例包括但不限于氢氧化物碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾)。合适的伯醇的实例包括但不限于1-丁醇。如将认识到，此反应的所得产物是金属醇盐，并且由此，可以用于本文的合适的金属醇盐可以是金属1-丁醇盐(1-丁醇钠或1-丁醇钾)。
在上述步骤(ciii)中，可以使用任何合适的酸，前提是该酸不为盐酸。合适的酸包括但不限于乙酸或H2SO4。可以使用酸的任何合适浓度，例如，酸在水中的浓度可以为1至3vol％(即溶解于水的酸的浓度为1至3vol％，然后将该溶液添加至碱性样品中)。
在上述步骤(eiii)中，缓冲剂可以是为第一样品提供合适的pH值的任何合适的缓冲剂。例如，缓冲剂可以为柠檬酸钠缓冲剂和/或缓冲剂可以提供具有4至7的pH的第一样品。
如将认识到，上文描述的过程允许人员了解待分析样品中3-mcpd、缩水甘油及其衍生物的总量。然而，上述方法不能提供对来源于3-mcpd的污染物的量和来源于缩水甘油的量的细分了解。因此，为了获得此信息，该过程可以进一步包括以下步骤：
(b)通过测量3-单氯丙二醇样品的光学特性来定量确定原始样品中3-单氯丙二醇和3-mcpd酯的量，所述3-单氯丙二醇样品包括含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的包含3-单氯丙二醇和/或3-mcpd酯的第二样品的反应产物，其中所述第二样品已被处理以去除存在于所述原始样品中的任何缩水甘油和缩水甘油酯。
上述方法允许人员计算样品中3-mcpd及其衍生物的量。如将认识到，原始样品中缩水甘油酯和/或缩水甘油的量可以通过以下确定：从步骤(a)中确定的合计量中减去步骤(b)中确定的3-单氯丙二醇和/或3-mcpd酯的量。这允许人员确定污染物的总量和来源于3-mcpd和缩水甘油的污染物的量。
在本发明的实施方式中，用于步骤(b)中的3-单氯丙二醇样品可以通过以下获得：
(aii)在水性溶剂混合物的存在下，使含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的第二样品反应，以提供反应样品，其中所述第二样品已被处理以去除存在于所述原始样品中的任何缩水甘油和缩水甘油酯；
(bii)通过添加显色剂使所述反应样品显色以提供显色样品；
(cii)通过以下来分离含有吡啶环的合适化合物与3-单氯丙二醇和/或3-mcpd酯的反应产物：将有机溶剂与所述显色样品混合，然后使所述有机溶剂和水性溶剂分层并收集有机层作为所述3-单氯丙二醇样品。
在上述步骤(aii)中，水性溶剂混合物可以包括水和缓冲剂，其中水性溶剂混合物的pH为4至7，任选地，其中缓冲剂为柠檬酸钠缓冲剂。
在上述步骤(bii)中，显色剂可以是无机碱水溶液。合适的无机碱水溶液的实例包括但不限于碳酸钾水溶液。水性溶液中显色剂可以具有任何合适的浓度，例如浓度可以为500nM至1M。如将认识到，以足以提供期望效果的量向步骤(ai)的水性溶液添加显色剂，该量可以由技术人员根据常规试错或基于他们在此领域的知识和专业技能来确定。例如，可以以足以提供具有至少11的pH值的显色样品的量添加无机碱水溶液。
在上述步骤(cii)中，向显色样品中添加的有机溶剂可以选自苯乙酮、二乙醚、甲苯、乙酸乙酯中的一种或多种，任选地，其中有机溶剂为乙酸乙酯。如将认识到，溶剂可以单独选择或选择为彼此协同工作。例如，当将二乙醚和/或乙酸乙酯用作有机溶剂时，不混溶的有机层可以形成并与水性层分离。
在本发明的实施方式中，第二样品可以通过以下获得：
(aa)向原始样品中添加有机溶剂以形成溶解的样品；
(bb)使存在于所述溶解的样品中的任何缩水甘油和缩水甘油酯与酸和具有3至5个碳原子的伯醇反应以形成反应的样品；
(cc)向所述反应的样品中添加溶解于具有3至5个碳原子的伯醇的碱以形成中和样品，或向所述反应的样品中添加醇盐碱以形成中和样品，其中所述醇盐具有3至5个碳原子；
(dd)向碱性样品中添加溶解于水的酸，并使所述样品进行混合以形成混合样品；
(ee)使所述混合样品分离为有机溶剂层和水性层，并仅收集所述水性层；以及
(ff)向所述水性层添加缓冲剂以形成所述第二样品。
