CN113424063A - 脑部炎症的抑制或缓解制剂 - Google Patents

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Abstract

一种脑部炎症的抑制或缓解制剂，其包含接种痘苗病毒的炎症组织的提取物作为活性成分。一种接种痘苗病毒的炎症组织的提取物或包含该提取物的制剂的测定或评价方法，其特征在于，将由培养的神经胶质细胞中的BDNF的表达促进所诱导的促炎细胞因子和/或NF‑κB途径相关蛋白的表达的抑制用作指标。接种痘苗病毒的炎症组织的提取物在生产脑部炎症的抑制或缓解制剂中的用途。

Description

脑部炎症的抑制或缓解制剂
技术领域
本发明涉及包含来自接种痘苗病毒的炎症组织的提取物(以下有时称为“提取物”)的脑部炎症的抑制或缓解制剂。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是痴呆症的最常见原因，其影响十分之一的65岁以上的人。AD典型地导致细胞外积聚淀粉样蛋白β(Aβ)，从而形成斑块。有令人信服的证据表明Aβ与炎症受体(诸如TNFRl和IL-1R)结合并在AD期间激活炎症。免疫相关受体在学习和记忆形成中起着重要作用，且过度的神经炎症会导致直接认知障碍。重要的是，突触修剪可以受炎症信号的调节，且慢性神经炎症会导致突触相关蛋白的丢失。此外，据报道，小神经胶质细胞导致突触修剪功能障碍和突触丢失。
随着世界范围内预期寿命的增加，治疗AD已成为紧迫的国际卫生优先事项。目前可用的两种主要AD药物是多奈哌齐(胆碱酯酶抑制剂，其增加突触乙酰胆碱(Ach)以增强轻度AD的认知能力)以及美金刚(N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)拮抗剂，其降低重度AD的兴奋毒性神经炎症)。这两种药物都无法阻止进行性认知能力下降，且自2003年以来，美国食品和药物管理局(FDA)还没有批准任何新药。
Neurotropin(神经妥乐平)(商标；日本脏器制药株式会社(Nippon ZokiPharmaceutical Co.,Ltd.)的产品)(以下简称“NTP”)是众所周知的镇痛剂，来源于接种痘苗病毒的兔的炎症皮肤。在过去的50年中，NTP已被用于治疗神经性疼痛，并且其安全性已得到公认。最近的动物实验表明NTP(大多数实验是使用含有比商业产品“神经妥乐平”浓度更高的提取物的实验产品来进行的。然而，为了方便本申请，在此情况下也使用“提取物”一词。)可还具有显著的神经保护作用。三个月的NTP治疗挽救了Ts65Dn小鼠的空间认知障碍，Ts65Dn小鼠是在65％人类21号染色体三体基因情况下的唐氏综合症模型。NTP治疗还降低了梗塞病变的体积、脑水肿和由此产生的神经功能缺损，并增强C57BL/6J小鼠的空间学习能力。我们最近工作表明，NTP可以减轻APP/PS1小鼠(AD模型)的氧化应激(参见非专利文献1)并抑制BV-2细胞的神经炎症(参见非专利文献2)。然而，NTP在AD期间的记忆障碍和神经炎症方面的治疗潜力尚未得到评估。
BDNF在突触可塑性、神经元维持、细胞存活、神经递质和神经发生的调节中起关键作用，且因此在学习和记忆的维持中起着关键作用。阿尔茨海默病患者的血液和脑脊液中的BDNF浓度通常会降低。有证据表明，NTP的镇痛作用可能涉及经由BDNF诱导的疼痛下行抑制系统。此外，越来越多的证据表明BDNF对神经炎症具有调节作用。NF-κB是普遍存在的转录因子且它可通过转位到细胞核并触发靶基因的转录来调节炎症分子的表达。有证据表明，包括NF-κB的免疫相关转录因子的响应位点位于控制APP表达的基因的调节启动子区域。在小鼠实验中，TNF受体的基因敲除降低由NF-κB介导的β-分泌酶(BACE1)表达。有趣的是，此过程还与Aβ减少和认知功能增强有关。
本研究评估NTP对AD转基因小鼠模型中认知功能障碍和神经炎症的影响并检查相关分子机制。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Fang WL,Zhao DQ,Wang F,Li M,Fan SN,Liao W,Zheng YQ,LiaoSW,Xiao SH,Luan P和Liu J.Neurotropin(R)alleviates hippocampal neuron damagethrough a HIF-1/MAPK pathway.Cns Neuroscience&Therapeutics 2017；23:428-437。
非专利文献2：Zheng Y,Fang W,Fan S,Liao W,Xiong Y,Liao S,Li Y,Xiao S和Liu J.Neurotropin inhibits neuroinflammation via suppressing NF-kappaB andMAPKs signaling pathways in lipopolysaccharide-stimulated BV2 cells.JPharmacol Sci 2018；136:242-248。
发明内容
在一个方面，本发明涉及脑部炎症的抑制或缓解制剂，其包含接种痘苗病毒的炎症组织的提取物作为活性成分。
