CN113423388A - 生物利用度提高的纳米晶体的制备方法和用于抗癌治疗的这种纳米晶体制剂的配方 - Google Patents

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CN113423388A CN201980071943.4A CN201980071943A CN113423388A CN 113423388 A CN113423388 A CN 113423388A CN 201980071943 A CN201980071943 A CN 201980071943A CN 113423388 A CN113423388 A CN 113423388A
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Abstract

纳米晶体的制备方法基于粉末形式的结晶纳米颗粒的制备过程，其包括a)在有机溶剂中溶解含有质子化氮的喜树碱衍生物和姜黄素类化合物，形成自组装离子配合物，随后加入可注射的非离子型表面活性剂，b)将所得混合物在持续均化下转移到含水介质中，所述均化包括混合、摇晃和/或使用超声波，c)除去溶剂以获得粉末形式，d)在先前添加的冷冻保护剂作用下对产物冷冻干燥。用于通过根据本发明的方法制备纳米晶体的组合物由可注射的非离子型表面活性剂和自组装离子配合物组成，所述自组装离子配合物包含姜黄素类化合物和含有质子化氮的喜树碱衍生物及其类似物，其摩尔比为10：1至1：10。喜树碱类似物优选地包括喜树碱和高喜树碱。含有质子化氮的喜树碱衍生物优选地通过一种或多于一种官能团在其化学结构中包含质子化氮，所述官能团包括伯胺、仲胺、叔胺、环胺和/或其组合。为抗癌注射药物应用而制备的纳米晶体的使用，在于将3重量％粉末形式的纳米晶体溶解于基于含有5重量％葡萄糖的蒸馏水的液体介质中。

Description

生物利用度提高的纳米晶体的制备方法和用于抗癌治疗的这 种纳米晶体制剂的配方
技术领域
本发明描述了基于形成自组装纳米结构的离子配合物的纳米晶体的制备方法以及通过该方法制备的组合物。所述组合物和所获得的纳米晶体可以用于制备生物利用度提高的试剂，所述试剂尤其可以用于副作用减少的细胞抑制剂的制备和应用领域。
背景技术
喜树碱的类似物及其衍生物是用于各种肿瘤疾病的化学治疗的有效治疗剂。这些分子及其活性代谢物可以特异性地结合拓扑异构酶I-DNA复合物，从而防止单链断裂的重接并阻止DNA复制。姜黄素类化合物(姜黄素(CAS458-37-7)、脱甲氧基姜黄素(CAS 22608-11-3)和双去甲氧基姜黄素(CAS24939-16-0))是姜黄(Curcuma longa)提取物中发现的天然多酚，姜黄是一种尤其在亚洲国家广泛使用的药用植物。姜黄素类化合物显示出药理作用，例如抗炎、抗氧化和抗菌特性。此外，它们也被描述为具有抗癌作用。
然而，喜树碱及其衍生物用于癌症的化疗治疗可能会以胃疼、恶心、腹泻的形式对肿瘤患者造成副作用。另一种降低治疗效果的不良现象是肿瘤细胞对药物的耐受性的逐渐发展。
此外，在与其他药物结合时也可以发现的疏水性(极低的水溶性)显著降低了姜黄素类化合物在体内的生物学作用的可能性。对姜黄素类化合物治疗潜力的更广泛的生物利用度的另一个限制是WO 2010013224(EP 2349237)中所述的其快速代谢导致血浆蛋白结合率低。
专利CN102885800B(2014年8月6日发布)揭示，通过将伊立替康(喜树碱衍生物)与姜黄素类化合物结合可以抑制一些上述副作用。喜树碱和姜黄素类化合物以纳米晶体的形式结合也在专利申请CN104546728中进行了讨论，其描述了通过两亲性分子例如泊洛沙姆对纳米晶体的稳定化，以及其随后用于制备注射液的可能性。这考虑到了姜黄素类化合物快速代谢的趋势。然而，在此没有描述适用于注射的组合的具体实施。