在上述步骤(aa)中，可以使用任何合适的有机溶剂。可以使用的合适的有机溶剂的实例包括但不限于异辛烷、氯仿及其组合。
在上述步骤(bb)中，可以使用任何合适的酸和醇。例如，酸可以是H2SO4以及醇可以是1-丙醇。
在上述步骤(cc)中，可以使用任何合适的碱。合适的碱的实例包括但不限于氢氧化物碱(例如氢氧化钠或氢氧化钾)。合适的伯醇的实例包括但不限于1-丁醇。如将认识到，此反应的所得产物是金属醇盐，并且由此，可以用于本文的合适的金属醇盐可以是金属1-丁醇盐(1-丁醇钠或1-丁醇钾)。
在上述步骤(dd)中，可以使用任何合适的酸，前提是该酸不为盐酸。合适的酸包括但不限于乙酸或H2SO4。可以使用酸的任何合适浓度，例如，酸在水中的浓度可以为1至3vol％(即溶解于水的酸的浓度为1至3vol％，然后将该溶液添加至碱性样品中)。
在上述步骤(ff)中，缓冲剂可以是为第一样品提供合适的pH值的任何合适的缓冲剂。例如，缓冲剂可以为柠檬酸钠缓冲剂和/或缓冲剂可以提供具有4至7的pH的第一样品。
如将认识到，上文描述的方法需要使用含有吡啶环的合适化合物以提供用于分析的期望反应产物。所讨论的化合物可以独立地选自：
(i)式I的化合物：
Figure BDA0003206930400000141
其中：
R1表示NO2、CN、SO3R4、CO2R5、CONR6R7；
R2和R3独立地表示卤素、C1-4烷基或OR8；
R4至R7独立地表示C1-10烷基；以及
R8表示C1-4烷基；
(ii)式II的化合物:
Figure BDA0003206930400000142
其中：
X表示H C1-4烷基、–COOH或COOR9a；
Y表示H、C1-4烷基、OR9b或NR10R11、SO3R12、CN、NO2、CO2R13、CONR14R15；
Z表示H、COR16或-(CH2)nAr；
W表示H、CH2OR17；
V表示H、C1-4烷基、–COOH或COOR18；
R9a和R9b至R18表示H或C1-4烷基；
Ar表示芳香族环体系；以及
n为1至10；或
(iii)式III的化合物:
Figure BDA0003206930400000151
其中，A和BB表示H、C1-4烷基、OR19或NR20R21、SO3R22、CN、NO2、CO2R23、CONR24R25；以及
R19至R25表示H或C1-4烷基，前提是当A为H时，则BB不为H，以及当BB为H时，则A不为H。例如，含有吡啶环的合适化合物可以选自：
Figure BDA0003206930400000152
Figure BDA0003206930400000153
或更特别地，4-(4-硝基苄基)吡啶。
当在本文中使用时，术语"Ar”或“芳基”包括C6-14(诸如C6-13(例如C6-10))芳基基团。此类基团可以是单环、二环或三环的，并且具有在6与14之间的环碳原子，其中，至少一个环是芳香族的。芳基基团的附接点可以经由环体系的任何原子。然而，当芳基基团是二环或三环时，它们经由芳香族环连接至分子的其余部分上。C6-10芳基基团包括苯基、萘基等，诸如1,2,3,4-四氢萘基、茚满基、茚基和芴基。可以提及的本发明的实施方式包括其中芳基是苯基的那些。
在本发明的实施方式中，测量的光学特性可以选自吸光度、透射率或反射率，任选地，其中测量的光学特性是吸光度。
如将认识到，原始样品可以是怀疑包含3-mcpd和/或缩水甘油及其衍生物的任何合适的样品。合适的原始样品的实例包括但不限于食用油、食用脂肪或其组合。
下面参考以下非限制性实施例描述本发明的进一步的方面和实施方式。
实施例
装置
实施检测所需的装置包括：
·涡旋器；
·沸水浴；
·加热板；
·离心机；
·冰盒；
·分光光度计或色度计(具有最小0.01nm的分辨率)；和
·移液器。
材料
异辛烷(分析级，≥99％)、氯仿(分析级，≥99％)、H2SO4(≥99％)、1-丙醇(分析级，≥99％)、KOH(85％及以上)，1-丁醇(分析级，≥99％)、柠檬酸钠(≥99％)、乙醇(≥95％)、甘油(≥99％)、4-(4-硝基苄基)吡啶(98％及以上)、K2CO3(≥99％)、乙酸乙酯(分析级，≥99％)、苯乙酮(分析级，≥99％)、甲苯(分析级，≥99％)、丙酮(分析级，≥99％)和乙二醇(≥99％)是从商业来源获得的并且不进行进一步纯化直接用于制备以下溶剂或试剂：
