CN113424050A - 用于计算多通道图像中的自体荧光贡献的系统和方法 - Google Patents

用于计算多通道图像中的自体荧光贡献的系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113424050A
CN113424050A CN202080013853.2A CN202080013853A CN113424050A CN 113424050 A CN113424050 A CN 113424050A CN 202080013853 A CN202080013853 A CN 202080013853A CN 113424050 A CN113424050 A CN 113424050A
Authority
CN
China
Prior art keywords
autofluorescence
channel
pixel
spectrum
spectra
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080013853.2A
Other languages
English (en)
Inventor
J·布雷德诺
M·科贾斯特
I·拉夫金
S·希夫曼
王兴伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ventana Medical Systems Inc
Original Assignee
Ventana Medical Systems Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ventana Medical Systems Inc filed Critical Ventana Medical Systems Inc
Publication of CN113424050A publication Critical patent/CN113424050A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V10/00—Arrangements for image or video recognition or understanding
    • G06V10/20—Image preprocessing
    • G06V10/34—Smoothing or thinning of the pattern; Morphological operations; Skeletonisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J3/44—Raman spectrometry; Scattering spectrometry ; Fluorescence spectrometry
    • G01J3/4406—Fluorescence spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06V—IMAGE OR VIDEO RECOGNITION OR UNDERSTANDING
    • G06V20/00—Scenes; Scene-specific elements
    • G06V20/60—Type of objects
    • G06V20/69—Microscopic objects, e.g. biological cells or cellular parts
    • G06V20/695—Preprocessing, e.g. image segmentation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J2003/283—Investigating the spectrum computer-interfaced
    • G01J2003/2843—Processing for eliminating interfering spectra
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01J—MEASUREMENT OF INTENSITY, VELOCITY, SPECTRAL CONTENT, POLARISATION, PHASE OR PULSE CHARACTERISTICS OF INFRARED, VISIBLE OR ULTRAVIOLET LIGHT; COLORIMETRY; RADIATION PYROMETRY
    • G01J3/00—Spectrometry; Spectrophotometry; Monochromators; Measuring colours
    • G01J3/28—Investigating the spectrum
    • G01J2003/2866—Markers; Calibrating of scan
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N2021/6417—Spectrofluorimetric devices
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G01N2021/6441—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks with two or more labels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Multimedia (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Image Processing (AREA)
  • Image Analysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Microscoopes, Condenser (AREA)

Abstract

本文公开了用于估计用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的每个通道中的自体荧光(AF)信号和其他非目标信号的系统和方法。在一些实施例中，然后可以从所述多通道图像中减去或掩蔽所估计的自体荧光信号。在一些实施例中，去除自体荧光的多通道图像然后可用于进一步处理(例如图像分析等)。