因此，本发明旨在提供用于注射应用中直接使用的易于制造和稳定的组合物，其基于姜黄素类化合物和喜树碱衍生物，适合用作抗癌药物并对患者的胃肠道温和，即不会表现出上述副作用。
发明内容
通过根据本发明用于制备生物利用度提高的物质的纳米晶体的组合物及其制备方法，很大程度上消除了到目前为止用于治疗肿瘤疾病的上述生物活性物质的上述缺点和弊端。
根据本发明制备纳米晶体的方法的基础在于，粉末形式的纳米晶体颗粒的制备包括以下步骤：
a)在有机溶剂中溶解含有质子化氮的喜树碱衍生物和姜黄素类化合物，形成自组装离子配合物，然后加入非离子型可注射表面活性剂；
b)将所得混合物在持续均化下转移到含水介质中，所述均化包括混合、摇晃和/或使用超声波；
c)除去溶剂以获得粉末形式；
d)在先前添加的冷冻保护剂作用下对产物冷冻干燥。
步骤a)中使用的有机溶剂优选为二甲基亚砜(CAS 67-68-5)、碳酸亚丙酯(CAS108-32-7)、乙腈(CAS 75-05-8)、丙酮(CAS 67-64-1)、二甲基甲酰胺(CAS 68-12-2)、四氢呋喃(CAS 109-99-9)、甲基吡咯烷酮(CAS 872-50-4)、六甲基磷酰胺(CAS 680-31-9)、甲醇(CAS 67-56-1)、乙醇(CAS 64-17-5)、乙酸(CAS64-19-7)，或其组合。
步骤d)中使用的冷冻保护剂优选为乳糖(CAS 63-42-3)、甘露醇(CAS 69-65-8)、蔗糖(CAS 57-50-1)、海藻糖(CAS 99-20-7)、果糖(CAS 57-48-7)、葡萄糖(CAS 50-99-7)、海藻酸钠(CAS 9005-38-3)、明胶(CAS 9000-70-8)，或其组合。
根据本发明的方法制备的组合物的基础在于，所述组合物由非离子型可注射表面活性剂和自组装离子配合物组成，所述自组装离子配合物含有姜黄素类化合物和包含质子化氮的喜树碱衍生物及其类似物，其组分的摩尔比为10：1至1：10。
喜树碱类似物优选包括喜树碱(CAS 7689-03-4)和高喜树碱(CAS 186669-19-2)。所述质子化氮优选地以至少一种官能团的形式包含在喜树碱衍生物中，所述官能团包括伯胺、仲胺、叔胺、环胺和/或其组合。含有伯胺的喜树碱衍生物可以是以下的一种或多于一种物质：9-氨基喜树碱(CAS 91421-43-1)、依喜替康(CAS 171335-80-1)、德莫替康(CAS187852-63-7)、那美替康(CAS 372105-27-6)。优选地，含有仲胺的喜树碱衍生物是倍罗替康(CAS 256411-32-2)。含有叔胺的喜树碱衍生物可以是拓扑替康(CAS 123948-87-8)和/或利扑替康(lipotecan，CAS 1432176-87-8)。在结构中含有环胺的喜树碱衍生物可以是以下的一种或多于一种物质：伊立替康(CAS 100286-90-6)、勒托替康(CAS 149882-10-0)、阿非替康(CAS 215604-75-4)、希明替康(CAS 1247847-78-4)、依洛替康(CAS 220998-10-7)。
含氮喜树碱类似物衍生物优选地以与有机酸或无机酸的盐的形式存在于组合物中，所述有机酸或无机酸选自盐酸(CAS 7647-01-0)、硫酸(CAS 7664-93-9)、磷酸(CAS7664-38-2)、氢溴酸(CAS 10035-10-6)、高氯酸(CAS 7601-90-3)、甲磺酸(CAS 75-75-2)、乙酸(CAS 64-19-7)、马来酸(CAS 110-16-7)、酒石酸(CAS 526-83-0)、柠檬酸(CAS 77-92-9)，或其组合。
根据本发明的纳米晶体用于制备注射用抗癌药剂的用途的基础在于，粉末形式的纳米晶体溶解在含有5重量％葡萄糖的蒸馏水的液体介质中，其中纳米晶体与液体介质的重量比是0.01：99.99至3：97。