·溶解样品的溶剂：异辛烷或氯仿
·试剂1:H2SO4于1-丙醇中，工作浓度为1-5μL的H2SO4于1-丙醇(1mL)中
·试剂2:KOH于1-丁醇中，工作浓度为1-5％KOH于1-丁醇(w/v)中
·试剂3:H2SO4于去离子水中，工作浓度为1-3％的H2SO4于去离子水中
·试剂4：柠檬酸钠缓冲剂，具有pH 4-7
·试剂A：4-(4-硝基苄基)吡啶(NBP)溶解于乙醇:甘油的混合物中，工作浓度为2-10％NBP(w/v)。乙醇在乙醇:甘油混合物中的百分比可以在10-100％(v/v)的范围内。乙醇可以由其他溶剂诸如丙酮或其他极性溶剂代替，而甘油可以由乙二醇代替。
·试剂B：K2CO3溶解于去离子水中，工作浓度为500nM-1M
·试剂C：乙酸乙酯、苯乙酮、二乙醚或甲苯
使用标准样品构建校准曲线
通常，校准曲线可以经由以下步骤获得：
1.将包含标准产品(3-mcpd及其酯；或3-mcpd、缩水甘油及其酯的混合物)的六个或更多样品，其浓度由GC/MS预先确定，用于构建校准曲线。
对于3-mcpd、缩水甘油及其酯的总浓度的定量(在实施例1中)，样品应包含0.2至8ppm的3-mcpd、缩水甘油及其酯的总浓度，其中各种样品浓度分布在整个范围(例如0.2、0.5、1、3、5、8ppm)。
对于3-mcpd及其酯的定量(在实施例2中)，样品应包含0.1至5ppm的3-mcpd及其酯浓度，其中各种样品浓度分布在整个范围(例如0.1、0.5、1、2、3、5ppm)。
2.然后对样品进行如实施例1或2中描述的样品制备和检测步骤，并测量它们的吸光度。
3.然后将对于标准样品获得的这些吸光度值用于构建校准曲线，如图1a和b所示(分别为对于3-mcpd、缩水甘油及其酯的组合样品；和对于3-mcpd及其酯)。然后从各自的校准曲线确定3-mcpd及其酯的浓度，或3-mcpd、缩水甘油及其酯的总浓度。
实施例1.检测3-单氯丙二醇(3-mcpd)、3-mcpd酯、缩水甘油和/或缩水甘油酯的合计量
使用上文列出的装置和试剂实施检测样品中3-单氯丙二醇(3-mcpd)、3-mcpd酯、缩水甘油和/或缩水甘油酯的合计量。该方法允许同时检测3-mcpd、缩水甘油及其各自的酯衍生物。检测过程分为两部分：样品制备(2)和检测(4)，如图2所示。样品制备涉及将3-mcpd酯和缩水甘油酯分别转化为3-mcpd(22)和缩水甘油(24)，而检测步骤涉及使用4-(4-硝基苄基)-吡啶(NBP)和碱以当与3-mcpd或缩水甘油反应时得到颜色变化。
已经将该检测方法实施于食品样品，包括RBDPO(精制、漂白和除臭的棕榈油)、棕榈液油(palm olein)、酯交换棕榈油、葵花油、卡诺拉油、固体硬脂酸甘油酯、用于蛋糕的奶油人造黄油、用于巧克力产品的糖果脂肪和米糠油。
样品制备(2)
通常，将0.1-5g(±0.1％)的每个样品(对于四个样品的批次)称重至管中。对于此实施例，将3g±3mg的样品分别称重至每个管中。然后向每个样品中添加3mL的溶剂并混合直至样品完全溶解。如果样品是固体，可以首先通过将其在烘箱/水浴中(例如，在30-80℃，取决于固体的熔点)加热使其完全熔化，然后向样品中添加溶剂。添加溶剂后，并且如果样品没有完全溶解，可以将混合物在烘箱中在30-80℃下加热(取决于样品的熔点和溶剂的沸点——如果需要高于60℃的温度，则使用异辛烷)，直到样品完全溶解并且溶液显得澄清。
然后向每个样品(10)中添加4mL的试剂2(20)，混合并静置5-15min。添加试剂2是为了将3-mcpd酯(13)和/或缩水甘油酯(14)分别转化为3-mcpd(22)和/或缩水甘油(24)(如图3中的反应流程中所示)。
此后，将3.5mL的试剂3(30)添加至每个样品中，混合并涡旋以中和碱性条件(图2)。然后将样品以2,000或更高的rcf离心至少1min，得到两层。弃去有机层，并将水性层转移至新管中。小心确保有机层不会污染水性层样品。这之后接着向样品中添加15μL的试剂4(40)以确保样品被中和(图2)。这得到直接用于后续检测步骤的制备好的样品50。