Description

用于计算多通道图像中的自体荧光贡献的系统和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年2月13日提交的美国临时专利申请第62/805,239号的申请日的权益，该临时专利申请的公开内容的全文通过引用并入本文。
背景技术
生物细胞和组织样品的荧光成像用于显现特异性抗原的存在和表达水平，例如使用将抗体与荧光染料缀合的探针。使用靶向目的特异性抗原的探针以及一种或多种组织学染料(例如DAPI，一种核复染剂)可以显现给定组织切片中的多种蛋白质。其他靶标(例如RNA或DNA)可以分别使用荧光原位杂交和寡核苷酸标记的荧光探针来显现。
染料的荧光成像涉及用第一波长带或波长范围的光激发它，并观察它响应于该激发而发射的光，例如在第二波长带或波长范围内发射的光。荧光染料响应于给定波长的激发而发光的倾向称为其激发光谱。染料发射的荧光的波长分布称为其发射光谱。
当使用多种染料时，通常选择它们以具有不同的激发光谱、发射光谱或两者兼有，使得通过仔细选择所使用的激发波长和发射波长，可以区分正被观察的染料。当各种荧光染料的光谱在它们的激发光谱和发射光谱方面不是完全不同的而是基本上重叠时，确定与观察到的发射光相关的染料变得更加困难。
许多样品表现出内源性荧光发射。这意味着，当被光激发时，除了由与抗体缀合探针结合使用或作为复染剂使用的荧光染料发射的荧光之外，样品本身发射荧光。这会进一步增加上述确定的复杂性。
荧光样品的多光谱成像涉及在不同激发波长、发射波长或两者的组合处获取样品的一系列图像。各种图像组合成图像立方体，其中立方体的两个维度对应于样品中的空间位置，并且第三个维度对应于与各种激发和/或发射波长相关联的光谱。
发明内容
本公开提供了用于估计用多种荧光标记物染色的生物学样品(例如组织切片)的多通道图像的每个通道内的自体荧光(AF)信号和其他非靶信号的系统和方法。在一些实施例中，可以从多通道图像中减去和/或掩蔽所估计的自体荧光信号。在一些实施例中，去除自体荧光的多通道图像可用于进一步处理(例如图像分析等)。
一般来讲，为了获取图像数据，对组织切片进行处理，以便用不同的荧光团标记目的生物标志物(例如，蛋白质、RNA片段或DNA片段)。当用适当选择的激发光谱的光激发时，每种类型的荧光团发射特定发射光谱(或颜色)的光。在一些实施例中，除了由不同荧光团产生的靶标信号之外，所获取的图像还可以包括非靶标信号。据信，这种非靶标信号的主要来源是自体荧光，即由组织中所含分子固有的荧光发射的光。在一些实施例中，非靶标信号的其他来源包括红细胞、死细胞和辅助载玻片制作过程的试剂，例如用于将盖玻片固定到具有组织切片的载玻片的封固剂。
荧光多重染色方法在提取组织结构背景下的关于多种生物标志物的表达、共表达和共定位的信息方面具有巨大潜力，从而保留了生物标志物的空间信息和相互关系。荧光多重测定需要对多种荧光标志物进行成像，这使得成像成为工作流程中的重要组成部分。不同的成像模态已被用于荧光多重测定的成像和后续分析。两种主要方法包括以下步骤：
(i)使用多光谱相机进行检测。在这种配置中，来自靶标的多重板的光谱信息通过多光谱相机或检测器捕获，从而产生多光谱图像立方体。那么，每个光谱通道中检测到的信号是来自所有荧光团和AF的信号的线性组合。
(ii)使用与每个荧光团相对应的滤波器立方体(激发和发射滤波器组)，并使用单色相机检测FL发射。这产生样本的多通道图像，其中每个通道对应一个荧光团。以使由在单个成像通道内同时检测来自多于一个荧光团的FL信号所引起的FL串扰最小化的方式选择激发和发射滤波器。尽管如此，据信检测到的多通道图像中的荧光团之间将存在一些串扰，需要通过后续分析去除这些串扰，以便准确评估各个荧光团的强度。
在这两种方法中，每个光谱通道中检测到的荧光信号来自多个荧光团加上来自组织、封固剂和载玻片的自体荧光信号。在一些实施例中，线性光谱解混用于分离不同荧光团对每个光谱通道中检测到的信号的贡献。为了可靠地解混和定量光谱信息，必须获得每个荧光团发射光谱的正确实例，以及来自未染色样品的代表性自体荧光光谱(在待使用的背景下)。线性光谱解混需要最小数量的光谱通道，该最小数量等于所有荧光源(即荧光团加上自体荧光)的数量。
上述第一成像模态通常捕获大量光谱通道中的光谱信息，并且因此满足用于线性光谱解混的最小数量的光谱通道的要求。然而，这种多光谱检测成像系统的成本、更长的图像采集时间以及用于存储多光谱图像的更高存储器要求可能是阻止使用这种模态的因素。如果使用这种成像模态，仍然期望在较少数量的检测通道中捕获图像以减少采集时间和存储空间需求。
在使用对应于每个荧光团的一个滤波器立方体的第二成像模态的情况下，添加额外的滤波器立方体来捕获自体荧光信号可能并不总是可行或有效的。在这种情况下，需要一种分析方法来估计基于样本的多通道图像的自体荧光信号，其中每个通道对应于一个荧光团。
在两种模态中，如果图像通道的数量等于或大于样本中荧光标志物的数量，则可以使用线性光谱解混方法来解混在多通道图像的每个像素处的荧光标志物和自体荧光对荧光信号的贡献。由于采集时间和图像存储空间的考虑，可以使用较少数量的图像通道从多通道或多光谱图像估计自体荧光信号的分析方法被认为是有利的。在一些实施例中，本文描述的系统和方法有利地允许更快的图像采集时间、减少的图像存储要求以及在图像采集期间更少的染色组织的荧光激发。由于荧光团经受光漂白，这意味着发射的荧光的产量随着时间和每次激发而减少，如果需要重新扫描染色的载玻片，则用较少激发的采集允许更可重现的图像采集。在一些实施例中，本文提出的系统和方法可以应用于具有最小数量的采集通道的图像采集，特别是用于使用匹配滤波器的采集，其中每个目标荧光团信号仅使用一个滤波器组。鉴于前述内容，在一些实施例中，本公开内容涉及用于确定用多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的每个通道内的自体荧光贡献的系统和方法。在一些实施例中，去除自体荧光同时保留尽可能多的特定荧光标记物。
本公开的一个方面是一种去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的方法，该方法包括：基于一个或多个检索到的自体荧光光谱独立计算多通道图像的每个像素的每个通道中的自体荧光贡献，以及从多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该相应像素的每个通道中的计算出的自体荧光贡献。在一些实施例中，从单个检索到的自体荧光光谱计算多通道图像的每个像素的每个通道中的自体荧光贡献。在一些实施例中，单个检索到的自体荧光光谱从对应于包含一种或多种荧光标记物的生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出。在一些实施例中，通过将单个检索到的自体荧光光谱独立拟合到多通道图像的像素的每个测定光谱来计算每个像素的每个通道中的自体荧光贡献。在一些实施例中，拟合包括(i)将多通道图像的像素的测定光谱除以单个检索到的自体荧光光谱，以提供像素的归一化测定光谱；(ii)计算像素的归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过单个检索到的自体荧光光谱来缩放计算的最小值。
在一些实施例中，从至少两个检索到的自体荧光光谱计算多通道图像的每个像素的每个通道中的自体荧光贡献。在一些实施例中，至少两个检索到的自体荧光光谱从对应于包含一种或多种荧光标记物的生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出。在一些实施例中，多通道图像的每个像素的每个通道中的计算的自体荧光贡献是为多通道图像的每个像素的每个通道独立识别的最大自体荧光校正值。在一些实施例中，多通道图像的每个像素的每个通道的最大自体荧光校正通过以下方式识别：(i)通过将所述至少两个检索到的自体荧光光谱中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；(ii)在每个通道中确定计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。在一些实施例中，至少两个检索到的自体荧光光谱包括至少两个自体荧光低-高光谱对。
本公开的另一方面是一种用于去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的系统，该系统包括：(i)一个或多个处理器，以及(ii)一个或多个存储器，所述一个或多个存储器与所述一个或多个处理器联接，所述一个或多个存储器存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当由所述一个或多个处理器执行时使所述系统执行包括以下步骤的操作：(a)独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的最大自体荧光校正，其中每个像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正从至少两个不同的检索到的自体荧光光谱导出；以及(b)从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正。
在一些实施例中，每个像素的每个通道的最大自体荧光校正通过以下方式计算：(i)通过将检索到的至少两个自体荧光光谱中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；(ii)在每个通道中识别计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。在一些实施例中，每个独立拟合包括(i)将多通道图像的像素的测定光谱除以至少两个检索到的自体荧光光谱中的一个，以提供像素的归一化测定光谱；(ii)计算像素的归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过至少两个检索到的自体荧光光谱中的一个来缩放计算的最小值。
在一些实施例中，至少两个检索到的自体荧光光谱包括至少两个自体荧光低-高光谱对。在一些实施例中，每个独立拟合包括(i)将多通道图像的像素的测定光谱除以至少两个自体荧光低-高光谱对中的一个的第一自体荧光低光谱；(ii)计算像素的归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过至少两个自体荧光低-高光谱对中的对应一个的第一自体荧光高光谱来缩放计算的最小值。
附图说明
有关对本公开特征的一般理解，请参考附图。在附图中，整个附图使用相同的附图标记来识别相同的元素。
图1A示出了根据一些实施例的包括图像采集装置和计算机系统在内的代表性数字病理系统。
图1B列出了根据一些实施例，可以在数字病理系统中或数字病理工作流程中使用的各种模块。
图2A列出了示出根据一些实施例的生成去除自体荧光的多通道图像的各个步骤的流程图。
图2B列出了示出根据一些实施例的使用单个自体荧光光谱计算所测量的像素光谱的每个通道中自体荧光贡献的各个步骤的流程图。
图2C列出了示出根据一些实施例的使用两个或更多个不同的自体荧光光谱计算所测量的像素光谱的每个通道中自体荧光贡献的各个步骤的流程图。
图2D描绘了示出图2C中描绘的方法的每个步骤的输出的工作流。
图2E列出了示出根据一些实施例的使用两个或更多个自体荧光光谱对计算所测量的像素光谱的每个通道中自体荧光贡献的各个步骤的流程图。
图2F描绘了示出图2E中描绘的方法的每个步骤的输出的工作流。
图3A示出了多通道图像内对应于自体荧光的区域。
图3B示出了去除自体荧光的多通道图像，其中来自图3A的所识别的不需要的自体荧光已经被去除。
图4示出了测定像素光谱、检索到的自体荧光光谱和拟合自体荧光光谱。
图5A示出了测定像素光谱以及第一和第二检索到的自体荧光光谱。
图5B示出了测定像素光谱、第一和第二拟合自体荧光光谱以及最大拟合自体荧光光谱。
图6A示出了从光谱分组导出的高和低光谱对。
图6B示出了从光谱分组导出的高和低光谱对的另一个实例。
图6C示出了例如从训练图像中并且在分组之前获得的多个自体荧光光谱。
图6D示出了从图6C的光谱导出的自体荧光光谱的几个不同分组。
图6E示出了自体荧光光谱的分组(左上图)和由此导出的光谱对(左下图)。
图6F示出了自体荧光光谱的分组(左上图)和由此导出的光谱对(左下图)。
图6G提供了去除自体荧光的多通道图像，其中计算的自体荧光贡献(例如从图6E和图6F的光谱对导出的那些贡献)被去除。
图7A示出了在用多个荧光分子染色之前的多通道图像。