基于根据本发明的离子配合物，生产出具有治疗和抗炎作用以及更好的体内耐受性的可注射的纳米晶体自组装体系。将其与根据本发明的非离子组分结合，提供了用于在注射应用中直接使用或连续使用的组合物，其基于具有细胞抑制特性的纳米晶体并在宽pH范围内表现出增强的稳定性。
根据本发明的组合物的优点是窄粒径分布及其稳定性，以及疏水性姜黄素类化合物分子增加的水溶性，这显著提高了它们在注射应用中的使用和所谓的生物利用率——体内可能的作用。因此，它们在癌症治疗中的治疗效果得到提高。
基于根据本发明的组合物的纳米晶体可以制成粉末状，其对温度、压力或稳定助剂无特殊要求，从化疗药物商业化生产的角度看这是有利的，或者直接制成用于注射应用的液体物质。
附图说明
附图显示了根据本发明的组合物的化学结构和纳米晶体获得的性质：
图1-两亲性喜树碱类似物和疏水性姜黄素类化合物的化学结构；
图2-基于盐酸伊立替康与姜黄素的自组装离子配合物的荧光特性(在25℃下在二甲基甲酰胺中具有不同姜黄素浓度的伊立替康的激发(A)、发射(B)和同步(C)荧光光谱；(D)在25℃下显示伊立替康的荧光淬灭的斯特恩-沃尔默图；(E)(I0/I-1)与姜黄素类化合物浓度(摩尔/升)的对数关系图；
注意：I0和I代表伊立替康在缺少(I0)姜黄素类化合物和缺少(I)姜黄素类化合物时的荧光强度。(τ0)和(τ)分别是在没有姜黄素和有姜黄素的情况下伊立替康的荧光寿命；CI是伊立替康的浓度；CC是姜黄素类化合物的浓度；
图3-含有质子化氮的喜树碱类似物衍生物的化学结构；
图4-表示分散在蒸馏水中的纳米晶体的典型流体力学直径(A)和zeta电位(B)，以及其扫描电子显微镜图像(C)，其中测量尺度显示长度为200nm；基于拓扑替康(TCN)/姜黄素、倍罗替康(BCN)/姜黄素和依喜替康(ECN)/姜黄素的纳米晶体的相关喜树碱类似物衍生物的产量；
图5-在不同pH值的水(A)(在37.5℃、8小时后)中和在不同时间的磷酸盐缓冲液(B)(pH＝7.4，37.5℃)中，悬浮液中的纳米晶体性质的变化；
图6-粉末样品的XRD图谱：A-盐酸伊立替康，B-姜黄素，C-盐酸伊立替康和姜黄素的纯组分混合物，D-基于自组装离子配合物的纳米晶体-最终产物，E-在水中溶解并随后蒸发的纯冷冻保护剂甘露醇，F-在甲醇中溶解然后蒸发之后的盐酸伊立替康和姜黄素的纯组分；
图7至图13用于验证根据本发明的HT-29纳米剂型的可注射伊立替康-姜黄素盐酸盐(ICN)对由在小鼠(裸鼠)体内应用皮下移植物所产生的肿瘤的抗癌作用的过程：
图7是使用在裸鼠中应用的结直肠肿瘤移植物来测试抗肿瘤功效的实验示意图；
图8-注射PBS、I或ICN小鼠的肿瘤体积(PBS＝磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4；I＝仅盐酸伊立替康；ICN＝I与根据本发明的姜黄素的组合)；
图9-注射PBS、I或ICN后的肿瘤体积变化；
图10-注射PBS、I或ICN后的肿瘤质量变化；
图11-切除的肿瘤的图像；
图12-注射PBS、I或ICN后的实验动物的重量；
图13-实验动物的副作用强度(以腹泻的形式)；ICN组与I组之间的显著差异，ICN组与PBS组之间无差异。使用两因素方差分析对组之间观察到的差异的显著性进行分析(参数*p<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001)。
检测到的依赖关系的详细描述：
喜树碱类似物衍生物具有荧光性质。从图2A、2B和2C中可以看出，伊立替康(含氮的喜树碱衍生物)在波长385nm处表现出激发峰，在428nm处表现出发射峰。姜黄素的加入导致伊立替康的激发、发射和同步光谱淬灭(强度降低)。从利用斯特恩-沃尔默模型(图2D)分析的淬灭过程中的测量值获得的数据显示了荧光强度改变但其寿命不变，说明与姜黄素类化合物形成了摩尔比1：1的配合物(静态猝灭)(图2E)。对于喜树碱及其类似物的其他含质子化氮的衍生物，也可以观察到上述性质，其结构如图3所示。上述显示姜黄素类化合物和喜树碱及其类似物的含质子化氮的衍生物在特定的有机溶剂环境中形成离子型表面活性剂，这些离子表面活性剂通过分子间的相互作用(例如疏水作用和静电作用)进行自组织。