在一个优选的实施方式中，通过经由BDNF-TrkB的细胞内信号传导的促进来诱导脑部炎症的抑制或缓解。
在另一个优选的实施方式中，通过细胞内信号传导的促进来抑制神经胶质细胞的活化。
在另一个优选的实施方式中，上述神经胶质细胞是小神经胶质细胞或星形胶质细胞。
在另外的实施方式中，通过细胞内信号传导的促进来抑制NF-κB途径相关蛋白的活化。
在又一个实施方式中，NF-κB途径相关蛋白为IκB或p65。
在又一个实施方式中，通过促炎细胞因子的表达的抑制来诱导脑部炎症的抑制或缓解。
在又一个实施方式中，上述促炎细胞因子为IL-1β、IL-6或TNF-α。
在又一个实施方式中，上述制剂用于阿尔茨海默病的预防、缓解、控制进展或治疗。
在又一个实施方式中，上述炎症组织是兔的皮肤组织。
在又一个实施方式中，上述制剂是注射剂或口服剂。
在另一个方面中，本发明还涉及接种痘苗病毒的炎症组织的提取物或包含该提取物的制剂的测定或评价方法，其特征在于，将由培养的神经胶质细胞中BDNF表达促进所诱导的促炎细胞因子和/或NF-κB途径相关蛋白的表达的抑制用作指标。
在一个优选的实施方式中，培养的神经胶质细胞为BV-2细胞。
在另一个优选的实施方式中，上述促炎细胞因子为IL-1β、IL-6或TNF-α。
在另一个优选的实施方式中，NF-κB途径相关蛋白为IκB或p65。
在另外的实施方式中，上述炎症组织是兔的皮肤组织。
在又一个方面中，本发明还涉及接种痘苗病毒的炎症组织的提取物在生产脑部炎症的抑制或缓解制剂中的用途。
在一个优选的实施方式中，通过经由BDNF-TrkB的细胞内信号传导的促进来诱导脑部炎症的抑制或缓解。
附图说明
图1：A.每组小鼠中小鼠的逃避潜伏期。B.每组小鼠的归一化逃避潜伏期。C.小鼠找到平台的代表性路径图像。D.小鼠游泳寻找平台的平均距离。E.小鼠游过目标象限的次数。结果表示为每组中至少八只小鼠的平均值±SE。**P<0.01，且NS为不显著。
图2：A.通过Bielschowsky银染色检测皮层和海马体中的Aβ斑块。B.用免疫荧光染色检测皮层和海马体中的Aβ斑块。C.使用Bielschowsky银染色量化Aβ斑块负荷(Aβplaqueload)。D.免疫荧光染色对Aβ斑块负荷(Aβplaque burden)的统计分析。E和G.TG和TG+NTP小鼠脑部的可溶性和不溶性Aβ1-40。F和H.TG小鼠和TG+NTP小鼠脑部的可溶性和不溶性Aβ1-42。结果表示为来自六个独立实验的平均值±SE。相对于TG小鼠，*P<0.05且**P<0.01。
图3：TG组和TG+NTP组小鼠的皮层和海马体的冠状切片被染色用于A.Aβ、Ibal和DAPI、B.Aβ、GFAP和DAPI。皮质和海马体中的小神经胶质细胞C.和星形胶质细胞D的面积百分比。ELISA分析各组的皮层和海马体中的IL-1β(E)、IL-6(F)和TNF(G)的水平。数据表示为每组六只小鼠的平均值±SE。*P<0.05且**P<0.01。
图4：用各组的皮层(A)和海马体(B)的免疫荧光染色来检测BDNF。用ELISA分析皮质和海马体中BDNF(C)、NGF(D)和NT-3(E)的水平。数据表示为每组六只小鼠的平均值±SE。*P<0.05，**P<0.01，且N.S.为不显著。
图5：A.p-65和p-IκB的水平的蛋白质印迹分析。B.量化每组小鼠中p-P65、p-IκB-α和β-肌动蛋白的相对水平作为上样对照。数据表示为每组中的至少三只小鼠的平均值±SE。*P<0.05且**P<0.01。
图6：A-C.与对照组相比，LPS处理后IL-1β、IL-6和TNF-α被发现高表达。在施用选择性、非竞争性BDNF受体拮抗剂ANA12后，IL-1β、IL-6和TNF-α增加。D.在用ANA12处理后通过CCK8测定细胞存活率。E.NTP和ANA12处理后检测BDNF水平。F-H.p-p65和p-IκB-α都被LPS活化，且通过NTP而失活。ANA12消除了p-p65和p-IκB-α的活化。
具体实施方式
材料
对于提取物的基本提取步骤，例如使用以下步骤。
(A)收集通过皮内接种痘苗病毒的兔、小鼠等炎症皮肤组织，并破碎炎症组织。向破碎的组织中加入提取溶剂诸如水、苯酚水、生理盐水或加苯酚的甘油水进行数天的提取处理。然后，将混合物过滤或离心，得到粗提取物(滤液或上清液)，从中除去组织碎片。
(B)将(A)中得到的粗提取物调至酸性pH值，加热，然后过滤或离心进行除蛋白处理。之后，将除蛋白后的溶液调至碱性pH，加热，然后过滤或离心得到除蛋白后的滤液或上清液。
(C)将(B)中得到的滤液或上清液调至酸性pH值，且用活性炭或高岭土等吸附剂吸附。
(D)在(C)中得到的吸附剂中加入提取溶剂诸如水，将该混合物调至碱性pH，且洗脱吸附成分，得到接种痘苗病毒的兔炎症皮肤提取物(本发明提取物)。
多种可感染痘苗病毒的动物诸如兔、牛、马、绵羊、山羊、猴、大鼠、小鼠等均可作为接种痘苗病毒获得炎症组织的动物。其中，优选将兔的炎症皮肤组织作为炎症组织。任何兔子都可以使用，只要它属于兔形目。其实例包括穴兔、家兔(驯化穴兔)、野兔(日本野兔)、鼠兔和雪兔。其中适宜使用家兔。在日本，有一种叫做“加藤”的家兔，自古以来就被饲养，且经常用作家畜或实验动物，是家兔的别称。家兔有很多品种，而被称为日本白和新西兰白的品种被优选使用。