图7B示出了通过对图7A内的信号进行光谱多阈值化而导出的排除掩模。
图7C示出了从图7A导出的包含掩模。
图7D示出了在分别应用图7B和图7C的排除掩模和包含掩模之后的去除自体荧光的多通道图像。
具体实施方式
还应该理解的是，除非指明是相反情况，否则在本文所要求保护的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，所述方法的所述步骤或动作的顺序不必限于表述所述方法的所述步骤或动作的所述顺序。
如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a/an)”和“该/所述”包括复数个指代物。同样，除非上下文另有明确指示，否则词语“或”旨在包括“和”。术语“包括”定义为包容性，如“包括A或B”是指包括A、B或A和B。
如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为与上文定义的“和/或”具有相同的含义。例如，在分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应解释为具有包容性，即包含若干元素或元素列表中的至少一个元素，但也包含一个以上元素，以及可选地包含额外的未列出的项目。只有指明与之相反的术语，如“只有一个”或“恰好一个”，或者在权利要求中使用的“由...组成”，将指包含若干元素或元素列表中的恰好一个元素。一般来说，本文使用的术语“或者”只有在前面有“或”、“其中之一”、“只有一个”或“恰好一个”等排他性术语时，才应解释为表示排他性的替代选择(即“一个或另一个，但不是两个”)。在权利要求书中使用的“基本上由...组成”应具有在专利法领域使用的普通含义。
“包括”、“包含”、“具有”等术语可互换使用，且含义相同。类似地，“包括”、“包含”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，每个术语的定义都与普通美国专利法对“包括”的定义一致，因此每个术语都可理解为一个开放性术语，其含义为“至少以下”，并且也可理释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如“具有组件a、b和c的装置”是指所述装置至少包括组件a、b和c。同样，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”是指所述方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管本文可以特定的顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到，所述顺序步骤和过程可能会有所不同。
如本文在说明书和权利要求书中所用，就一个或多个元素的列表而言，短语“至少一个”应理解为选自元素列表中任何一个或多个元素的至少一个元素，但不一定包括元素列表中具体列出的每个元素中的至少一个，也不排除元素列表中的任何元素组合。除了在短语“至少一个”所涉及的元素列表中具体确定的元素之外，该定义还允许其他元素可选地存在，无论这些元素与具体确定的元素相关与否。因此，作为一个非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或者等效地，“A或B中的至少一个”，或者等效地，“A和/或B中的至少一个”)在一个实施例中可以指至少一个可选地包括一个以上的A，但没有B(以及任选地包括B以外的元素)；在另一个实施例中，指至少一个任选地包括一个以上的B，但没有A(以及任选地包括A以外的元素)；在又一个实施例中，指至少一个任选地包括一个以上的A，以及至少一个任选地包括一个以上的B(以及任选地包括其他元素)等。
如本文所用，术语“生物学样品”、“组织样品”、“样本”或类似的术语是指从包括病毒在内的任何生物体中获得的包括生物分子(例如蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其组合)在内的任何样品。其他生物体的实例包括哺乳动物(例如人类；兽类动物，如猫、狗、马、牛和猪；以及实验室动物，如小鼠、大鼠和灵长类动物)、昆虫、环节动物、蛛形纲动物、有袋类动物、爬行类动物、两栖类动物、细菌和真菌。生物学样品包括组织样品(例如组织切片和组织的穿刺活检)、细胞样品(例如细胞学涂片，如子宫颈涂片或血液涂片或通过显微解剖获得的细胞样品)，或细胞级分、碎片或细胞器(例如通过裂解细胞并通过离心或其他方式分离其组分获得)。生物学样品的其他实例包括血液、血清、尿液、精液、粪便、脑脊液、间质液、粘液、眼泪、汗液、脓液、活检组织(例如，通过手术活检或穿刺活检获得)、乳头抽吸物、耵聍、乳汁、阴道分泌物、唾液、拭子(例如口腔拭子)、或任何含有从第一生物学样品导出的生物分子的材料。在某些实施例中，本文使用的术语“生物学样品”是指从受试者获得的肿瘤或其一部分制备的样品(例如经均质或液化处理的样品)。
如本文所用，术语“标记物”(label)是指能够与分析物结合、被内在化或以其他方式吸收并例如通过形状、形态、颜色、荧光、发光、磷光、吸光度、磁性或放射性发射而被检测到的试剂。荧光标记物的合适实例包括例如荧光素、香豆素、BODIPY染料、试卤灵和罗丹明等分子(荧光分子的许多其他实例可见于The Handbook—A Guide to FluorescentProbes and Labeling Technologies,Molecular Probes,Eugene,OR)。
本文使用的“掩模”是数字图像的导数，其中掩模中的每个像素表示为二进制值，例如“1”或“0”(或“真”或“假”)。通过用所述掩模覆盖数字图像，映射到二进制值中特定一个的掩模像素的数字图像的所有像素在应用于数字图像的进一步处理步骤中被隐藏、去除或以其他方式忽略或滤除。例如，可以通过将具有高于阈值的强度值的原始图像的所有像素分配为真或假，从而创建将滤除被“假”掩蔽像素覆盖的所有像素的掩模，来从原始数字图像生成掩模。
如本文所用，术语“多通道图像”是指从生物组织样品获得的数字图像，其中不同的生物结构同时用特定的染色剂、荧光染料、量子点、色原等(或其任何组合)染色，其中每一个发出荧光或在不同的光谱带中以其他方式可检测到，从而构成多通道图像的通道中的一个。多通道图像可以包括任何数量的通道，例如2个通道、3个通道、4个通道、5个通道、6个通道、9个通道等。
如本文所用，术语“多重”、“多重化的”或“多重化”是指同时、基本上同时或顺序检测样品中的多个靶标。多重化可以包括单独地和以任何和所有组合来鉴定和/或定量多种不同的核酸(例如，DNA、RNA、mRNA、miRNA)和多肽(例如，蛋白质)。
如本文所用，术语“载片”是指任何合适尺寸的、可将生物学样本置于上面进行分析的任何基质(例如，全部或部分由玻璃、石英、塑料、硅等制成的基质)，更特别地是指标准3x 1英寸显微镜载片或标准75mm x25mm显微镜载片等“显微镜载片”。可以置于载片上的生物学样本的实例包括但不限于细胞学涂片、薄的组织切片(例如来自活检)和生物学样本阵列，例如组织阵列、细胞阵列、DNA阵列、RNA阵列、蛋白质阵列或其任何组合。因此，在一个实施例中，将组织切片、DNA样品、RNA样品和/或蛋白质置于载片的特定位置上。在一些实施例中，术语“载片”可指SELDI和MALDI芯片，以及硅片。
如本文所用，术语“染色”、“进行染色”或类似的术语通常是指对生物学样本的任何处理，所述处理检测和/或区分生物学样本中特定分子(例如脂质、蛋白质或核酸)或特定结构(例如正常或恶性细胞、细胞质、细胞核、高尔基氏体或细胞骨架)的存在、位置和/或量(例如浓度)。例如，染色可以将生物学样本的特定分子或特定细胞结构与周围部分进行比对，并且染色的强度可以提供对所述样本中特定分子的量的测定。染色不仅可以和明视野显微镜一起使用，而且还可以和相衬显微镜、电子显微镜和荧光显微镜等其他观察工具一起使用，以用于辅助观察分子、细胞结构和生物体。一些由系统进行的染色可以让细胞的轮廓清晰可视。由所述系统进行的其他染色可依赖于染色的且不对其他细胞组分染色或对其他细胞组分相对极少染色的特定细胞组分(例如分子或结构)。由所述系统进行的各类染色方法的实例包括但不限于，组织化学方法、免疫组化方法和基于核酸分子间的杂交反应等分子间反应(包括非共价结合相互作用)的其他方法。特定的染色方法包括但不限于，初级染色方法(如H&E染色、子宫颈染色等)、酶联免疫组化方法，以及原位RNA和DNA杂交方法，例如荧光原位杂交(FISH)。
在一些实施例中，本公开涉及用于确定用两种或更多种荧光标记物、三种或更多种荧光标记物、四种或更多种荧光标记物等染色的生物学样品的多通道图像的每个通道内的自体荧光贡献的系统和方法。在其他实施例中，本公开涉及用于确定用多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的每个通道内的自体荧光贡献的系统和方法。在一些实施例中，去除自体荧光同时保留尽可能多的特定荧光标记物。
在一些实施例中，本公开还提供了用于生成用多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的系统和方法，其中对所生成的生物学样品的多通道图像的自体荧光进行校正，其中从多通道图像中去除(例如，减去和/或掩蔽)计算的自体荧光贡献。
多通道图像由样本的多个图像组成，其中每个图像都在某一组激发和/或发射波长下捕获。每组激发和/或发射波长被称为“通道”。跨多通道图像的多个通道的每个图像像素的强度因此形成该像素的光谱。据信，多通道图像的每个通道中的图像强度值是由所有荧光团加上自体荧光和其他不同来源例如组织、固定材料、安装介质、载玻片和盖玻片的非靶信号的贡献产生的。
本公开的至少一些实施例涉及用于分析从用一种或多种荧光标记物染色的包括组织样品的生物学样品捕获的数字图像的系统和方法。图1A示出了根据一些实施例的用于成像和分析样本的数字病理系统100。数字病理系统100可以包括成像设备12(例如显微镜或扫描器)和计算机14，据此，所述成像设备12和计算机可以通信的形式联接在一起(如直接地，或通过网络20间接地联接)。所述计算机系统14可以包括台式计算机、笔记本电脑、平板电脑或类似物、数字电子电路、固件、硬件、存储器、计算机存储介质、计算机程序或指令集(如所述程序存储在所述存储器或存储介质内)、一个或多个处理器(包括编程处理器)，以及任何其他硬件、软件或固件模块或其组合。例如，所述图1A中示出的计算系统14可以包括具有显示装置16和外壳18的计算机。所述计算机可以二值形式存储数字图像(存储在本地，如存储器中、服务器上，或另一个网络连接设备上)。所述数字图像也可以分为像素矩阵。所述像素可以包括由比特深度定义的一个或多个比特的数字值。本领域技术人员将认识到，可以利用其他计算机设备或系统，并且本文所述的计算机系统可以通信的形式与附加组件(如样本分析仪、其他成像系统、自动化载片制备设备等)联接。本文将进一步对这些附加组件中的一些附加组件以及各种可利用的计算机、网络等进行说明。PCT公开号WO/2018/189370和美国专利号9,310,302中描述了用于对用一种或多种荧光分子染色的生物学样品进行成像的设备，这两篇文献的公开内容据此以引用方式整体并入本文。
在一些实施例中，所述成像设备可以是多光谱成像(MSI)系统或荧光显微镜系统。一般来说，MSI通过访问像素层上图像的光谱分布，为病理样本的分析配备了基于计算机化显微镜的成像系统。尽管存在各种多光谱成像系统，但是这些系统在操作上有一个共同点，即能够形成多光谱图像。多光谱图像是指在电磁波谱的特定波长或特定光谱带宽上捕获图像数据的图像。这些波长可以通过光学滤波器或使用其他能够选择预设光谱分量的仪器选出，包括波长超出可见光范围的电磁辐射，例如，红外线(IR)。
MSI系统可包括光学成像系统，其一部分包含可调整为定义预先确定数量的N个离散光学波段的光谱选择系统。所述光学系统可适应于组织样品的成像，所述组织样品通过宽带光源传输照射到光学检测器上。在一个实施例中，所述光学成像系统可以包括放大系统，例如显微镜，其具有一般在空间上与所述光学系统的单一光输出对齐的单一光轴。当调整或调谐光谱选择系统(例如用计算机处理器)时，所述系统形成所述组织的图像序列，从而例如确保在不同的离散光谱带中采集图像。所述设备可额外包含可从所采集的图像序列中显示所述组织的至少一个在视觉上可感知图像的显示器。所述光谱选择系统可以包括光学分散元件，例如衍射光栅、一组光学滤波器，例如薄膜干扰滤波器或任何其他适应于为响应用户输入或预编程处理器命令而从光源通过样品向检测器透射的光的光谱中选择一个特定的通带。