基于此发现，基于姜黄素类化合物(7.4mg)和另一种含质子化氮的喜树碱衍生物或其盐例如盐酸拓扑替康(4.6mg)、倍罗替康(4.3mg)或依喜替康(5.3mg)的纳米颗粒，也通过根据本发明的方法制备且结果类似。
结果表明，由上述离子配合物制备的纳米晶体的参数最好控制在流体力学直径为50nm至1000nm，其中悬浮液中的多分散性小于0.2或等于0.2。纳米晶体的zata电位根据环境的pH值和离子强度为-10mV至+60mV。姜黄素类化合物与含质子化氮的喜树碱衍生物及其类似物的摩尔比是10：1至1：10。
然而，仅基于离子配合物的纳米晶体的尺寸强烈依赖于周围环境的pH值和离子强度，这可能导致其不可控制的变化。因此，对上述组分中添加非离子型表面活性剂的情况进行了进一步的测试。非离子型表面活性剂(例如胆固醇、泊洛沙姆、聚氧乙烯蓖麻油和聚山梨醇酯)的加入，使纳米晶体由于空间粒子间作用力的影响而在宽的pH范围内达到稳定。尽管粒子的表面张力降低到几乎为零，但它们的尺寸只有轻微的变化。与仅基于离子配合物的纳米晶体相比，基于上述离子和非离子配合物的混合物的纳米晶体抗增溶性增加至少40％。
粉末样本的XRD图谱(图6)显示了在制备根据本发明的组合物的过程中形成的新晶体结构的产生。
纳米悬浮液可以通过在含有例如5重量％葡萄糖和0.96重量％氯化钠的可注射液体中混合纳米晶体来制备。
图7至图13中显示的值和依赖关系将直接在实施例11中进行描述和分析。
实施例
实施例1
基于伊立替康和姜黄素的纳米晶体的制备-结构见图1和图3。
在室温下将摩尔比为1：2的盐酸伊立替康(6.2mg)和姜黄素(7.4mg)溶解于0.5mL的二甲基亚砜中。随后，加入15重量％的泊洛沙姆105作为非离子型表面活性剂。将得到的混合物转移到含水介质中-加入30mL蒸馏水中并在室温下以500rpm搅拌5分钟。(除蒸馏水外，可将pH值最大为9的含水介质用于向含水介质的转移。)
对所得悬浮液进行透析以去除有机溶剂；使用了MWCO(截留分子量)为500D的膜。
针对蒸馏水透析3小时。在冷冻干燥之前，加入20重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。
获得的纳米晶体的尺寸大约是100nm(见图4A和4B)。纳米晶体具有+43mV的表面正电荷并显示出以0.107的多分散性表示的窄粒径分布。根据扫描电子显微镜(SEM)分析，上述纳米晶体颗粒形状接近球形且表面光滑(图4C)。图5显示当纳米颗粒暴露于不同pH或离子强度时所选择的特性(流体力学直径、多分散性和zeta电位)的变化。纳米颗粒的表面张力随着环境酸度(pH小于7)的增加而降低。在碱性环境(pH大于7)下监测纳米晶体的负Zeta电位值。另一方面，由于排斥性空间作用力的进一步影响，纳米晶体的尺寸和多分散性的广度有轻微的变化。此外，在37.5℃下纳米颗粒在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中8小时后仍保持稳定，其粒径和多分散性略有增加。其表面张力低于+10mV。
用高效液相色谱法测定了两种生物活性物质的浓度。颗粒中检测到的生物活性物质的比例为70重量％。纳米颗粒中的喜树碱衍生物和姜黄素类化合物的比例与反应开始时的浓度比例基本相同。
离子配合物和非离子型表面活性剂的结合导致纳米晶体具有细胞抑制特性，其在宽的pH范围内显示出提高的稳定性。
实施例2
伊立替康和姜黄素的纳米晶体(ICN)的制备-结构见图1和图3。