本文使用的痘苗病毒可以是任何株。其实例包括Lister株、Dairen株、Ikeda株、EM-63株和New York City Board of Health株。
关于制造提取物的方法的更详细描述记载于例如WO2016/194816的[0024]～[0027]、[0031]等段落中。
Aβ25-35由上海生工生物工程技术服务有限公司(中国上海)(Shanghai SangonBiological Engineering Technology&Services(Shanghai,China))合成。胎牛血清(FBS)、培养基(DMEM)、神经基础培养基和N2补充剂购自Gibco(纽约，美国)。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)购自Dojin Kagaku(日本九州熊本(Kumamoto,Kyushu,Japan))。细胞凋亡检测试剂盒购自eBioscience(美国加利福尼亚州圣迭戈(San Diego,CA,USA))。ROS检测试剂盒和JC-1线粒体膜电位检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所(中国上海)(BeyotimeInstitute of Biotechnology(Shanghai,China))。Hoechst 33342和碘化丙啶(PI)购自英杰/生命技术公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)(Invitrogen/Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)。SOD、GSH、MDA和CAT试剂盒由建成生物工程研究所(中国南京)(Jiancheng Bioengineering Institute(Nanjing,China))提供。针对p-Erkl/2、p-P38、p-JNK、Erkl/2、P38、JNK、Bcl-2、Bax的以下一抗和二抗辣根过氧化物酶-(HRP-)偶联山羊抗兔IgG购自Cell Signaling Technology(美国马萨诸塞州丹佛)(Danvers,MA,USA)。针对HIF-1a的一抗购自艾博抗(美国马萨诸塞州坎布里奇)(Cambridge,MA,USA)，而针对Aβ1-42的一抗购自西格玛奥德里奇(美国密苏里州圣路易斯)Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。化学发光辣根过氧化物酶底物购自密理博(美国马萨诸塞州比勒利卡)(Millipore(Billerica,MA,USA))。所有其他常规实验用品和试剂均购自赛默飞世尔(Thermo Fisher)、英杰和MRBiotech。
实施例
对于提取物的基本提取步骤，例如使用以下步骤。
(A)收集通过皮内接种痘苗病毒的兔、小鼠等炎症皮肤组织，并破碎炎症组织。向破碎的组织中加入提取溶剂诸如水、苯酚水、生理盐水或加苯酚的甘油水进行数天的提取处理。然后，将混合物过滤或离心，得到粗提取物(滤液或上清液)，从中除去组织碎片。
(B)将(A)中得到的粗提取物调至酸性pH值，加热，然后过滤或离心进行除蛋白处理。之后，将除蛋白后的溶液调至碱性pH，加热，然后过滤或离心得到除蛋白后的滤液或上清液。
(C)将(B)中得到的滤液或上清液调至酸性pH值，且用活性炭或高岭土等吸附剂吸附。
(D)在(C)中得到的吸附剂中加入提取溶剂诸如水，将该混合物调至碱性pH，且洗脱吸附成分，得到接种痘苗病毒的兔炎症皮肤提取物(本发明提取物)。
多种可感染痘苗病毒的动物诸如兔、牛、马、绵羊、山羊、猴、大鼠、小鼠等均可作为接种痘苗病毒获得炎症组织的动物。其中，优选将兔的炎症皮肤组织作为炎症组织。任何兔子都可以使用，只要它属于兔形目。其实例包括穴兔、家兔(驯化穴兔)、野兔(日本野兔)、鼠兔和雪兔。其中适宜使用家兔。在日本，有一种叫做“加藤”的家兔，自古以来就被饲养，且经常用作家畜或实验动物，是家兔的别称。家兔有很多品种，而被称为日本白和新西兰白的品种被优选使用。
本文使用的痘苗病毒可以是任何株。其实例包括Lister株、Dairen株、Ikeda株、EM-63株和New York City Board of Health株。
关于制造提取物的方法的更详细描述记载于例如WO2016/194816的[0024]～[0027]、[0031]等段落中。
(1)小鼠和给药
APPswe/PSldE9(APP/PS1)双转基因小鼠购自南京大学模式动物研究所(中国南京)(Model Animal Research Center of Nanjing University(Nanjing,China))。这些小鼠通过嵌合插入人淀粉样前体蛋白(APP)和人早老素(PS1)基因来模拟AD，这些基因在早发性AD患者中过度表达。将24只6月龄的APP/PS1雄性和24只野生型同窝仔鼠对照饲养在无特定病原体(SPF)条件下，12小时光/暗循环，自由获取食物和水，且所有这些都按照中国广州中山大学机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committeeof Sun Yat-sen University,Guangzhou,China)的实验规程。随机选择来自每个基因型的一半小鼠接受200NU/kg NTP或0.9％NaCl安慰剂，每天口服灌胃施用三个月(每组n＝12)。治疗后，当它们到9月龄时，对小鼠进行行为测试，然后处死以进行生化分析。