替代的实施方式，光谱选择系统定义了多个对应于N个离散光谱带的光输出。这种类型的系统从光学系统引入透射光的输出，并在空间上将该光输出的至少一部分沿着N条空间不同的光路重新定向，这样便可以沿着对应于该已识别的光谱带的光路将一个已识别的光谱带中的所述样品成像到一个检测器系统上。
图1B概述了在本公开的数字病理系统内利用的各种模块。在一些实施例中，该数字病理系统采用具有一个或多个处理器103和一个或多个存储器101的计算机装置100或计算机实现的方法，所述一个或多个存储器存储用于由一个或多个处理器执行的非暂时性计算机可读指令，以使一个或多个处理器(103)执行一个或多个模块(如模块105至108)中的指令(或存储数据)。
参考图1B和图2A，在一些实施例中，本公开的系统包括：(a)成像模块102，该成像模块适于生成用一种或多种荧光分子标记的生物学样品的多通道图像(参见例如步骤200)；(b)参考光谱检索模块105，该参考光谱检索模块被配置为从数据库(例如存储子系统104内的数据库)检索一个或多个参考光谱(例如来自训练图像的参考光谱)；(c)自体荧光贡献计算模块106，该自体荧光贡献计算模块适于至少基于一个或多个检索到的参考光谱导出多通道图像中的自体荧光量(参见例如步骤201)；以及(d)图像生成模块107，该图像生成模块至少生成去除自体荧光的图像，即自体荧光已经被至少部分去除的多通道图像(参见例如步骤202)。在一些实施例中，该系统还可以包括用于生成某些排除和/或包含掩模的掩蔽模块108。在一些实施例中，可以根据需要将附加模块合并到工作流程中。例如，可以运行图像分析模块以从多通道图像内的染色对象导出特征或度量(参见例如PCT公开号PCT/US19/41257，其公开内容以引用方式整体并入本文)。同样，可以运行评分模块以对所导出的图像特征进行评分，例如对阳性百分比、膜或核染色强度进行评分，或者提供H-评分(参见例如美国公开号2015/0347702，其公开内容以引用方式整体并入本文)。
在一些实施例中，本公开的系统和方法利用一个或多个存储的自体荧光光谱，例如存储在存储子系统104内的数据库中的自体荧光光谱，并且其可以使用参考光谱检索模块105来检索。这些自体荧光光谱可以从染色的样品(例如用一种或多种荧光分子标记的样品)或未染色的样品导出。在一些实施例中，自体荧光光谱从训练图像导出，例如生物学样品的染色图像，每个图像包括一种或多种荧光标记物。在一些实施例中，染色图像包括不同组的荧光分子或不同类型的组织或细胞结构。例如，可以对用多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像进行成像并且可以识别多通道图像内的不需要的发射和/或激发(参见图3A，其中示出了四种“待去除的不同类型的自体荧光”，并且其中每种不同类型的自体荧光光谱可以存储在数据库中以供以后检索)。可以手动或以自动方式(例如运行识别具有特定强度的特定光谱波长的自动化算法)执行对不需要的发射和/或激发的识别。
在一些实施例中，可以通过强度减去方法(使用模块105、106和107)去除所获得的多通道图像(例如，用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像)的每个通道内的自体荧光贡献。在其他实施例中，可以通过应用一个或多个排除和/或包含掩码(至少使用模块108)来去除多通道图像的每个通道内的自体荧光贡献。在其他实施例中，可以通过应用一种或多种强度减去和掩蔽方法的组合来去除多通道图像的每个通道内的自体荧光贡献。例如，可以对多通道图像的第一部分应用掩蔽方法以去除一些不需要的自体荧光，而可以在应用掩蔽之后应用强度减去方法(例如对整个多通道图像或仅对第一部分)以去除一个或多个通道内的自体荧光的附加贡献。同样，可以对多通道图像的第一部分应用掩蔽方法以去除一些不需要的自体荧光，而可以对多通道图像的第二部分应用强度减去方法。
在一些实施例中，强度减去方法包括去除多通道图像内的每个像素的每个通道内的自体荧光的估计贡献。换句话说，本文描述的强度减去方法独立应用于多通道图像的每个像素，最终结果是从多通道图像(其可以是整个多通道图像，例如整个载玻片扫描，或者因此是一个或多个部分)的每个通道去除的自体荧光贡献。
在一些实施例中，多通道图像的每个通道内的自体荧光贡献从单个自体荧光光谱(例如存储在子系统104中的自体荧光光谱)导出。在一些实施例中，可以使用参考光谱检索模块105从数据库检索单个自体荧光光谱，并且该单个自体荧光光谱可以独立拟合到多通道图像的每个像素的测定光谱(方法1)。换句话说，可以为多通道图像的每个像素生成拟合自体荧光光谱，其中每个拟合自体荧光光谱通过将单个检索到的自体荧光光谱与多通道图像的像素之一的测定光谱匹配来独立生成。在一些实施例中，从特定像素的测定光谱中减去为每个像素独立生成的拟合自体荧光光谱。对多通道图像的每个像素重复该过程。
例如，如图4所示，从数据库检索到的自体荧光光谱可以拟合在多通道图像的像素的测定光谱内，以提供相应拟合的自体荧光光谱。例如，对于通道2，其中归一化测定像素强度值为1，并且检索到的自体荧光光谱的值为约0.2，在通道2处的该特定像素的拟合光谱将具有约0.05的值。在该示例中，对通道1至6中的每个通道重复“拟合”过程。然后从像素的测定光谱中减去通道1至6的拟合自体荧光光谱。
参考图2B，在一些实施例中，将自体荧光光谱“拟合”到测定光谱的过程包括归一化测定像素光谱和缩放检索到的单个自体荧光光谱以拟合在归一化测定像素光谱内。在一些实施例中，获得输入多通道图像的像素的测定像素光谱(210)。将该测定像素光谱除以检索到的自体荧光光谱以提供特定像素的归一化测定光谱(211)，例如将测定光谱的每个通道中的强度值除以自体荧光光谱的每个相应通道中的值。如上所述，可以从存储子系统104检索自体荧光光谱(步骤214)。在一些实施例中，检索到的自体荧光光谱从用一种或多种荧光分子染色的生物学样品的训练多通道图像导出。接下来，计算归一化测定光谱的最小值(212)。从该计算的最小值，可以计算每个通道中的自体荧光贡献，例如通过将计算的最小值乘以检索到的自体荧光光谱(步骤213)。在一些实施例中，可以从输入测定像素光谱中的相应通道减去每个通道中的该计算的自体荧光贡献(202)。
在其他实施例中，所获得的多通道图像的每个通道内的自体荧光贡献从两个或更多个不同的自体荧光光谱导出，其中可以从存储子系统104检索这种自体荧光光谱(方法2)。该过程类似于上面描述的将单个自体荧光光谱拟合到测定像素光谱的过程，但不同之处在于(i)两个或更多个不同的自体荧光光谱各自单独地拟合到每个测定像素光谱；以及(ii)拟合自体荧光光谱的最大值用于生成最大拟合自体荧光光谱。因此，生成的最大拟合自体荧光光谱包括在每个通道处的最大自体荧光贡献(其中在每个通道处的最大自体荧光贡献从在具有最大值的通道处的拟合自体荧光光谱导出)。例如，如果将三个光谱拟合到测定像素光谱，并且每个拟合自体荧光光谱的通道4中的强度值为约0.25(第一拟合自体荧光光谱)、约0.15(第二拟合自体荧光光谱)和约0.2(第三拟合自体荧光光谱)，则第一拟合光谱的强度值将用作在通道4处的数据点，以生成最大拟合自体荧光光谱。然后对每个通道重复该过程，使得为每个通道累积最大强度值数据点，然后可以使用累积的数据点生成最大拟合自体荧光光谱。正是该生成的最大拟合自体荧光光谱，然后从相应的测定像素光谱中减去。对多通道图像的每个像素重复该过程，即为每个像素生成最大拟合自体荧光光谱，然后从相应测定像素光谱减去特定生成的最大拟合自体荧光光谱。
例如，并且如图5A所示，可以从存储子系统104内的数据库中检索两个参考自体荧光光谱。可以将检索到的第一和第二自体荧光光谱中的每一个拟合到测定像素光谱，如图5B所示，提供第一和第二拟合的自体荧光光谱。对于每个通道，识别所有拟合自体荧光光谱的最大强度值，并且使用累积的识别的最大强度值来生成示出的最大拟合自体荧光光谱。
图3A和图3B示出了使用两个或更多个自体荧光光谱(即使用方法2)的图像减去过程的结果。例如，来自图3A的识别的不需要的信号的自体荧光光谱每个都可以拟合到多通道图像中的每个测定像素光谱，使得可以估计多通道图像的每个像素中的每个通道的自体荧光贡献。然后可以从在每个像素处的测量光谱减去每个通道的自体荧光的估计贡献，提供图3B的去除自体荧光的多通道图像。
在一些实施例中，可以拟合到测定像素光谱的存储的自体荧光光谱的数量可以在2至约1000个光谱之间的范围内。在其他实施例中，可以拟合到测定像素光谱的存储的自体荧光光谱的数量可以在2至约500个光谱之间的范围内。在其他实施例中，可以拟合到测定像素光谱的存储的自体荧光光谱的数量可以在2至约250个光谱之间的范围内。在进一步的实施例中，可以拟合到测定像素光谱的存储的自体荧光光谱的数量可以在2至约125个光谱之间的范围内。在还进一步的实施例中，可以拟合到测定像素光谱的存储的自体荧光光谱的数量可以在约5至约75个光谱之间的范围内。在更进一步的实施例中，可以拟合到测定像素光谱的存储的自体荧光光谱的数量可以在约5至约50个光谱之间的范围内。
在测定像素光谱内拟合两个或更多个不同的自体荧光光谱并生成最大拟合自体荧光光谱的过程在图2C和图2D中示出。在一些实施例中，获得输入多通道图像的像素的测定像素光谱(220)。在一些实施例中，并且参考图2D(参见曲线图1)，离线测量测定光谱(MS)和自体荧光光谱(AF)。在图2D的实例中，有两个这样的光谱，即AF1和AF2。将测定像素光谱除以第一检索到的自体荧光光谱(227)以提供特定像素的归一化测定光谱(221)，例如将测定光谱的每个通道中的强度值除以自体荧光光谱的每个相应通道中的强度值。接下来，计算归一化测定光谱的最小值(222)。从该计算的最小值，可以计算每个通道中的自体荧光校正，例如通过将计算的最小值乘以检索到的自体荧光光谱(步骤223)。关于图2D(参见曲线图2)，将测定光谱(MS)除以自体荧光光谱AF1，然后计算最小值。然后通过将计算出的最小值乘以AF1来计算校正1。
如虚线框224所示，可以对每个检索到的自体荧光光谱重复步骤221、222和223的过程(227)。例如，参考图2D(参见曲线图3)，可以将测定光谱(MS)除以自体荧光光谱AF2，然后计算最小值。然后通过将计算出的最小值乘以AF1来计算校正2。因此，为每个检索到的自体荧光光谱单独计算自体荧光校正(校正光谱)。基于计算出的自体荧光校正的总和，计算每个通道中的自体荧光贡献作为每个通道的最大自体荧光校正值(225)。
在一些实施例中，可以从输入测定像素光谱中的相应通道减去从每个通道中的最大自体荧光校正导出的每个通道中的该计算的自体荧光贡献。可以对输入多通道图像的每个像素重复(226)该过程。参考图2D(参见曲线图4)，最终校正可以被确定为所有校正中的最大值。参考图2D的曲线图5，然后可以从测定光谱(MS)减去最终校正，以提供去除AF的光谱。
在其他实施例中，每个通道内的自体荧光贡献从自体荧光光谱的一个或多个分组导出。在一些实施例中，可以根据相似性对自体荧光光谱进行分组。作为非限制性实例，可以根据自体荧光光谱的最大波长或光谱带对自体荧光光谱进行分组。例如，光谱的分组可以包括最大测量波长为约610至约640nm的那些自体荧光光谱。
在每个自体荧光光谱的分组内，可以生成光谱对。在一些实施例中，所生成的光谱对包括(i)对于每个通道具有最高强度值的所生成的自体荧光光谱；以及(ii)对于每个通道具有最低强度值的所生成的自体荧光光谱(本文中称为“高和低光谱对”)。例如，图6A和图6B示出了从自体荧光光谱的两个不同分组导出的所生成的高和低光谱对。一旦生成了高和低光谱对，就可以识别和去除高和低光谱对之间的所有可能光谱，例如使用本文所述的光谱拟合方法。
在一些实施例中，光谱组包括3至约200个收集的自体荧光光谱。在其他实施例中，光谱组包括3至约100个收集的自体荧光光谱。在其他实施例中，光谱组包括3至约50个收集的自体荧光光谱。例如，图6C示出了针对六个不同图像通道(每个图像通道具有不同的染色或标记物)的收集光谱。然后将图6C中收集的自体荧光光谱分组成不同的组(或聚类)。分组可以手动执行或者可以自动执行(例如使用k-均值聚类方法)。图6D示出了自体荧光光谱的不同组(或聚类)，每个组包括多个单独的自体荧光光谱。在一些实施例中，可以从这些单独的分组(或聚类)生成高和低光谱对。在一些实施例中，如果执行分组，则低-高对只是每个通道中的组中的所有光谱的最小值和最大值。据信，分组的目标是用最小可能去除来覆盖所有收集的光谱，这是在低光谱曲线与高光谱曲线之间的最低可能组合区域。