在室温下将摩尔比为1：2的盐酸伊立替康(6.2mg)和姜黄素(7.4mg)溶解于0.4mL的二甲基亚砜(DMSO)中，以形成自组装离子配合物，然后向其中加入3mg胆固醇作为非离子型表面活性剂。然后将由此获得的有机溶液加入30mL蒸馏水中，并在与实施例1相同的条件下搅拌。对获得的悬浮液进行透析以去除有机溶剂；使用了MWCO 300D的膜。针对蒸馏水透析2小时。在冷冻干燥之前，在化合物中加入1重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。以这种方法，获得粉末形式的纳米晶体，将其溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水中制备纳米悬浮液。
离子配合物和非离子型表面活性剂的组合导致纳米晶体具有细胞抑制特性，其在宽的pH范围内显示出提高的稳定性。
实施例3
基于拓扑替康和姜黄素的纳米晶体(TCN)的制备-结构见图3。
在室温下将摩尔比为1：1的盐酸拓扑替康(4.6mg)和姜黄素(4.0mg)溶解于0.3mL的二甲基甲酰胺(DMF)中，以形成自组装离子配合物，然后向其中加入1.3mg聚山梨醇酯80作为非离子型表面活性剂。然后将由此获得的有机溶液加入15mL蒸馏水中，并在与实施例1相同的条件下搅拌，然后对获得的悬浮液进行透析以去除有机溶剂-MWCO 500D的膜。针对蒸馏水透析2小时。在冷冻干燥之前，在化合物中加入1重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。获得纳米晶体粉末，将其溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水中制备应用的纳米悬浮液。
在本章的最后一节中，将列出和总结所获得的产物以及下面实施例4至实施例10的产物的参数。
实施例4
基于倍罗替康和姜黄素的纳米晶体(BCN)的制备-结构见图3
在室温下将摩尔比为1：1的盐酸倍罗替康(4.3mg)和姜黄素(3.5mg)溶解于0.3mL的二甲基亚砜(DMSO)中，以形成自组装离子配合物，然后向其中加入3.4mg非离子型表面活性剂聚氧乙基蓖麻油。然后将由此获得的有机溶液加入15mL蒸馏水中，并在如实施例1中那样搅拌，并将所得悬浮液再次用MWCO500D的膜进行透析。针对蒸馏水透析1小时。在冷冻干燥之前，在化合物中加入1重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。获得粉末，随后将其溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水中制备纳米悬浮液。
实施例5
基于依喜替康和姜黄素的纳米晶体(ECN)的制备-结构见图3。
在室温下将摩尔比为1：2的甲磺酸依喜替康(5.3mg)和姜黄素(7.0mg)溶解于0.4mLDMF中，以形成自组装离子配合物，然后向其中加入1.8mg非离子型泊洛沙姆105表面活性剂。然后将由此获得的有机溶液加入20mL蒸馏水中，并在如实施例1中那样搅拌，将所得悬浮液用MWCO 300D的膜进行透析。针对蒸馏水透析3小时。在冷冻干燥之前，在化合物中加入1重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。以这种方式，获得了纳米晶体粉末，将其溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水中以制备纳米悬浮液。
实施例6
基于利扑替康和姜黄素的纳米晶体(LiCN)的制备-结构见图3
在室温下将摩尔比为1：1的盐酸利扑替康(8.8mg)和姜黄素(3.5mg)溶解于0.3mL的DMF中以形成自组装离子配合物，然后向其中加入1.8mg非离子型表面活性剂泊洛沙姆105。然后将由此获得的有机溶液加入30mL蒸馏水中，并在如实施例1中那样搅拌，所得悬浮液用MWCO 500D的膜进行透析。针对蒸馏水透析2小时。在冷冻干燥之前，在化合物中加入1重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。以这种方式获得粉末，在使用前将该粉末溶解于含5重量％葡萄糖和0.96重量％氯化钠的蒸馏水中以制备纳米悬浮液。