(2)细胞培养
永生BV-2鼠小神经胶质细胞(由中山大学孙逸仙纪念医院(Sun Yat-senMemorial Hospital,Sun Yat-sen University)Dr.Ying Chen赠予)如所述被培养(参见非专利文献2)。BV-2培养物用0.1NU/mL NTP处理，然后在12小时后给予脂多糖(1000ng/mL，LotL2880，O55:B5，美国密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇)。一些培养物在NTP之前用10μM选择性非竞争性BDNF受体激动剂ANA-12(西格玛奥德里奇)预处理1h，以证明NTP通过BDNF途径的作用(参考Fan D、Li J、Zheng B、Hua L和Zuo Z.Enriched EnvironmentAttenuates Surgery-Induced Impairment of Learning,Memory,and NeurogenesisPossibly by Preserving BDNF.ExpressionMol Neurobiol 2016；53:344-354。以及LiuS,Li X,Gao J,Liu Y,Shi J和Gong Q.Icariside II，a Phosphodiesterase-5Inhibitor,Attenuates Beta-Amyloid-Induced Cognitive Deficits via BDNF/TrkB/CREBSignaling.Cell Physiol Biochem2018；49:985)。
(3)莫里斯水迷宫(MWM)
经过三个月的NTP或载体治疗后，如前所述在莫里斯水迷宫中测试小鼠的空间学习和记忆(参考Xiao SH、Zhou DY、Luan P、Gu BB、Feng LB、Fan SN、Liao W、Fang WL,YangLH,Tao EX,Guo R和Liu J.Graphene quantum dots conjugated neuroprotectivepeptide improve learning and memory capability.Biomaterials2016；106:98-110.)。简而言之，它们每天连续进行四次试验，每次试验从不同象限开始。试验测试90秒并在小鼠成功到达平台并在那里停留5秒时结束。如果小鼠在90秒内找不到平台，则实验者将小鼠手动放置在那里，让它们停留20秒。
每只小鼠第一天找到平台的时间归一化为1，然后用于归一化且随后日子的平台时间相对于前一天进行归一化(潜伏天n/潜伏天n-1)，以计算学习趋势。分析接下来的训练日相对于第一天的相对逃避潜伏期(下一天的逃避潜伏期/第一天的逃避潜伏期)并标记为学习趋势。探索试验(probe trial)在获得性试验(acquisition trial)结束后24小时在平台被移除时进行。在我们的实验中，记录到主要目标位点潜伏期、目标象限停留时间以及60秒内的平台-位点穿越次数(platform-site crossovers)。
(4)Bielschowsky银染和免疫荧光染色
如前所述对固定切片进行Bielschowsky银染色和免疫荧光染色(参考KnezovicA、Osmanovic-Barilar J、Curlin M、Hof PR、Simic G、Riederer P和Salkovic-PetrisicM.Staging of cognitive deficits and neuropathological and ultrastructuralchanges in streptozotocin-induced rat model of Alzheimer's disease.J NeuralTransm(Vienna)2015；122:577-592.and Liu J,Rasul I,Sun Y,Wu G,Li L,Premont RTand Suo WZ.GRK5 deficiency leads to reduced hippocampal acetylcholine levelvia impaired presynaptic M2/M4 autoreceptor desensitization.J Biol Chem2009；284:19564-19571.))。Bielschowsky银染色用于评估Aβ，且免疫荧光用于评估各组海马体和皮质中的Aβ沉积水平、BDNF表达以及GFAP+和Ibal+细胞的面积。用于免疫荧光染色的一抗如下：兔抗-Aβ(1:100，美国马萨诸塞州坎布里奇的艾博抗)、兔抗-BDNF(1:500；美国马萨诸塞州比勒利卡的密理博)、山羊抗-GFAP(1：1000；美国马萨诸塞州坎布里奇的艾博抗)、山羊抗-Ibal(1:500；美国马萨诸塞州坎布里奇的艾博抗)。DAPI(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)用于检测细胞核。从荧光显微镜获得图像。每个图像中皮层和海马体中的Aβ斑块、GFAP+细胞和Ibal+细胞的面积通过Image J(美国马里兰州国立卫生研究院)量化。
(5)酶联免疫吸附试验(ELISA)
大脑样本(分为皮质和海马体)在分析前在-80℃下储存。我们用ELISA法测量已施用NTP3个月的9月龄小鼠的Aβ1-40、Aβ1-42、BDNF、NGF、NT-3、IL-1β、IL-6和TNF-a的浓度(参考非专利文献2)。根据制造商的说明，使用市售的ELISA试剂盒(Aβ1-40、Aβ1-42、IL-6、IL-1β和TNF-a使用英杰公司的试剂盒，BDNF使用Promega的试剂盒，且NGF和NT-3使用CUSABIO的试剂盒)进行测定。使用BCA Protein Assay试剂盒(美国赛默飞世尔科技)测定总蛋白质浓度。用多功能酶标仪(美国加利福尼亚州森尼维耳的SpectraMax M5)检测样品的吸光度。
(6)蛋白质印迹分析
按照先前描述的程序进行蛋白质印迹和半定量分析(参考Liao W、Jiang MJ、LiM、Jin CL、Xiao SH、Fan SN、Fang WL、Zheng YQ和Liu J.Magnesium Elevation PromotesNeuronal Differentiation While Suppressing Glial Differentiation of PrimaryCultured Adult Mouse Neural Progenitor Cells through ERK/CREBActivation.Frontiers in Neuroscience2017；11:)。简而言之，用裂解缓冲液提取大脑皮层和海马体中的蛋白质30分钟，然后在4℃下以14,000rpm离心15分钟，以得到上清液用于蛋白质印迹分析。所用的一抗和稀释率如下所列：NF-κB(p65)、1:1000；p-1κBα，1:500和β-肌动蛋白，1:1000。针对NF-κB(p65)、p-IκBα和β-肌动蛋白的一抗购自Cell SignalingTechnology公司(美国马萨诸塞州)。使用辣根过氧化物酶偶联的二抗，并通过ECL高级试剂盒(ECL advanced kit)固定和可视化条带。β-肌动蛋白用作蛋白质上样和转移效率的内部对照。此处报告的蛋白质印迹分析结果代表至少3个实验。蛋白质表达的定量通过Image J(美国马里兰州国家卫生研究院(National Institutes of Health,MD,USA))进行分析。
(7)CCK-8细胞存活率检测
ANA-12对BV-2细胞存活率的影响采用CCK-8检测(参考Fan D、Li J、Zheng B、HuaL和Zuo Z.Enriched Environment Attenuates Surgery-Induced Impairment ofLearning,Memory,and Neurogenesis Possibly by Preserving BDNF Expression.MolNeurobiol 2016；53:344-354.)。简而言之，将细胞以每孔1x104个的密度在96孔板上培养24小时，然后对其施用ANA12(5μM、10μM、15μM)再持续24小时。然后将细胞在37℃下孵育2小时，并通过多功能酶标仪(美国加利福尼亚州森尼维耳的SpectraMax M5)在450nm处测量样品的吸光度值。
(8)统计分析
使用SPSS 16.0for Windows(美国伊利诺伊州芝加哥的SPSS公司(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行统计分析。使用重复测量的双向方差分析(ANOVA)来分析MWM数据。其他统计检验使用单向方差分析和学生t检验进行组间比较。数据表示为平均值±SE，且差异在P<0.05时被认为具有统计学意义。
(9)结果
(i)长期NTP治疗减轻莫里斯水迷宫中APP/PS1小鼠的认知缺陷
进行莫里斯水迷宫试验以评估NTP是否可以减轻在9月龄时APP/PS1转基因小鼠的认知缺陷(图1)。NTP处理的APP/PS1小鼠在6月龄时通过口服灌胃施用NTP，持续3个月。对照APP/PS1小鼠施用盐水(0.9％NaCl)。在隐藏平台测试期间，对照WT小鼠在连续5天训练中显示逃避潜伏期逐渐减少。在整个训练期间，对照APP/PS1小鼠的逃避潜伏期略有下降，但与WT小鼠相比，逃避潜伏期显著延长(P<0.01，图1的A)。为了控制游泳速度的个体差异，我们还将第一个试验日的每组的逃避潜伏期标准化为1.0(图1的B)。与WT小鼠相比，对照APP/PS1小鼠在学习趋势上仍然表现出失败，表明学习能力受损(P<0.01，图1的B)。相比之下，NTP处理后的APP/PS1小鼠表现出与WT小鼠相当的学习趋势。与逃避潜伏期相似，与对照APP/PS1小鼠相比，NTP处理的APP/PS1小鼠表现出逐渐减少的游泳长度(P<0.01，图1的C和D)。在探索试验中，与对照APP/PS1小鼠相比，NTP处理的APP/PS1小鼠倾向于集中在池中的目标区域且穿越目标象限的次数更多(P<0.01，图1的E)。NTP处理的小鼠与对照WT小鼠相似，在逃避潜伏期、路径长度和穿越平台区域次数方面没有观察到显著差异。这些结果表明长期NTP处理可以改善APP/PS1小鼠的认知缺陷。