图6E和图6F进一步示出了从分组的自体荧光光谱生成光谱对，其中从多通道图像(参见每个图的左上图)收集包含不需要的自体荧光的分组的自体荧光光谱，由此从收集的自体荧光光谱(参见每个图的左下图)导出高和低光谱对。然后可以利用在图6E和图6F中识别的光谱对来确定多通道图像的每个通道内的自体荧光贡献，然后可以从获得的多通道图像中减去该贡献，以提供图6G的去除自体荧光的多通道图像。此外，图6E和图6F示出了AF光谱的集合，然后将其存储在数据库中，并且随后从数据库中检索它们。
在测定像素光谱内拟合两个或更多个不同的自体荧光光谱并生成最大拟合自体荧光光谱的过程在图2E和图2F中示出。在一些实施例中，获得输入多通道图像的像素的测定像素光谱(230)。在一些实施例中，并且参考图2F(参见曲线图1)，离线测量测定光谱(MS)和自体荧光光谱(AF)。在图2F的实例中，有两个这样的光谱，即AF1和AF2。
将测定像素光谱除以第一检索自体荧光低光谱(234)(例如，来自单个高和低自体荧光光谱对)以提供特定像素的归一化测定光谱(231)。接下来，计算归一化测定光谱的最小值(232)。从该计算的最小值，可以计算每个通道中的自体荧光校正，例如通过将计算的最小值乘以检索自体荧光高光谱(步骤233)。关于图2F(参见曲线图2)，将测定光谱(MS)除以自体荧光光谱AF1Low，然后计算最小值。然后通过将计算出的最小值乘以AF1High来计算校正1。
如虚线框234所示，可以对每个检索到的自体荧光光谱对重复步骤231、232和233的过程。例如，参考图2F(参见曲线图3和曲线图4)，可以将测定光谱(MS)除以自体荧光光谱AF2Low，然后计算最小值。然后通过将计算出的最小值乘以AF2High来计算校正2。因此，为每个检索到的自体荧光光谱对单独计算自体荧光校正(校正光谱)。
基于计算出的自体荧光校正的总和，计算每个通道中的自体荧光贡献作为每个通道的最大自体荧光校正值(235)。参考图2F(参见曲线图5)，最终校正可以被确定为所有校正中的最大值。参考图2F的曲线图6，然后可以从测定光谱(MS)减去最终校正，以提供去除AF的光谱。
可以从输入测定像素光谱中的相应通道减去从每个通道中的最大自体荧光校正导出的每个通道中的该计算的自体荧光贡献。可以对输入多通道图像的每个像素重复(236)该过程。
在一些实施例中，可以生成一个或多个排除掩模，并且可以将一个或多个排除掩模应用于输入图像以“掩蔽”输入多通道图像内的某些组分或结构。例如，给定特定光谱，可以对像素进行阈值化，并且如果像素的光谱落在预定范围内，则可以将其添加到排除掩模中。可以应用任何阈值技术，包括全局阈值、Otsu方法和局部阈值。阈值化技术的其他实例在美国专利公开号2017/0294017、2018/0012355和2017/0337695或PCT公开号WO/2018/115055(其公开内容据此以引用方式整体并入本文)中描述，可以应用其中的任何一个以生成排除掩模。图7B中示出了从输入多通道图像(参见图7A)导出的排除掩磨的实例。在一些实施例中，可以生成并使用多个排除掩模来掩蔽输入多通道图像的部分，以便去除对自体荧光有贡献的某些结构或组分。
在一些实施例中，可以生成一个或多个包含掩模。在一些实施例中，基于应当保留在输入多通道图像内的期望荧光来生成包含掩模。图7C中示出了从输入多通道图像(参见图7A)导出的包含掩磨的实例。图7D展示了生成的去除自体荧光的多通道图像，其中应用了排除掩模和包含掩模两者。出于说明目的，排除掩模在图7D中被覆盖，即，以示出自体荧光已被去除的位置。
附加实施例
附加实施例1.一种去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的方法，所述方法包括：基于一个或多个检索到的自体荧光光谱独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献，以及从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该相应像素的每个通道中的计算出的自体荧光贡献。
附加实施例2.如附加实施例1所述的方法，其中从单个检索到的自体荧光光谱计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例3.如附加实施例2所述的方法，其中从对应于生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出所述单个检索到的自体荧光光谱。
附加实施例4.如附加实施例3所述的方法，其中所述生物学样品的所述训练多通道图像包括一种或多种荧光标记物。
附加实施例5.如附加实施例2所述的方法，其中通过将所述单个检索到的自体荧光光谱独立拟合到所述多通道图像的像素的每个测定光谱来计算每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例6.如附加实施例5所述的方法，其中所述拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述单个检索到的自体荧光光谱，以提供所述像素的归一化测定光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述单个检索到的自体荧光光谱来缩放计算的最小值。
附加实施例7.如附加实施例1所述的方法，其中从至少两个检索到的自体荧光光谱计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例8.如附加实施例7所述的方法，其中从对应于生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出所述至少两个检索到的自体荧光光谱。
附加实施例9.如附加实施例8所述的方法，其中所述生物学样品的所述训练多通道图像包括一种或多种荧光标记物。
附加实施例10.如附加实施例8所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述计算的自体荧光贡献是为所述多通道图像的每个像素的每个通道独立识别的最大自体荧光校正值。
附加实施例11.如附加实施例10所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式识别：(i)通过将所述至少两个检索到的自体荧光光谱中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；(ii)在每个通道中确定计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
附加实施例12.如附加实施例1所述的方法，其中从至少两个检索自体荧光低-高光谱对计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例13.如附加实施例12所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述计算的自体荧光贡献是为所述多通道图像的每个像素的每个通道独立识别的最大自体荧光校正值。
附加实施例14.如附加实施例13所述的方法，其中每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式计算：(i)通过将检索到的至少两个检索到的自体荧光低-高光谱对中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；以及(ii)在每个通道中识别计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
附加实施例15.如附加实施例14所述的方法，其中每个独立拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的一个的第一自体荧光低光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的对应一个的第一自体荧光高光谱来缩放计算的最小值。
附加实施例16.一种用于去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的系统，所述系统包括：(i)一个或多个处理器，以及(ii)一个或多个存储器，所述一个或多个存储器与所述一个或多个处理器联接，所述一个或多个存储器存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当由所述一个或多个处理器执行时使所述系统执行包括以下步骤的操作：基于一个或多个检索到的自体荧光光谱独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献，以及从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该相应像素的每个通道中的计算的自体荧光贡献。
附加实施例17.如附加实施例16所述的方法，其中从单个检索到的自体荧光光谱计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例18.如附加实施例17所述的方法，其中从对应于生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出所述单个检索到的自体荧光光谱。
附加实施例19.如附加实施例18所述的方法，其中所述生物学样品的所述训练多通道图像包括一种或多种荧光标记物。
附加实施例20.如附加实施例17所述的方法，其中通过将所述单个检索到的自体荧光光谱独立拟合到所述多通道图像的像素的每个测定光谱来计算每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例21.如附加实施例20所述的方法，其中所述拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述单个检索到的自体荧光光谱，以提供所述像素的归一化测定光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述单个检索到的自体荧光光谱来缩放计算的最小值。
附加实施例22.如附加实施例16所述的方法，其中从至少两个检索到的自体荧光光谱计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例23.如附加实施例22所述的方法，其中从对应于生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出所述至少两个检索到的自体荧光光谱。
附加实施例24.如附加实施例23所述的方法，其中所述生物学样品的所述训练多通道图像包括一种或多种荧光标记物。
附加实施例25.如附加实施例23所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述计算的自体荧光贡献是为所述多通道图像的每个像素的每个通道独立识别的最大自体荧光校正值。
附加实施例26.如附加实施例25所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式识别：(i)通过将所述至少两个检索到的自体荧光光谱中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；(ii)在每个通道中确定计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
附加实施例27.如附加实施例16所述的方法，其中从至少两个检索自体荧光低-高光谱对计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例28.如附加实施例27所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述计算的自体荧光贡献是为所述多通道图像的每个像素的每个通道独立识别的最大自体荧光校正值。
附加实施例29.如附加实施例28所述的方法，其中每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式计算：(i)通过将检索到的至少两个检索到的自体荧光低-高光谱对中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；以及(ii)在每个通道中识别计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