实施例7
基于阿非替康和姜黄素的纳米晶体(ACN)的制备-结构见图3。
在室温下将摩尔比为1：2的盐酸阿非替康(9.0mg)和姜黄素(7.5mg)溶解于0.5mL的DMSO中，以形成自组装离子配合物，然后向其中加入2.5mg非离子型表面活性剂泊洛沙姆105。然后将由此获得的有机溶液加入40mL蒸馏水中，并在如实施例1中那样搅拌，并将所得悬浮液使用MWCO 1000D的膜进行透析以去除有机溶剂。针对蒸馏水透析2小时。在冷冻干燥之前，在化合物中加入1重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。因此获得粉末，随后通过将其溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水中以制备纳米悬浮液，重量比为0.01：99.99(冻干物：介质)。
实施例8
基于勒托替康和姜黄素的纳米晶体(LuCN)的制备-结构见图3
在室温下将摩尔比为1：1的二盐酸勒托替康(6.0mg)和姜黄素(3.5mg)溶解于0.3mL的DMSO中，以形成自组装离子配合物，然后向其中加入1.4mg非离子型泊洛沙姆105表面活性剂。然后将由此获得的有机溶液加入15mL蒸馏水中，并在如在先前实施例中那样搅拌，将所得悬浮液用MWCO 300D的膜进行透析，该过程针对蒸馏水进行2小时。在冷冻干燥之前，在化合物中加入1重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。在这一过程中获得粉末，随后通过将其溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水中以制备用于应用的纳米悬浮液，重量比为2：98(冻干物：介质)。
实施例9
基于希明替康和姜黄素的纳米晶体(SCN)的制备-结构见图3
在室温下将摩尔比为1：2的盐酸希明替康(6.2mg)和姜黄素(7.4mg)溶解于0.4mL的DMF中，以形成自组装离子配合物，然后向其中加入2mg泊洛沙姆105作为非离子型表面活性剂。然后将由此获得的有机溶液加入30mL蒸馏水中，并在如先前实施例中那样搅拌，将所得悬浮液用MWCO 300D的膜进行透析。针对蒸馏水透析3小时。在冷冻干燥之前，在化合物中加入1重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。在此过程中获得粉末，随后通过将其溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水中以制备用于应用的纳米悬浮液，重量比为3：97(冻干物：介质)。
实施例10
基于依洛替康和姜黄素的纳米晶体(EmCN)的制备-结构见图3
在室温下将摩尔比为1：2的盐酸依洛替康(5.5mg)和姜黄素(7.4mg)溶解于0.4mL的DMSO中，以形成自组装离子配合物，然后向其中加入2mg泊洛沙姆105。然后将由此获得的有机溶液加入30mL蒸馏水中，并在如先前实施例中那样搅拌，将所得悬浮液用MWCO 300D的膜进行透析。针对蒸馏水透析3小时。在冷冻干燥之前，在化合物中加入1重量％的甘露醇作为冷冻保护剂。在此过程中获得粉末，通过将其溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水中以制备应用纳米悬浮液，重量比为2：98(冻干物：介质)。
实施例3至实施例10中描述的组合物表现出下列性质：