样品检测(4)
为了检测制备好的样品50(来自先前的制备步骤)中3-mcpd和/或缩水甘油的量，向每个管中添加1mL的试剂A(60)并充分涡旋。然后将管在沸水浴中温育15-40min，使NBP与3-mcpd和缩水甘油的反应进行完全(如图4中的反应流程中所示)。然后将管从水浴中取出并在冰中快速冷却。此后，向每个管中添加0.5mL的试剂B(70)和1mL的试剂C(80)并充分涡旋(图2)。然后将管离心以得到两层。将包含与3-mcpd或缩水甘油(75)反应的NBP的有机层(90)转移至吸收池中，使用分光光度计在约530-560nm处测量吸光度。
3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和/或缩水甘油酯的合计浓度可以从使用包含各种浓度的3-mcpd、缩水甘油及其酯的标准样品生成的校准曲线确定(图1a)。
实施例2.检测3-单氯丙二醇(3-mcpd)和/或3-mcpd酯的量
使用上文列出的装置和试剂实施检测样品中3-单氯丙二醇(3-mcpd)和/或3-mcpd酯的量。与实施例1类似，将检测过程分为两部分：样品制备(6)和检测(8)，如图5中所示。该方法与实施例1中的方法基本相同，但它包括在样品制备阶段的额外步骤，以去除可能存在于样品中的缩水甘油和缩水甘油酯中的环氧官能团。这有效地使缩水甘油和缩水甘油酯失活，使得它们不会在检测步骤中与NBP反应而得到颜色变化。
已经将该检测方法实施于食品样品，包括RBDPO(精制、漂白和除臭的棕榈油)、棕榈液油、酯交换棕榈油、葵花油、卡诺拉油、固体硬脂酸甘油酯、用于蛋糕的奶油人造黄油、用于巧克力产品的糖果脂肪和米糠油。
样品制备(6)
通常，将0.1-5g(±0.1％)的每个样品(对于六个样品的批次)称重至管中。对于此实施例，将3g±3mg的样品分别称重至每个管中。然后向每个样品中添加3mL的溶剂并振荡直至样品完全溶解。如果样品是固体，可以首先通过将其在烘箱/水浴中(例如，在30-80℃，取决于固体的熔点)加热使其完全熔化，然后向样品中添加溶剂。添加溶剂后，并且如果样品没有完全溶解，可以将混合物在烘箱中在30-80℃下加热(取决于样品的熔点和溶剂的沸点——如果需要高于60℃的温度，则使用异辛烷)，直到样品完全溶解并且溶液显得澄清。
首先，向每个样品(5)中添加1mL的试剂1(12)，混合并在40-70℃的水浴中温育20-30min。添加试剂1是额外的步骤(与实施例1相比)并且对于去除可能存在于样品中的缩水甘油(24)和缩水甘油酯(14)中的环氧官能团是重要的(在图6中的反应流程中示出)。
然后向每个样品(10)中添加4mL的试剂2(20)，混合并在室温下温育10-15min。添加试剂2是为了将3-mcpd酯和其他酯转化为3-mcpd和各自的醇(如图2中的反应流程中所示)。
此后，向每个样品中添加足够量(～3.4mL)的试剂3(30)，混合并涡旋以中和碱性条件(图5)。然后将样品以2,000或更高的rcf离心至少1min，得到两层。弃去有机层，并将水性层转移至新管中。小心确保有机层不会污染水性层样品。这之后接着向样品中添加15μL的试剂4(40)以确保样品被中和(图5)。这得到直接用于后续检测步骤的制备好的样品55。
样品检测(8)
为了检测制备好的样品55(来自先前的制备步骤)中3-mcpd的量，向每个管中添加1mL的试剂A(60)并充分涡旋。然后将管在沸水浴中温育15-40min，使NBP与3-mcpd和缩水甘油的反应进行完全(如图3中的反应流程中所示)。然后将管从水浴中取出并在冰中快速冷却。此后，向每个管中添加0.5mL的试剂B(70)和1mL的试剂C(80)并充分涡旋(图5)。然后将管离心以得到两层。将包含与3-mcpd(75)反应的NBP的有机层(95)转移至吸收池中，使用分光光度计在约530-560nm处测量吸光度。
3-mcpd和/或3-mcpd酯的浓度可以从使用包含各种浓度的3-mcpd及其酯的标准样品生成的校准曲线确定(图1a)。
比较由当前方法确定的3-mcpd和/或3-mcpd酯(在各种样品中)的浓度与由GC/MS确定的浓度，示出当前方法能够获得与传统GC/MS方法相当的准确度和灵敏度(表1)。