(ii)长期NTP治疗降低APP/PS1小鼠的Aβ负荷
为了检查NTP处理对Aβ聚集的潜在功能并观察NTP处理后的形态变化，使用Bielschowsky银染色和免疫荧光染色对四组小鼠的皮质和海马体切片进行染色(图2的A和B)。定量分析表明，与对照APP/PS1小鼠相比，用NTP处理的APP/PS1小鼠在皮质和海马体区域的淀粉样蛋白斑块均显著降低(P<0.01，图2的C和D)。此外，之前的研究显示，APP/PS1小鼠的可溶性和不溶性Aβ1-40和Aβ1-42的水平与年龄相关的增加(参考Zhou J、Ping FF、Fv WT、Feng JY和Shang J.Interleukin-18directly protects cortical neurons byactivating PI3K/AKT/NF-kappaB/CREB pathways.Cytokine 2014；69:29-38.和GrilliM,Ribola M,Alberici A,Valerio A,Memo M和Spano P.Identification andcharacterization of a kappa B/Rel binding site in the regulatory region ofthe amyloid precursor protein gene.J Biol Chem 1995；270:26774-26777.)。与降低的Aβ负荷一致，EFISA分析证明，与APP/PS1小鼠的海马体和皮层的情况相比，经NTP处理的APP/PS1小鼠表现出可溶性Aβ1-40和Aβ1-42水平显著下降(P<0.05，图2的E、图2的F)。我们还发现NTP处理的APP/PS1小鼠中的不溶性Aβ1-40和Aβ1-42显著降低(P<0.05，图2的G、图2的H)。这些结果表明，NTP的长期治疗能够具有对APP/PS1小鼠的脑部Aβ斑块的产生和积累的抑制效果。
(iii)长期NTP治疗抑制APP/PS1小鼠的神经胶质细胞活化
活化的小神经胶质细胞和星形胶质细胞已被证明与Aβ积累有关，且它们可以促进产生促炎细胞因子，从而导致突触功能障碍、神经元死亡和神经变性。因此，我们使用针对离子钙结合衔接分子1(Iba-1)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的抗体进行的免疫荧光染色来检查NTP处理是否可能改变在9月龄的APP/PS1小鼠的大脑皮层和海马体中的神经胶质细胞活化，以揭示小神经胶质细胞增生和星形胶质细胞增生的变化。我们发现Aβ斑块被Iba-1免疫反应性(IR)小神经胶质细胞(图3的A)和GFAP-IR星形胶质细胞(图3的B)包围，表明对照APP/PS1小鼠的皮层和海马体中的小神经胶质细胞和星形胶质细胞都活化。相比之下，观察到Iba-1-IR小神经胶质细胞的面积百分比显著降低，同时NTP处理的APP/PS1小鼠的Aβ负荷降低(P<0.01，图3的C)。一致地，在NTP处理后，GFAP-IR星形胶质细胞的面积百分比也降低(P<0.01，图3的D)。这些结果表明长期NTP治疗可抑制APP/PS1小鼠的神经胶质细胞活化。
(iv)NTP治疗降低APP/PS1小鼠的促炎细胞因子
持续活化的小神经胶质细胞和星形胶质细胞可以经由释放促炎细胞因子介导神经炎症且有利于Aβ沉积，从而导致炎性神经元损伤。此外，先前证据已经表明NTP能够抑制肝细胞中炎性细胞因子的表达。因此，为了探索用NTP进行的长期治疗是否影响9月龄APP/PS1小鼠炎症因子的产生，我们使用ELISA测试来检查促炎症细胞因子的水平，包括白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-a)。我们观察到APP/PS1小鼠的IL-1β水平明显高于NTP处理的APP/PS1小鼠(P<0.05，图3的E)。NTP处理后，APP/PS1小鼠表现出降低的IL-6水平(P<0.05，图3的F)。此外，与未经NTP处理的APP/PS1小鼠相比，NTP处理组的TNF-α水平较低(P<0.05，图3的G)。WT小鼠和NTP处理的WT小鼠之间的IL-1β、IL-6和TNF-α水平没有差异。这些结果证明，NTP可以有效减少炎症反应，从而改善APP/PS1小鼠的神经炎症。
(v)NTP处理促进APP/PS1小鼠的BDNF表达
脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族的一员，对突触可塑性和神经元存活至关重要，且对学习和记忆也至关重要。已经发现BDNF能够减弱促炎细胞因子产生，证明BDNF可与神经炎症期间的稳态维持相关(参考Lima Giacobbo B、Doorduin J、Klein HC、Dierckx R、Bromberg E和de Vries EFJ.Brain-Derived Neurotrophic Factor in BrainDisorders:Focus on Neuroinflammation.Mol Neurobiol2018；)。因此，我们通过免疫染色(图4的A和B)和ELISA(P<0.01，图4的C)进一步探索每组小鼠BDNF表达的变化。