附加实施例30.如附加实施例29所述的方法，其中每个独立拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的一个的第一自体荧光低光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的对应一个的第一自体荧光高光谱来缩放计算的最小值。
附加实施例31.一种存储有指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令用于去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献，包括基于一个或多个检索到的自体荧光光谱独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的自体荧光贡献，以及从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该相应像素的每个通道中的计算的自体荧光贡献。
附加实施例32.如附加实施例31所述的方法，其中从单个检索到的自体荧光光谱计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例33.如附加实施例32所述的方法，其中从对应于生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出所述单个检索到的自体荧光光谱。
附加实施例34.如附加实施例33所述的方法，其中所述生物学样品的所述训练多通道图像包括一种或多种荧光标记物。
附加实施例35.如附加实施例32所述的方法，其中通过将所述单个检索到的自体荧光光谱独立拟合到所述多通道图像的像素的每个测定光谱来计算每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例36.如附加实施例35所述的方法，其中所述拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述单个检索到的自体荧光光谱，以提供所述像素的归一化测定光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述单个检索到的自体荧光光谱来缩放计算的最小值。
附加实施例37.如附加实施例31所述的方法，其中从至少两个检索到的自体荧光光谱计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例38.如附加实施例37所述的方法，其中从对应于生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出所述至少两个检索到的自体荧光光谱。
附加实施例39.如附加实施例38所述的方法，其中所述生物学样品的所述训练多通道图像包括一种或多种荧光标记物。
附加实施例40.如附加实施例38所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述计算的自体荧光贡献是为所述多通道图像的每个像素的每个通道独立识别的最大自体荧光校正值。
附加实施例41.如附加实施例40所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式识别：(i)通过将所述至少两个检索到的自体荧光光谱中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；(ii)在每个通道中确定计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
附加实施例42.如附加实施例31所述的方法，其中从至少两个检索自体荧光低-高光谱对计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
附加实施例43.如附加实施例42所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述计算的自体荧光贡献是为所述多通道图像的每个像素的每个通道独立识别的最大自体荧光校正值。
附加实施例44.如附加实施例43所述的方法，其中每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式计算：(i)通过将检索到的至少两个检索到的自体荧光低-高光谱对中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；以及(ii)在每个通道中识别计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
附加实施例45.如附加实施例44所述的方法，其中每个独立拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的一个的第一自体荧光低光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的对应一个的第一自体荧光高光谱来缩放计算的最小值。
附加实施例46.一种去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的方法，所述方法包括(a)独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的最大自体荧光校正，其中每个像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正从至少两个不同的检索到的自体荧光光谱导出；以及(b)从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正。
附加实施例47.一种存储有指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令用于去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献，包括(a)独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的最大自体荧光校正，其中每个像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正从至少两个不同的检索到的自体荧光光谱导出；以及(b)从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正。
附加实施例48.一种用于去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的系统，所述系统包括：(i)一个或多个处理器，以及(ii)一个或多个存储器，所述一个或多个存储器与所述一个或多个处理器联接，所述一个或多个存储器存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当由所述一个或多个处理器执行时使所述系统执行包括以下步骤的操作：(a)独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的最大自体荧光校正，其中每个像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正从至少两个不同的检索到的自体荧光光谱导出；以及(b)从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正。
附加实施例49.如附加实施例48所述的系统，其中每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式计算：(i)通过将检索到的至少两个自体荧光光谱中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；(ii)在每个通道中识别计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
附加实施例50.如附加实施例49所述的系统，其中每个独立拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述至少两个检索到的自体荧光光谱中的一个，以提供所述像素的归一化测定光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述至少两个检索到的自体荧光光谱中的一个来缩放计算的最小值。
附加实施例51.如附加实施例49所述的系统，其中所述至少两个检索到的自体荧光光谱包括至少两个自体荧光低-高光谱对。
附加实施例52.如附加实施例51所述的系统，其中每个独立拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的一个的第一自体荧光低光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的对应一个的第一自体荧光高光谱来缩放计算的最小值。
附加实施例53.一种用于去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的系统，所述系统包括：(i)一个或多个处理器，以及(ii)一个或多个存储器，所述一个或多个存储器与所述一个或多个处理器联接，所述一个或多个存储器存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当由所述一个或多个处理器执行时使所述系统执行包括以下步骤的操作：基于至少两个检索到的自体荧光光谱独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献，以及从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该相应像素的每个通道中的计算的自体荧光贡献，其中两个或更多个检索到的自体荧光光谱从对应于包含一种或多种荧光标记物的生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出。
附加实施例54.一种存储有指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令用于去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献，包括：基于至少两个检索到的自体荧光光谱独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的自体荧光贡献，以及从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该相应像素的每个通道中的计算出的自体荧光贡献，其中两个或更多个检索到的自体荧光光谱从对应于包含一种或多种荧光标记物的生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出。
附加实施例55.一种去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的方法，所述方法包括基于至少两个检索到的自体荧光光谱独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的自体荧光贡献，以及从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该相应像素的每个通道中的计算的自体荧光贡献，其中两个或更多个检索到的自体荧光光谱从对应于包含一种或多种荧光标记物的生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出。
本说明书中提到的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利以及非专利公开均通过引用整体并入本文。如有必要，可对实施例的各个方面进行修改，从而采用各类专利、申请和公开的概念来提供其他进一步的实施例。
尽管已经参照一些说明性实施例描述了本公开，但应当理解，本领域技术人员可以在本公开原则的精神和范围内设计出许多其他的修改和实施例。更具体地，在不违背本公开的精神的情况下，在上述公开、附图和所附权利要求的范围内，所述主题组合排列的组成部分和/或布置可以进行合理的变化和修改。除了在所述组成部分和/或布置中的变化和修改外，对于本领域技术人员来说，替代用途也将是显而易见的。