表1.比较由当前方法确定的3-mcpd和/或3-mcpd酯的各种浓度与由GC/MS确定的浓度。
Figure BDA0003206930400000211
实施例3.检测缩水甘油和/或缩水甘油酯的量
样品中缩水甘油和/或缩水甘油酯的量可以通过从3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和/或缩水甘油酯的合计浓度(在实施例1中)中减去3-mcpd和/或3-mcpd酯的浓度(在实施例2中)来确定，如下所示：
缩水甘油和/＝3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和/或缩水甘油酯的总浓或缩水甘油酯 度(如实施例1中所确定)的浓度 -
3-mcpd和/或3-mcpd酯的浓度(如实施例2中所确定)
比较由当前方法确定的缩水甘油和/或缩水甘油酯(在各种样品中)的浓度与由GC/MS确定的浓度，示出当前方法能够获得与传统GC/MS方法相当的准确度和灵敏度(表2)。
表2.比较由当前方法确定的缩水甘油和/或缩水甘油酯的各种浓度与由GC/MS确定的浓度。
Figure BDA0003206930400000221
实施例4.比较当前检测方法与美国油脂化学家协会的官方方法
比较了量化3-mcpd和缩水甘油的当前所要求保护的方法与美国油脂化学家协会(AOCS)官方方法Cd-29a-13、Cd-29b-13和Cd-29c-13(分别称为方法A、B和C)，并且在下面的表3中总结了优点。
表3.与AOCS的官方方法相比，当前方法的优点总结。
Figure BDA0003206930400000231

Claims (27)

1.一种定量确定怀疑存在于原始样品中的3-单氯丙二醇(3-mcpd)、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯的合计量的方法，所述方法包括：
(a)测量组合样品的光学特性，所述组合样品包括含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油、缩水甘油酯中的一种或多种的第一样品的反应产物，并且通过比较测量的光学特性与一个或多个标准或校准曲线来定量确定3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯的合计量。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
(b)通过测量3-单氯丙二醇样品的光学特性来定量确定原始样品中3-单氯丙二醇和3-mcpd酯的量，所述3-单氯丙二醇样品包括含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的包含3-单氯丙二醇和/或3-mcpd酯的第二样品的反应产物，其中所述第二样品已被处理以去除存在于所述原始样品中的任何缩水甘油和缩水甘油酯。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，原始样品中缩水甘油酯和/或缩水甘油的量通过以下确定：从步骤(a)中确定的合计量中减去步骤(b)中确定的3-单氯丙二醇和/或3-mcpd酯的量。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述含有吡啶环的合适化合物独立地选自：
(i)式I的化合物：
Figure FDA0003206930390000021
其中：
R1表示NO2、CN、SO3R4、CO2R5、CONR6R7；
R2和R3独立地表示卤素、C1-4烷基或OR8；
R4至R7独立地表示C1-10烷基；以及
R8表示C1-4烷基；
(ii)式II的化合物:
Figure FDA0003206930390000022
其中：
X表示H C1-4烷基、–COOH或COOR9a；
Y表示H、C1-4烷基、OR9b或NR10R11、SO3R12、CN、NO2、CO2R13、CONR14R15；
Z表示H、COR16或-(CH2)nAr；
W表示H、CH2OR17；
V表示H、C1-4烷基、–COOH或COOR18；
R9a和R9b至R18表示H或C1-4烷基；
Ar表示芳香族环体系；以及
n为1至10；或
(iii)式III的化合物:
Figure FDA0003206930390000031
其中，A和BB表示H、C1-4烷基、OR19或NR20R21、SO3R22、CN、NO2、CO2R23、CONR24R25；以及
R19至R25表示H或C1-4烷基，前提是当A为H时，则BB不为H，以及当BB为H时，则A不为H。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述含有吡啶环的合适化合物选自：
Figure FDA0003206930390000032
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述式I的化合物为4-(4-硝基苄基)吡啶。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述组合样品通过以下获得：
(ai)在水性溶剂混合物的存在下，使含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的第一样品反应，以提供反应样品；
(bi)通过添加显色剂在样品中显色以提供显色样品；以及
(ci)通过以下来分离含有吡啶环的合适化合物与3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的反应产物：将有机溶剂与所述显色样品混合，然后使所述有机溶剂和水性溶剂分层并收集有机层作为所述组合样品。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述水性溶剂混合物包括水和缓冲剂，其中所述水性溶剂混合物的pH为4至7，任选地，其中所述缓冲剂为柠檬酸钠缓冲剂。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中，所述显色剂为无机碱水溶液，任选地，其中：
(ia)所述显色剂为碳酸钾水溶液；和/或
(ib)所述显色剂的浓度为500nM至1M；和/或
(ic)以足以提供具有至少11的pH值的所述显色样品的量添加所述无机碱水溶液。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中，向所述显色样品中添加的所述有机溶剂选自苯乙酮、二乙醚、甲苯、乙酸乙酯中的一种或多种，任选地，其中所述有机溶剂为乙酸乙酯。
11.根据权利要求2至10中任一项所述的方法，其中，所述3-单氯丙二醇样品通过以下获得：
(aii)在水性溶剂混合物的存在下，使含有吡啶环的合适化合物与从怀疑包含3-mcpd、3-mcpd酯、缩水甘油和缩水甘油酯中的一种或多种的原始样品获得的第二样品反应，以提供反应样品，其中所述第二样品已被处理以去除存在于所述原始样品中的任何缩水甘油和缩水甘油酯；
(bii)通过添加显色剂使所述反应样品显色以提供显色样品；
(cii)通过以下来分离含有吡啶环的合适化合物与3-单氯丙二醇和/或3-mcpd酯的反应产物：将有机溶剂与所述显色样品混合，然后使所述有机溶剂和水性溶剂分层并收集有机层作为所述3-单氯丙二醇样品。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述水性溶剂混合物包括水和缓冲剂，其中所述水性溶剂混合物的pH为4至7，任选地，其中所述缓冲剂为柠檬酸钠缓冲剂。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中，所述显色剂为无机碱水溶液，任选地，其中：
(iia)所述显色剂为碳酸钾水溶液；和/或
(iib)所述显色剂的浓度为500nM至1M。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的方法，其中，向所述显色样品中添加的所述有机溶剂选自苯乙酮、二乙醚、甲苯、乙酸乙酯中的一种或多种，任选地，其中所述有机溶剂为乙酸乙酯。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一样品通过以下获得：
(aiii)向原始样品中添加有机溶剂以形成溶解的样品；
(biii)向所述溶解的样品中添加溶解于具有3至5个碳原子的伯醇的碱，或添加具有3至5个碳原子的醇盐，以形成碱性样品；
(ciii)向所述碱性样品中添加溶解于水的酸，并使所述样品进行混合以形成混合样品；
(diii)使所述混合样品分离为有机溶剂层和水性层，并仅收集所述水性层；以及
(eiii)向所述水性层添加缓冲剂以形成所述第一样品。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，向所述原始样品中添加的所述有机溶剂为异辛烷和/或氯仿。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其中：
(iiia)所述碱为氢氧化物(例如氢氧化钠或氢氧化钾)，和/或所述具有3至5个碳原子的伯醇为1-丁醇，任选地，其中所述氢氧化钾在所述具有3至5个碳原子的伯醇中的浓度为1至5wt/vol％；或者
(iiib)所述醇盐为金属1-丁醇盐(例如1-丁醇钠或1-丁醇钾)。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中，所述溶解于水的酸不是盐酸，任选地，其中：
(A)所述酸为乙酸或H2SO4；和/或
(B)所述酸在水中的浓度为1至3vol％。
19.根据权利要求15至18中任一项所述的方法，其中，所述缓冲剂为柠檬酸钠缓冲剂，并且所述缓冲剂提供具有4至7的pH的所述第一样品。
20.根据权利要求2至19中任一项所述的方法，其中，所述第二样品通过以下获得：
(aa)向原始样品中添加有机溶剂以形成溶解的样品；
(bb)使存在于所述溶解的样品中的任何缩水甘油和缩水甘油酯与酸和具有3至5个碳原子的伯醇反应以形成反应的样品；
(cc)向所述反应的样品中添加溶解于具有3至5个碳原子的伯醇的碱以形成中和样品，或向所述反应的样品中添加醇盐碱以形成中和样品，其中所述醇盐具有3至5个碳原子；
(dd)向碱性样品中添加溶解于水的酸，并使所述样品进行混合以形成混合样品；
(ee)使所述混合样品分离为有机溶剂层和水性层，并仅收集所述水性层；以及
(ff)向所述水性层添加缓冲剂以形成所述第二样品。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，向所述原始样品中添加的所述有机溶剂为异辛烷和/或氯仿。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中，所述碱为氢氧化物(例如氢氧化钾或氢氧化钠)，和/或所述具有3至5个碳原子的伯醇为1-丁醇，任选地，其中所述氢氧化钾在所述具有3至5个碳原子的伯醇中的浓度为1至5wt/vol％。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，
其中，在权利要求20的步骤(dd)中的所述溶解于水的酸不是盐酸，任选地，其中：
(a)无机酸为乙酸或H2SO4；和/或
(b)所述酸在水中的浓度为1至3vol％。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中，所述缓冲剂为柠檬酸钠缓冲剂，并且所述缓冲剂提供具有4至7的pH的所述第一样品。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中，在权利要求20的步骤(bb)中使用的所述酸和具有3至5个碳原子的伯醇分别为H2SO4和1-丙醇。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，测量的所述光学特性选自吸光度、透射率或反射率，任选地，其中测量的所述光学特性是吸光度。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述原始样品为食用油、食用脂肪或其组合。
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