对于如实施例3至实施例10所示的基于姜黄素类化合物和喜树碱及其类似物的其他含质子化氮的衍生物的纳米颗粒，例如盐酸拓扑替康(TCN)、盐酸倍罗替康(BCN)、甲磺酸依喜替康(ECN)、盐酸利扑替康(LiCN)、盐酸阿非替康(ACN)、二盐酸勒托替康(LuCN)、盐酸希明替康(SCN)或盐酸依洛替康(EmCN)，发现他们在尺寸、尺寸分布、表面电荷和形貌方面与基于伊立替康的颗粒具有相似的性质。
通过高效液相色谱法(HPLC)证实制备的纳米颗粒中生物活性成分(ICN、TCN、BCN和ECN)的浓度-见实施例1至实施例5。从图4D中可以看出，颗粒中检测到的生物活性物质的比例是70重量％。对于喜树碱和姜黄素类化合物的衍生物，它们在纳米颗粒中的比例与反应开始前的初始比例基本相同。
在不同环境条件下还观察到基于伊立替康的纳米颗粒的所选特性的变化。图5显示了纳米颗粒在不同pH值和离子强度下的行为。纳米颗粒的表面张力随着环境酸度(pH小于7)的增加而降低。在碱性环境(pH大于7)下记录纳米颗粒的负Zeta电位值。相反，由于由非离子配合物的存在引起的排斥性空间作用力的进一步影响，纳米颗粒的尺寸和多分散性的广度只有轻微的变化。此外，在37.5℃下纳米颗粒在磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中8小时后仍保持稳定，其粒径和多分散性略有增加。
实施例11
组合物的制备及治疗效果的实验验证-见图7至图13。
在室温下将6.2mg的盐酸伊立替康和3.7mg的姜黄素溶解于0.4mL二甲基亚砜(DMSO)中，并加入15重量％的泊洛沙姆105。将获得的有机溶液加入20mL蒸馏水中，并在室温下搅拌(500rpm)4分钟。将获得的悬浮液转移到MWCO(截留分子量)＝300D的透析管中，针对去离子水进行透析以去除有机溶剂。加入甘露醇作为冷冻保护剂。通过冷冻干燥获得伊立替康-姜黄素粉末。将该粉末溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水中，获得用于注射应用的抗癌乳剂。
使用HT-29系的肠细胞在小鼠(裸鼠)皮下移植这些细胞产生的肿瘤上，于体内研究了这种可注射制剂的抗癌作用。实验策略如图7所示。
方法及监测：
一旦平均肿瘤体积达到约100mm3，将小鼠随机分成三组，每组4只至5只，并每隔一天静脉注射1)PBS，2)I，3)ICN(相当于单独使用伊立替康的量-27.5mg/kg)，共19天。
治疗过程：每3天测量体重和肿瘤体积。根据公式TV＝长度×宽度2/2计算肿瘤体积。停药5天后，处死小鼠，随后(实验开始第25天)切除肿瘤，称重并拍照。
监测不良副作用：腹泻根据以下等级报告：粪便0-正常或无，1-略湿而软，2-中度柔软且不成形，有中度肛周污染，3-强烈的，水状的，有严重肛周污染。
治疗效果的评估：
与PBS组的小鼠相比，在两个治疗组中，平均肿瘤体积得到有效调节，并在第9天(第一次施用后约1周-图8)与未治疗组有显著差异。在第15天(第一次施用后约2周-图9)治疗组中产生的肿瘤体积减小。与PBS组(盲法)相比，治疗组的肿瘤重量也显示出显著差异-图10。图11显示了切除的肿瘤的照片。
在整个实验过程中，两个治疗组之间没有统计差异。结果证明，根据本发明的ICN的组合纳米制剂的功效与盐酸伊立替康本身的抗癌效果相同，并且肿瘤退化效果是由根据本发明的ICN中的伊立替康而不是姜黄素诱导的。这可以归因于两种物质的半抑制浓度的显著差异。在所用伊立替康的治疗水平/浓度下，通常认为姜黄素是生物安全的。
此外，在整个实验过程中，没有在任何小鼠中观察到显著的体重减轻，这表明根据本发明的ICN纳米制剂在肿瘤治疗中使用的剂量有甚至很小的副作用-图12。
不良副作用的评估：
从图13中可以看出，仅用伊立替康治疗的小鼠在第一次施用后第10天腹泻明显延迟(p<0.01)，在整个实验中PBS组(盲法-无治疗)和ICN组(使用根据本发明的组合物治疗的小鼠)没有明显的腹泻。这组小鼠腹泻的减少表明，根据本发明的纳米制剂中姜黄素与伊立替康的存在可以减少肠道负荷，从而保护肠道，增加患者的舒适度。这可以归因于姜黄素分子的治疗效果，或者药物配方从单独的伊立替康变为根据本发明的其与姜黄素的结合。
工业实用性
根据本发明的用于制备生物利用度提高的药物的纳米晶体的组合物、制备纳米晶体的方法和纳米晶体在注射应用中的用途，将优选地在对生物利用度和耐受性要求增加的药物生产领域得到使用。它将被具体用于细胞抑制剂-抗癌药的制备领域。

Claims (13)

1.一种制备生物利用度提高的纳米晶体的方法，其特征在于，粉末形式的制备过程包括以下步骤：
a)在有机溶剂中溶解含有质子化氮的喜树碱衍生物和姜黄素类化合物，形成自组装离子配合物，然后加入可注射的非离子型表面活性剂；
b)将所得混合物在持续均化下转移到含水介质中，所述均化包括混合、摇晃和/或使用超声波；
c)除去溶剂以获得粉末形式；
d)预先添加冷冻保护剂并对产物冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的制备纳米晶体的方法，其特征在于，步骤a)中使用的有机溶剂是二甲基亚砜、碳酸亚丙酯、乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲基吡咯烷酮、六甲基磷酰胺、甲醇、乙醇、乙酸，或其组合。
3.根据权利要求1所述的制备纳米晶体的方法，其特征在于，步骤d)中使用的冷冻保护剂是乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、果糖、葡萄糖、海藻酸钠、明胶，或其组合。
4.一种用于制备生物利用度提高的纳米晶体的组合物和根据权利要求1所述的方法由这种组合物制备的纳米晶体，其特征在于，所述组合物包含可注射的非离子型表面活性剂和自组装离子配合物，所述自组装离子配合物基于姜黄素类化合物和含有质子化氮的喜树碱衍生物及其类似物，其摩尔比为10：1至1：10。
5.根据权利要求4所述的用于制备纳米晶体的组合物，其特征在于，喜树碱衍生物含有质子化氮，并包括喜树碱和高喜树碱。
6.根据权利要求4和5所述的用于制备纳米晶体的组合物，其特征在于，所述含有质子化氮的喜树碱类似物的化学结构中含有至少一种包含伯胺、仲胺、叔胺、环胺和/或其组合的官能团。
7.根据权利要求4和6所述的用于制备纳米晶体的组合物，其特征在于，化学结构中包含伯胺的喜树碱衍生物，包括选自9-氨基喜树碱、依喜替康、德莫替康、那美替康中的一种或多于一种物质。
8.根据权利要求4和6所述的用于制备纳米晶体的组合物，其特征在于，化学结构中含有仲胺的喜树碱衍生物包括倍罗替康。
9.根据权利要求4和6所述的用于制备纳米晶体的组合物，其特征在于，化学结构中含有叔胺的喜树碱衍生物包括拓扑替康和/或利扑替康。
10.根据权利要求4和6所述的用于制备纳米晶体的组合物，其特征在于，所述在其化学结构中含有环胺的喜树碱衍生物包括选自伊立替康、勒托替康、阿非替康、希明替康、依洛替康中的一种或多于一种化合物。
11.根据权利要求4所述的用于制备纳米晶体的组合物，其特征在于，所述含氮的喜树碱类似物的衍生物以有机酸或无机酸的盐的形式存在，所述有机酸或无机酸选自盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、高氯酸、甲磺酸、乙酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸，或其组合。
12.根据权利要求4所述的用于制备纳米晶体的组合物，其特征在于，所述可注射的非离子型表面活性剂基于胆固醇、泊洛沙姆、聚氧乙烯蓖麻油、聚山梨醇酯或其组合。
13.根据权利要求1制备的纳米晶体在抗癌注射药物应用中的用途，其特征在于，将粉末形式的纳米晶体溶解于含5重量％葡萄糖的蒸馏水的液体介质中，其中纳米晶体与液体介质的重量比为0.01：99.99至3：97。
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