Claims (21)

1.一种去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的方法，所述方法包括：基于一个或多个取得的自体荧光光谱独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献，以及从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该相应像素的每个通道中的计算出的自体荧光贡献。
2.根据权利要求1所述的方法，其中从单个取得的自体荧光光谱计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
3.根据权利要求2所述的方法，其中从对应于生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出所述单个取得的自体荧光光谱。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生物学样品的所述训练多通道图像包括一种或多种荧光标记物。
5.根据权利要求2所述的方法，其中通过将所述单个取得的自体荧光光谱独立拟合到所述多通道图像的像素的每个测定光谱来计算每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述单个取得的自体荧光光谱，以提供所述像素的归一化测定光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述单个取得的自体荧光光谱来缩放计算出的最小值。
7.根据权利要求1所述的方法，其中从至少两个取得的自体荧光光谱计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
8.根据权利要求7所述的方法，其中从对应于生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出所述至少两个取得的自体荧光光谱。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述生物学样品的所述训练多通道图像包括一种或多种荧光标记物。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述计算出的自体荧光贡献是针对所述多通道图像的每个像素的每个通道独立鉴定的最大自体荧光校正值。
11.根据权利要求10所述的方法，其中针对所述多通道图像的每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式鉴定：(i)通过将所述至少两个取得的自体荧光光谱中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；(ii)在每个通道中确定计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
12.根据权利要求1所述的方法，其中从至少两个取得的自体荧光低-高光谱对计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述自体荧光贡献。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多通道图像的每个像素的每个通道中的所述计算出的自体荧光贡献是针对所述多通道图像的每个像素的每个通道独立鉴定的最大自体荧光校正值。
14.根据权利要求13所述的方法，其中针对每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式计算：(i)通过将取得的至少两个取得的自体荧光低-高光谱对中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；以及(ii)在每个通道中鉴定计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
15.根据权利要求14所述的方法，其中每个独立拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的一个的第一自体荧光低光谱；(ii)计算所述像素的归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的对应的一个的第一自体荧光高光谱来缩放计算出的最小值。
16.一种用于去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献的系统，所述系统包括：(i)一个或多个处理器，以及(ii)一个或多个存储器，所述一个或多个存储器与所述一个或多个处理器联接，所述一个或多个存储器存储计算机可执行指令，所述计算机可执行指令当由所述一个或多个处理器执行时使所述系统执行包括以下步骤的操作：(a)独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的最大自体荧光校正，其中每个像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正从至少两个不同的取得的自体荧光光谱导出；以及(b)从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该像素的每个通道中的计算出的最大自体荧光校正。
17.根据权利要求16所述的系统，其中针对每个像素的每个通道的所述最大自体荧光校正通过以下方式计算：(i)通过将取得的至少两个自体荧光光谱中的每一个独立拟合到像素的测定光谱来针对每个通道计算至少两个估计的自体荧光校正；(ii)在每个通道中鉴定计算出的至少两个估计的自体荧光校正的最大自体荧光强度值。
18.根据权利要求17所述的系统，其中每个独立拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述至少两个取得的自体荧光光谱中的一个，以提供所述像素的归一化测定光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述至少两个取得的自体荧光光谱中的所述一个缩放计算出的最小值。
19.根据权利要求17所述的系统，其中所述至少两个取得的自体荧光光谱包括至少两个自体荧光低-高光谱对。
20.根据权利要求19所述的系统，其中每个独立拟合包括(i)将所述多通道图像的所述像素的所述测定光谱除以所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的一个的第一自体荧光低光谱；(ii)计算所述像素的所述归一化测定光谱的最小值；以及(iii)通过所述至少两个自体荧光低-高光谱对中的对应的一个的第一自体荧光高光谱来缩放计算出的最小值。
21.一种存储有指令的非暂时性计算机可读介质，所述指令用于去除用一种或多种荧光标记物染色的生物学样品的多通道图像的一个或多个通道中的自体荧光贡献，包括：基于至少两个取得的自体荧光光谱独立计算所述多通道图像的每个像素的每个通道中的自体荧光贡献，以及从所述多通道图像的每个测定像素光谱中减去针对该相应像素的每个通道中的计算出的自体荧光贡献，其中两个或更多个取得的自体荧光光谱从对应于包含一种或多种荧光标记物的生物学样品的训练多通道图像的未标记部分的测定信号导出。
CN202080013853.2A 2019-02-13 2020-02-10 用于计算多通道图像中的自体荧光贡献的系统和方法 Pending CN113424050A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962805239P 2019-02-13 2019-02-13
US62/805,239 2019-02-13
PCT/US2020/017436 WO2020167632A1 (en) 2019-02-13 2020-02-10 Systems and methods for computing the contributions of autofluorescence in multichannel images