结果表明，与WT小鼠相比，9月龄的APP/PS1小鼠在大脑皮层和海马体中的BDNF水平显著降低。相比之下，与对照APP/PS1小鼠相比，NTP处理的APP/PS1小鼠的皮层和海马体中的BDNF水平显著增强(P<0.01，图4的A-C)。此外，与对照APP/PS1小鼠相比，在NTP处理的APP/PS1小鼠的海马体中观察到NGF水平上调，但未在皮质中观察到(P<0.05，图4的D)。然而，我们发现神经营养因子-3(NT-3)的水平在所有小鼠组中保持不变(P>0.05，图4的E)。总之，这些发现揭示，长期NTP治疗可以显著促进APP/PS1小鼠脑部BDNF的表达。
(vi)NTP在体内和体外调节NF-κB途径
为了进一步探索潜在机制，我们通过蛋白质印迹分析评估NF-κB途径相关蛋白的表达。我们发现与WT组相比，APP/PS1小鼠的蛋白质表达p-p65和p-1κB-α显著上调。NTP处理后，APP/PS1小鼠中的p-p65和p-IκB-α显著下调(图5)。这表明NTP可经由BDNF/NF-κB途径抑制神经炎症并改善认知障碍。
为了验证此机制，我们使用LPS在BV-2细胞中诱导炎症。表明与对照组相比，发现在LPS处理(1000ng/mL)后，IL-1β、IL-6和TNF-α高表达(图6的A-C)。为了进一步探索BDNF和NF-κB之间的联系，我们使用选择性非竞争性BDNF受体拮抗剂ANA12来抑制BDNF途径。如图6的A-C所示，IL-1β、IL-6和TNF-α的表达在NTP处理后降低，但在ANA12施用后增加。在用ANA12处理后通过CCK8测定细胞存活率，并且细胞存活率在5μM、10μM和15μM浓度的ANA12处理后没有差异(图6的D)。此外，在NTP和ANA12处理后检测到BDNF水平。LPS降低BDNF水平，而NTP增加BDNF水平。NTP对BDNF的影响被ANA12消除(图6的E)。我们还检查p-p65和p-IκB-α在LPS刺激的细胞上的表达。一致地，我们发现p-p65和p-IκB-α都被LPS活化并被NTP降低。有趣的是，p-P65和p-IκB-α的活化显示被ANA-12消除(图6F-H)。总之，我们的结果证明NTP在体内和体外调节BDNF/NF-κB途径。
工业上的可利用性
NTP是用于治疗顽固性神经性疼痛的广泛使用的镇痛药。最近，NTP的潜在治疗作用正在迅速扩大。NTP显示出保护脑部免受缺血性中风的能力，加速脱髓鞘疾病中的髓鞘再生并减少肌肉机械性痛觉过敏。然而，尚未有证据表明NTP在作为多因素神经退行性疾病且没有有效治疗方案的AD的小鼠模型中对认知功能和炎症的作用。
证明NTP具有增强C57BL/6J小鼠空间学习的功能。此外，发现NTP可有利于Ts65Dn小鼠(唐氏综合症小鼠模型)的认知改善。然而，仍然没有NTP对阿尔茨海默病有任何影响的证据。我们的研究表明，长期NTP治疗足以改善APP/PS1小鼠的认知缺陷，这已经通过莫里斯水迷宫测试评估。
神经炎症是AD的重要特征，且Aβ活化小神经胶质细胞和星形胶质细胞可促进促炎细胞因子的产生，从而增强神经炎症反应。在此研究中，我们选择APP/PS1小鼠作为我们的AD转基因模型，因为此模型稳定地模拟AD的行为和病理变化并已广泛用于AD研究。本研究强调NTP对APP/PS1小鼠神经炎症(包括小神经胶质细胞增生、星形胶质细胞增生和促炎症细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-a))的抑制作用。
在本研究中，我们观察到NTP处理显著增加BDNF的表达，而BDNF受体的抑制剂可以消除此影响。这表明NTP可以BDNF依赖性的方式发挥神经保护作用。已经证明Bdnf基因表达受身体活动或病理刺激(如压力、创伤、感染和衰老)的调节。AD患者血浆中的BDNF水平降低。通常，BDNF被翻译为神经营养因子前体(pro-BDNF)，它可以被内切蛋白酶或金属蛋白酶切割为成熟BDNF。BDNF可以分泌并与两种不同的受体、即低亲和力p75神经营养因子受体(p75NTR)和高亲和力受体酪氨酸激酶B(TrkB)结合。与这两种不同受体结合可能活化不同途径并导致细胞死亡或存活。然而，据报道，在动物模型中，pro-BDNF的浓度比成熟的BDNF低十倍。因此，我们在本研究中检测成熟BDNF并使用TrkB抑制剂来阻断BDNF途径。
小神经胶质细胞积极参与病理性神经炎症过程的发展，其在AD发病机制中起重要作用。在此研究中，我们的结果表明，长期NTP治疗抑制APP/PS1小鼠的神经胶质细胞活化并减少促炎细胞因子。在神经系统中，神经元炎症活化的主要因素是NF-κB，它是免疫细胞的凋亡、增殖和成熟的调节剂。NF-κB(p65)与IKB结合，作为无活性的p65/IκB复合物，在其活化前存在于细胞质中。据报道，在AD脑部的淀粉样斑块周围发现活化NF-κB。Frede及其同事观察到细菌性LPS能够诱导NF-κB上调。一致地，我们最近的研究证明，NTP可以抑制脂多糖刺激的BV2细胞中NF-κB的表达。一致地，目前的结果表明，在APP/PS1小鼠模型中，NTP的补充显著降低p-p65和p-1κB-α的活化。然而，据报道，BDNF与TrkB的结合也可以诱导NF-κB的表达。由BDNF刺激的NF-κB可能经由激酶IKKα和IKKβ活化PLC-y/PKC信号传导，其随后将NF-κB抑制单元IκBα磷酸化。因此，泛素的结合和蛋白酶体对IκBα的降解诱导NF-κB的释放。
Qirui Bi等人表明蟾酥通过NF-κB途径触发神经炎症，从而导致BDNF最终减少，但他们没有将NF-κB细胞因子与BDNF直接联系起来。Cai等人报告BDNF通过调节NF-κB信号传导来防止IL-1β刺激。我们在体外使用特定BDNF受体抑制剂ANA12来阻断BDNF途径。此预处理消除NTP对LPS刺激炎症的神经保护作用，支持NTP可以经由BDNF/NF-κB途径保护神经炎症的观点。
然而，BDNF作用于NF-κB的确切机制仍有待探索。酪蛋白激酶II(CK2)是高度保守的普遍存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其已被证明可以活化NF-κB。据报道，BDNF通过CK2上调NF-κB。此外，BDNF被证明经由ERK1/2信号产生神经保护作用，这与我们之前的研究一致。BDNF经由CK2活化NF-κB，这似乎与ERK1/2和PI3K无关。正如我们之前的研究表明，NTP可以使p65从细胞质到细胞核的易位，这可能是BDNF调节NF-κB活化的新机制。需要进一步研究以充分了解BDNF对NF-κB途径的作用机制。
这些有趣的发现表明，NTP可以通过经BDNF/NF-κB途径的增强来抵消神经炎症并挽救APP/PS1小鼠的认知缺陷。该结果提供对NTP和神经炎症相互作用的进一步了解。NTP可为AD患者的新型有希望的候选药物。此外，尽管NTP已在人体中建立了安全性，但仍需要大规模临床试验以进一步证实其对散发性和家族性AD的神经保护能力。

Claims (19)

1.一种用于脑部炎症的抑制或缓解制剂，其特征在于：
包含接种痘苗病毒的炎症组织的提取物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：
通过经由BDNF-TrkB的细胞内信号传导的促进来诱导所述脑部炎症的抑制或缓解。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于：
通过所述细胞内信号传导的促进来抑制神经胶质细胞的活化。
4.根据权利要求3所述的制剂，其特征在于：
所述神经胶质细胞是小神经胶质细胞或星形胶质细胞。
5.根据权利要求2～5中任一项所述的制剂，其特征在于：
通过所述细胞内信号传导的促进来抑制NF-κB途径相关蛋白的活化。
6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于：
所述NF-κB途径相关蛋白为IκB或p65。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制剂，其特征在于：
通过促炎细胞因子的表达的抑制来诱导所述脑部炎症的抑制或缓解。
8.根据权利要求7的制剂，其特征在于：
所述促炎细胞因子为IL-1β、IL-6或TNF-α。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制剂，其特征在于：
所述制剂用于阿尔茨海默病的预防、缓解、进展控制或治疗。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的制剂，其特征在于：
所述炎症组织为兔的皮肤组织。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的制剂，其特征在于：
所述制剂为注射剂。
12.根据权利要求1～10中任一项所述的制剂，其特征在于：
所述制剂为口服剂。
13.一种接种痘苗病毒的炎症组织的提取物或包含所述提取物的制剂的测定或评价方法，其特征在于：
将由培养的神经胶质细胞中的BDNF的表达促进所诱导的促炎细胞因子和/或NF-κB途径相关蛋白的表达的抑制用作指标。
14.根据权利要求13所述的测定或评价方法，其特征在于：
所述培养的神经胶质细胞为BV-2细胞。
15.根据权利要求13或14所述的测定或评价方法，其特征在于：
所述促炎细胞因子为IL-1β、IL-6或TNF-α。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的测定或评价方法，其特征在于：
所述NF-κB途径相关蛋白为IκB或p65。
17.根据权利要求13～16中任一项所述的测定或评价方法，其特征在于：
所述炎症组织为兔的皮肤组织。
18.一种接种痘苗病毒的炎症组织的提取物在制备用于脑部炎症的抑制或缓解制剂中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其特征在于：
通过经由BDNF-TrkB的细胞内信号传导的促进来诱导所述脑部炎症的抑制或缓解。
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