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113424050A true CN113424050A (zh) 2021-09-21

Family

ID=69780331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080013853.2A Pending CN113424050A (zh) 2019-02-13 2020-02-10 用于计算多通道图像中的自体荧光贡献的系统和方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11941861B2 (zh)
EP (1) EP3924722A1 (zh)
JP (2) JP7227389B2 (zh)
CN (1) CN113424050A (zh)
WO (1) WO2020167632A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7420950B2 (ja) * 2019-12-17 2024-01-23 アプライド マテリアルズ インコーポレイテッド 多重蛍光インシトゥハイブリダイゼーション画像を獲得し、処理するためのシステム及び方法
CN113777053B (zh) * 2021-09-10 2023-04-14 南京诺源医疗器械有限公司 基于量子点荧光与多光谱相机的高通量检测方法及装置
WO2024009204A1 (en) * 2022-07-04 2024-01-11 Leica Instruments (Singapore) Pte. Ltd. Controller for a surgical microscope and method

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060118742A1 (en) * 2004-12-06 2006-06-08 Richard Levenson Systems and methods for in-vivo optical imaging and measurement
US20080294032A1 (en) * 2003-09-23 2008-11-27 Cambridge Research And Instrumentation, Inc. Spectral Imaging of Biological Samples
CN101932925A (zh) * 2007-11-30 2010-12-29 通用电气公司 用于从图像中除去自身荧光的方法和系统
CN103154741A (zh) * 2010-09-17 2013-06-12 国立大学法人东北大学 含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法
CN106455979A (zh) * 2013-12-31 2017-02-22 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于荧光源实时多通道成像的系统、方法和设备
CN106796145A (zh) * 2014-07-09 2017-05-31 加利珀生命科学股份有限公司 从生物学样本的纯光谱提取

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2010307140B2 (en) 2009-10-12 2014-05-15 Ventana Medical Systems, Inc. Multi-modality contrast and brightfield context rendering for enhanced pathology determination and multi-analyte detection in tissue
ES2639559T3 (es) 2012-12-28 2017-10-27 Ventana Medical Systems, Inc. Análisis de imágenes para el pronóstico de cáncer de mama
KR102068776B1 (ko) * 2014-09-29 2020-01-21 노바다크 테크놀러지즈 유엘씨 자가형광이 존재하는 생물학적 물질에서 타겟 형광체의 이미징
JP6404687B2 (ja) * 2014-11-21 2018-10-10 倉敷紡績株式会社 蛍光イメージング装置及び蛍光イメージング方法
JP6757320B2 (ja) 2014-12-29 2020-09-16 ベンタナ メディカル システムズ， インコーポレイテッド 多重化画像における血管解析
WO2016120442A1 (en) 2015-01-30 2016-08-04 Ventana Medical Systems, Inc. Foreground segmentation and nucleus ranking for scoring dual ish images
CA2970129C (en) 2015-01-31 2023-04-11 Ventana Medical Systems, Inc. Systems and methods for area-of-interest detection using slide thumbnail images
CN109073536B (zh) * 2016-05-06 2021-08-06 索尼公司 信息处理装置、信息处理方法、程序以及信息处理系统
CN110088804B (zh) 2016-12-22 2023-06-27 文塔纳医疗系统公司 基于原色和免疫组织化学图像的计算机评分
US11385179B2 (en) 2017-04-13 2022-07-12 Hoffmann-La Roche, Inc. Target molecule density determination in a fluorescence image

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080294032A1 (en) * 2003-09-23 2008-11-27 Cambridge Research And Instrumentation, Inc. Spectral Imaging of Biological Samples
US20060118742A1 (en) * 2004-12-06 2006-06-08 Richard Levenson Systems and methods for in-vivo optical imaging and measurement
CN101932925A (zh) * 2007-11-30 2010-12-29 通用电气公司 用于从图像中除去自身荧光的方法和系统
CN103154741A (zh) * 2010-09-17 2013-06-12 国立大学法人东北大学 含有抗体作为成分的医药品的有效性的判定方法
CN106455979A (zh) * 2013-12-31 2017-02-22 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于荧光源实时多通道成像的系统、方法和设备
CN106796145A (zh) * 2014-07-09 2017-05-31 加利珀生命科学股份有限公司 从生物学样本的纯光谱提取

Also Published As

Publication number Publication date
JP7227389B2 (ja) 2023-02-21
JP2022520603A (ja) 2022-03-31
US20210397870A1 (en) 2021-12-23
US11941861B2 (en) 2024-03-26
JP2023053040A (ja) 2023-04-12
WO2020167632A1 (en) 2020-08-20
JP7418631B2 (ja) 2024-01-19
EP3924722A1 (en) 2021-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11922681B2 (en) Systems and methods for identifying cell clusters within images of stained biological samples
US11978200B2 (en) Image enhancement to enable improved nuclei detection and segmentation
JP7092503B2 (ja) 共発現解析のためのシステム及び方法
US12020493B2 (en) Systems for automated in situ hybridization analysis
JP7418631B2 (ja) マルチチャネル画像における自己蛍光の寄与を算出するシステムおよび方法
JP5631999B2 (ja) 蛍光画像を用いて明視野画像を生成するためのシステム及び方法
EP3721373A1 (en) Deep-learning systems and methods for joint cell and region classification in biological images
EP3251087A1 (en) Dot detection, color classification of dots and counting of color classified dots
US20230186659A1 (en) Machine learning models for cell localization and classification learned using repel coding
EP3794548B1 (en) Quantitation of signal in stain aggregates
US20240079116A1 (en) Automated segmentation of artifacts in histopathology images
JP7011067B2 (ja) 膜特徴に基づいて組織画像内で細胞を分類するためのシステム及び方法
JP2023537971A (ja) 多重免疫蛍光染色組織のデジタル画像における壊死領域の自動識別
US20240221360A1 (en) Machine-learning techniques for predicting phenotypes in duplex digital pathology images
WO2023043709A1 (en) Machine-learning techniques for predicting phenotypes in duplex digital pathology images

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination