CN113403358B - 一种alg1-cdg、pmm2-cdg生物标记物的合成方法及其应用 - Google Patents
一种alg1-cdg、pmm2-cdg生物标记物的合成方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种ALG1‑CDG、PMM2‑CDG生物标记物的合成方法及其应用，本发明涉及ALG1‑CDG、PMM2‑CDG生物标记物(唾液酸‑半乳糖‑两个N‑乙酰氨基葡萄糖：Sia‑Gal‑Gn2)体外化学酶合成方法以及将其连接到载体蛋白上提高其免疫原性的制备方法。本发明进一步涉及所述抗体在对ALG1‑CDG、PMM2‑CDG两种先天性糖激化缺陷(CDG)临床检测中的用途，与传统基因组学测序、糖组学分析以及高通量筛选等临床检测方法相比，通过抗体与血清中生物标记物的特异性结合可以更快，更便捷，更节约的做出诊断。
Description
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及到一种ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法及其应用。
背景技术
蛋白质N-糖基化是蛋白质翻译后修饰的主要方式，这一过程发生在内质网中。其中，与蛋白相连的寡糖链由多种糖基转移酶共同作用下合成，合成的寡糖链经过寡糖转移酶(OST)转移到新合成的多肽链上形成糖肽，糖肽被转运到高尔基体作进一步的修饰形成功能型糖蛋白。当编码参与糖基化过程的糖基转移酶的基因发生缺陷，就会导致正常的糖基转移酶活性降低或者无法被合成，进一步导致功能型的糖蛋白合成的量不足或无法合成，这一变化会影响个体的正常生命活动，甚至导致个体的死亡。这一由编码糖基转移酶的基因缺陷而引起的遗传性疾病被称为先天性糖基化缺陷(CDG)。ALG1(asparagine-linkedglycosylation 1)、PMM2(Phosphomannomutase 2)基因分别编码了β1,4甘露糖基转移酶、磷酸甘露糖变位酶2，它们参与内质网蛋白质N-糖基化，其中磷酸甘露糖变位酶2参与甘露糖基转移酶的供体(鸟苷二磷酸甘露糖(GDP-mannose))的合成，甘露糖基转移酶参与内质网寡糖链的合成。ALG1-CDG、PMM2-CDG分别为由编码上述两种酶的基因突变而引起的先天性糖基化缺陷(CDG)，均属于先天性糖基化缺陷家族。先天性糖基化缺陷的确诊患者数量在逐年上升，目前对于这类遗传性疾病仍没有很好的治疗方法。除此之外，由于该遗传病不具有典型的临床症状，因此难以被诊断，这也导致许多患者没有被正确的诊断和报道。
2015年，ErikA.Eklund等人通过分析病人的血液样本时，从ALG1-CDG、PMM2-CDG病人血清中的转铁蛋白上发现由两个N-乙酰氨基葡萄糖，一个半乳糖，一个唾液酸(Sia-Gal-Gn2：Neu5Ac-Gal-GlcNAc2)构成的四糖，并将这一具有标志性的寡糖链作为ALG1-CDG、PMM2-CDG的生物标记物。这一发现对研究ALG1-CDG、PMM2-CDG的生理生化特性以及后续的临床诊断奠定了基础。目前，最常用的诊断方法主要是基于基因组学的基因组测序和全外显子测序。随着糖组学的发展，基于糖组学的等电聚焦、质谱等方法也被应用到糖基化缺陷的检测中。
目前，尽管对于先天性糖基化缺陷的诊断方法取得了一定的进步，但是现存的这些方法仍存在着许多的不足。首先，这些方法对于样品处理的要求较高，这导致检测耗时较长，甚至出现漏诊，同时也产生了较高的费用；其次，这些方法无法确定具体的治病基因，最终的确诊还需做进一步的检测。因此，研制出一种高效，准确，低花费的诊断方法极为重要。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法，包括，将全乙酰化的壳二糖1在无水条件下溶于二氯甲烷与甲醇混合溶液中，加入甲醇钠，反应生成中间体2；将中间体2溶于饱和碳酸氢氨溶液中，反应得到中间体3；将中间体3溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-芴甲氧羰酰甘氨酸五氟苯酯和吡啶，反应生成中间体4；将中间体4溶于缓冲溶液中，加入供体二磷酸尿甘半乳糖，在β1，4半乳糖转移酶的催化下生成中间体5；向反应生成中间体5的反应混合溶液中加入供体胞苷5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸，在α2，6唾液酸转移酶的催化下生成带有Fmoc-Gly连接的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物6，即得所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物。
作为本发明所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法的一种优选方案，其中：所述反应生成中间体2，其中，无水二氯甲烷与甲醇体积比为4：1，甲醇钠的含量为0.4％，室温下反应，反应时间为1～2h。
作为本发明所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法的一种优选方案，其中：所述反应得到中间体3，其中，反应温度为40℃，反应时间为20～26h。
作为本发明所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法的一种优选方案，其中：所述反应生成中间体4，其中，反应温度为4℃，反应时间为24～28h，所述中间体3与Fmoc-Gly-OPfp的摩尔比为1：1.2，所述中间体3和吡啶的摩尔比分别为和1：1.1。
作为本发明所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法的一种优选方案，其中：所述生成中间体5，其中，反应温度为37℃，反应时间为12h，反应缓冲液为100mM Tris-HCl pH 7.5，其中包含10mM的氯化镁，所述中间体4与供体二磷酸尿甘半乳糖摩尔比为1：10，中间体4与β1，4半乳糖转移酶摩尔比为50：1。
作为本发明所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法的一种优选方案，其中：所述生成生物标记物6，其中，反应温度为37℃，反应时间为0.5h，反应缓冲液为100mMTris-HCl pH 7.5，镁离子不影响α2，6唾液酸转移酶活性，所述中间体5与供体胞苷5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸摩尔比为1：12，中间体5与SiaT摩尔比为50：1。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种抗体。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种抗体，所述抗体，包括权利要求1～6中任一所述的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物与载体蛋白KLH连接形成糖缀合物进行免疫学试验产生。
作为本发明所述抗体的一种优选方案，其中：所述抗体的制备方法，包括，
步骤一、将Sia-Gal-Gn2GlyFmoc溶于含有10％哌啶的DMF溶液中，在室温条件下，反应1h，脱掉Fmoc基团；
步骤二、减压旋蒸除掉步骤一反应混合物的溶剂，将混合物溶于0.1M pH8.0磷酸盐缓冲液/DMF(1：4，v/v)混合溶剂中，加入双琥珀酰亚胺戊二酸酯DSG，其与Sia-Gal-Gn2GlyFmoc的摩尔比为15：1，在室温下反应3～6h得到Sia-Gal-Gn2Gly-DSG；
步骤三、通过减压旋蒸除去步骤二的反应混合物溶剂，向反应容器内加入0.1M pH8.0磷酸盐缓冲液溶解混合物，紧接着加入与Sia-Gal-Gn2Gly-DSG摩尔比为1：30的载体蛋白KLH，在室温条件下缓慢搅拌反应2.5～3d得到糖缀合物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH；
步骤四、将步骤三反应混合物经过葡聚糖凝胶柱脱盐纯化得到ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物与载体蛋白连接形成的糖缀合物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH，产进行免疫学试验，产生特异性识别生物标记物的抗体。
如权利要求7或8中所述抗体在制备体外诊断ALG1-CDG试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供所述抗体在在制备体外诊断PMM2-CDG、PMM2-CDG试剂盒中的应用。
本发明有益效果：
(1)本发明首次提供了ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的体外合成方法，以及将其连接到载体蛋白上形成缀合物的制备方法，本方法反应原料简单易得，操作简单，反应条件温和，其在ALG1-CDG、PMM2-CDG的理化研究中具有重要价值。
(2)本发明的抗体，能够特异性识别并结合ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物，本发明的抗体具有重大的临床应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明显示了通过ELISA的方法检测到抗体滴度的水平，其中，1为KLH，2为Sia-Gal-Gn2Gly，3为Sia-Gal-Gn2Gly+KLH，4为Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH，5为Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH+氢氧化铝佐剂，6为Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH+弗氏佐剂。
图2为本发明显示了通过ELISA的方法检测到抗体IgG的滴度显著高于IgM。
图3为本发明显示了通过ELISA的方法检测到抗体IgG对ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物具有高度的特异性，其中，1为Sia-Gal-Gn2，2为Sia-Gal-Gn，3为Gal-Gn2，4为Gn2，5为Gal-Gn。
图4本发明所采用的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成路线和合成方法图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明中原料均为普通市售产品。
本发明所采用的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成路线和合成方法如图4所示：
第一步，脱保护：
将全乙酰化的壳二糖1溶于无水二氯甲烷和甲醇的混合溶液中，加入甲醇钠溶液，反应生成中间体2。
其中，无水二氯甲烷与甲醇体积比为4：1，甲醇钠1％，反应温度为室温，反应应在无水条件下进行，反应时间为1h。
本步反应操作如下：称取一定量的全乙酰化的壳二糖1于干净的圆底烧瓶中，加入转子，塞上瓶塞，用真空泵抽出瓶内空气，插入氮气球，此步骤循环三次彻底置换瓶内空气，确保瓶内为无水环境，随后用注射器加入溶剂，溶解壳二糖1，最后加入0.4％的甲醇钠，室温条件下反应1h，反应过程经薄层色谱法(TLC)检测，反应完成后用酸性树脂调节pH到7.0左右，除去树脂，减压除掉溶剂得到中间体2此步骤不需要纯化。
第二步，合成糖胺：
将第一步反应混合物除去溶剂，向反应容器中加入饱和碳酸氢钠溶液，反应得到中间体3。
其中，反应温度为40℃，反应时间为20～26h。
本步反应操作如下：向瓶内加入饱和碳酸氢铵容液，于40℃水浴条件下加热反应，此步反应过程中应插气球，防止碳酸氢氨分解产生气体导致瓶内气压过高出现危险；反应进程经TLC检测，反应完成后，通过减压旋蒸法除去溶剂和碳酸氢铵，所得产物不需要纯化。
第三步，合成Gn2-Gly-Fmoc：
将第二部反应混合物溶于DMF中，加入吡啶和Fmoc-Gly-OPfp，反应得到中间体4.
其中，反应温度为4℃，反应时间为24～28h；中间体3与吡啶和Fmoc-Gly-OPfp的摩尔比分别为1：1.1和1：1.2。
本步反应操作如下：加入DMF溶解第二步产物，将吡啶和Fmoc-Gly-OPfp分别溶于DMF中，按摩尔比加到反应容器中，于4℃条件下反应，反应进程通过TLC检测，反应完成后减压除去溶剂，产物经过硅胶柱层析纯化，得到中间体4。
第四步，添加半乳糖合成Gal-Gn2-Gly-Fmoc：
将一定量的中间体4溶于去离子水中，取部分于反应容器中，加入Tris-HCl缓冲液，一定量的镁离子，GalT，UDP-Gal，反应得到中间体5。
其中，反应温度为37℃，反应时间为12h，Tris-HCl缓冲液Tris为100mM，pH为7.5，镁离子为10mM；中间体4与UDP-Gal摩尔比为1：10，与GalT摩尔比为50：1。
本步反应操作如下：取一定量的底物中间体4于烧瓶中，加入缓冲液，按摩尔比加入供体UDP-Gal以及GalT，反应在37℃缓慢搅拌的条件下进行，反应进程通过TLC检测，反应完成后，不做处理进入下一步反应。
第五步，添加唾液酸合成Sia-Gal-Gn2-Gly-Fmoc：
向上一步的反应混合溶液中加入供体CMP-NANA和SiaT反应得到Fmoc-Gly连接的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物(Sia-Gal-Gn2GlyFmoc)。
其中，这一步的反应温度为37℃，反应时间为0.5h；中间体5与供体CMP-NANA的摩尔比为1：12，与SiaT摩尔比为50：1。
本步反应操作如下：直接向上一步反应的混合溶液中按照摩尔比加入SiaT和CMP-NANA，反应在37℃缓慢搅拌的条件下进行，反应进程通过TLC进行检测；反应完成后向反应混合物中加入等体积的冷乙醇终止反应，离心去除白色蛋白沉淀，减压除去溶剂得到终产物Sia-Gal-Gn2GlyFmoc。
由于ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的分子量与其他用于免疫反应的抗原相比较小，无法确保单纯的标记物能够激发强烈的免疫反应。因此，本发明为了提高其免疫原性以获得更强烈的免疫反应，将上述合成的标记物连接到载体蛋白上制备成糖蛋白缀合物；具体制备方法如下：
第一步，脱掉Fmoc保护基：
将Sia-Gal-Gn2GlyFmoc溶于DMF中，加入一定量的哌啶，反应脱掉Fmoc保护基。
其中，反应时间为1h，反应温度为室温，10％哌啶。
本步反应操作如下：先将Sia-Gal-Gn2GlyFmoc溶于DMF中，接着加入10％哌啶，在室温条件下搅拌反应1h；反应进程通过TLC检测，反应完成后经过减压旋蒸除去溶剂，得到的产物不需要纯化。
第二步，连接双琥珀酰亚胺戊二酸酯(DSG)：
将上一步的反应混合物溶于磷酸盐缓冲液与DMF组成的混合溶剂中，加入DSG反应得到Sia-Gal-Gn2GlyDSG。
其中，将(0.1M，pH 8.0)磷酸盐缓冲液与DMF体积比为1：4组成混合溶液，反应时间为3～6h，室温下反应，其中Sia-Gal-Gn2Gly与DSG摩尔比为15：1。
本步反应主要操作如下：将脱掉Fmoc保护基的反应混合物溶于磷酸盐缓冲液与DMF的混合溶剂中，加入DSG，在室温条件下反应3～6h，反应进程经过TLC检测，反应完成后，减压旋蒸得到产物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG，所得到的产物不需要纯化。
第三步，连接载体蛋白KLH(血蓝蛋白)、BSA(牛血清白蛋白)：
将上一步反应混合物溶于磷酸盐缓冲液，加入载体蛋白，反应得到生物标记物与蛋白形成的糖缀合物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH/BSA。
其中本步反应需要在搅拌温和的条件下进行，反应温度为室温，反应时间为2.5～3d，Sia-Gal-Gn2GlyDSG与载体蛋白的摩尔比为30：1。
本步反应主要操作如下：将上一步反应混合物溶于(0.1M，pH 8.0)磷酸盐缓冲液，按摩尔比加入载体蛋白，缓慢搅拌反应2.5～3d；反应完成经葡聚糖凝胶柱脱盐纯化得到Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH/BSA。
抗ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物特异性抗体的制备：本发明提到的抗ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的抗体可以利用本领域已知的各种方法来制备，例如通过免疫学实验获得抗体。
本发明提到的抗体可以特异性识别并结合ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物。
检测方法和试剂盒：
本发明的抗体能够特异性结合ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物，从而可用于检测ALG1-CDG、PMM2-CDG在样品中是否存在或其水平。
因此，本发明提供了一种用作试剂盒的方案，其中包括本发明的抗体。本发明的抗体带有可检测的标记。所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别本发明的抗体。优选的，所述第二抗体包括可检测的标记。
在本发明中，所述可检测标记可以是可通过荧光、光学、免疫学、光谱、化学等手段检测的任何物质。特别优选的此类标记物能够适用于免疫学检测(例如，荧光免疫法测定、酶联免疫法测定、化学发光免疫法测定法等)。这类标记物是本领域熟知的，包括但不限于，荧光染料(例如，荧光素、藻红蛋白(PE)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、罗丹明)、发光物质(例如化学发光物质吖啶脂类化合物)、酶(例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)。本发明中涵盖的标记物可通过本领域已知的方法检测。例如，荧光标记物可以用光检测器检测，以检测发射的光。酶标记物一般通过给酶提供底物，通过检测酶与底物反应得到的产物来检测。在某些实施方案中，可通过不同长度的连接物，将上述可检测的标记连接到本发明的抗体，以降低其潜在的空间位阻。
另一方面，本发明提供了检测样本中ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的方法，其包括本发明抗体的使用步骤。在一个优选实验方案中，本发明的抗体带有可以检测的标记物。在另一个优选的方案中，使用带有可以检测标记的试剂检测本发明的抗体。所述检测方法可用于诊断的目的，或者非诊断的目的(例如，某些细胞或蛋白样品，而非患者)。
实施例1：化学酶法合成Sia-Gal-Gn2GlyFmoc
在氮气条件下，向25mL圆底烧瓶加入全乙酰壳二糖1(36μmol)，将其溶于4mL无水二氯甲烷/甲醇混合溶液中，体积比为4：1，加入20μL甲醇钠，室温反应1h，用TLC检测反应进程。反应完成后，用酸性树脂调节pH至7.0左右，滤去树脂，减压除去溶剂得到中间体2，透明晶体。
向圆底烧瓶中加入2ml去离子水，2g碳酸氢铵，40℃水浴反应24h，用TLC检测反应进程。反应结束后，减压除去溶剂和碳酸氢铵，反复三次，得到中间体3，透明晶体。
向烧瓶中加入2mLDMF溶剂，20mgFmoc-Gly-OPfp，加入吡啶-DMF溶液(140μL/mL，23μL，39μmol)4℃反应24h，用TLC检测反应进程。反应结束后，减压得到淡黄色固体，通过硅胶柱层析纯化得到中间体4，收率70％。
将中间体4溶于去离子水中形成14mM的溶液，取50μL于5mL玻璃瓶中，加入Tris-HCl缓冲液(375μL，100mM，pH 7.5)，氯化镁(5μL，1M)，UDP-Gal(30μL，0.1M)，GalT(40μL，16mg/ml)。于37℃条件下振荡反应12h，用TLC检测反应进程，反应结束后不做任何处理，进入下一步反应。
向上一步的反应混合物中加入CMP-NANA(30μL，0.1M)，SiaT(40μL，24mg/ml)。在37℃条件下振荡反应0.5h，用TLC检测反应进程，反应结束后，加入等体积冷乙醇终止反应，离心(9000g，5min)除去蛋白沉淀，减压旋蒸除去溶剂得到Sia-Gal-Gn2GlyFmoc，产物不需要纯化。
Fmoc-Gly连接的ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物6，表征数据：1HNMR(600MHz，D2O)δ＝7.74～7.79(d，2H)，7.55～7.60(t，2H)，7.32～7.38(t，2H)，7.24～7.31(t，2H)，4.85～4.89(d，J＝10.20Hz，1H)，4.46～4.49(d，J＝6.62Hz，1H)，4.26～4.31(d，J＝7.82Hz，1H)，4.17～4.23(d，J＝13.20Hz，1H)，3.91～3.97(m，1H)，3.35～3.87(m，50H)，1.85～1.94(d，9H)；MS(MALDI TOF)m/z:Calcd For C50H69N5O26，[M-H]-1154.42，Found 1154.44。
实施例2：将标记物连接到载体蛋白(KLH/BSA)上制成糖缀合物
将1mg(1.4μmol)Sia-Gal-Gn2GlyFmoc溶于400μL DMF中，加入40μL哌啶，在室温条件下反应1h，脱去Fmoc保护基。反应进程通过TLC检测，反应结束后减压旋蒸除去溶剂，再用乙酸乙酯洗涤三次得到甘氨酸连接的生物标记物(Sia-Gal-Gn2Gly)，产物不需纯化。
将Sia-Gal-Gn2Gly溶于320μL DMF中，加入80μL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.0)，3.5mg(21μmol)DSG，室温条件下缓慢搅拌反应4h，用TLC检测反应进程，反应完成后减压旋蒸除去溶剂，反应混合物用乙酸乙酯洗三次除去残留的DSG，得到Sia-Gal-Gn2Gly-DSG，产物不需要纯化。
将上一步反应混合物溶于300μL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.0)，80μL去离子水，2mg载体蛋白，在室温条件下反应2.5d，得到Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH/BSA，产物经葡聚糖凝胶柱脱盐纯化得到缀合物。
实施例3：鼠源抗ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物抗体的产生
在本实施例中，通过常规的动物免疫学实验方法，获得抗ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的抗体；利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测抗体的滴度、类型以及抗体对ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的特异性。
3.1免疫学实验
免疫学实验所选用的实验动物为C57BL/6小鼠5-6周龄(获得自上海斯莱克实验动物有限责任公司)，实验包括空白组、实验组和对照组共计6组，每组五只小鼠，采用皮下注射的方式进行抗原免疫接种。
初次免疫空白组1每只小鼠接种载体蛋白KLH(100μL，5mg/mL)，对照组2每只接种Sia-Gal-Gn2Gly(100μL，0.12mg/mL)，
实验组3每只接种生物标记物与KLH的混合溶液(100μL，含有12μg生物标记物和0.5mgKLH)，
实验组4每只接种Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH(100μL，含有12μgSia-Gal-Gn2)，
实验组5每只接种Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH与弗氏佐剂的混合物(100μL，含有12μgSia-Gal-Gn2，初次免疫接种为弗氏完全佐剂，后续免疫刺激用弗氏不完全佐剂，均按体积比1：1充分混合至完全乳化)，
实验组6每只接种Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-KLH与氢氧化铝佐剂的混合物(100μL，含有12μgSia-Gal-Gn2，与氢氧化铝佐剂按体积比1：1充分混匀)。
免疫接种分别于第7天、第14天、第28天、第35天以相同剂量进行免疫加强，第42天采集血清利用ELISA方法进行检测。
3.2 ELISA法检测血清中抗体滴度
将缀合物(Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-BSA)溶于的碳酸氢盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中，得到标记物浓度为2μg/mL的溶液，100μL每孔包被于聚苯乙烯96孔板(solarbio，3590)中，在37℃条件下封闭1h，吸干孔内溶液，用PBST(含有0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液pH 7.4)清洗三次，加入100μL 10％BSA-PBST溶液室温封闭1h，吸干每孔溶液，再用PBST清洗三次，所有组的血清从1：300到1：656100稀释，每孔100μL，37℃反应2h，吸干每孔的液体，用PBST清洗三次；将AP(碱性磷酸酶)标记的山羊抗鼠Ig(G+M)(Thermo Fisher Scientific，T2192)按1：1000稀释，每孔100μL室温反应1h，用PBST清洗三次。最后加入对硝基苯基磷酸酯(PNPP)液体底物(Sigam，P7998)，每孔100μL，室温下避光反应30min。用酶标仪读取405nm吸收值。用血清的稀释倍数于对应的光密度(OD)值绘制对数曲线，并获得最佳拟合线。使用线性的方程式来计算OD达到0.1时的稀释值，并且获得抗体效价作为稀释值的倒数，每组测得三次平行结果。
结果如图1所示，将Sia-Gal-Gn2连接到载体蛋白(KLH)上能够诱导产生高滴度的抗体。同时在混合使用佐剂时，能进一步提高抗体滴度。
3.3 ELISA法检测血清中抗体类型
将缀合物(Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-BSA)溶于的碳酸氢盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中，得到标记物浓度为2μg/mL的溶液，100μL每孔包被于聚苯乙烯96孔板(solarbio，3590)中，于37℃封闭1h，吸干孔内溶液，用PBST(含有0.05％吐温-20的pH 7.4磷酸盐缓冲液)清洗三次，加入100μL 10％BSA-PBST溶液室温封闭1h，吸干每孔溶液，再用PBST清洗三次，将缀合物与氢氧化铝佐剂混合免疫组的血清从1：300到1：656100稀释，每孔100μL，37℃反应2h，吸干每孔的液体，用PBST清洗三次；AP(碱性磷酸酶)标记的山羊抗鼠Ig(G+M)、IgG、IgM(Thermo Fisher Scientific，T2192，G-21060，Abcam，ab98672)按1：1000稀释，每孔100μL室温反应1h，用PBST清洗三次。对硝基苯基磷酸酯(PNPP)液体底物(Sigma，P7998)，每孔100μL，室温下避光反应30min。用酶标仪读取405nm吸收值。用标准曲线计算滴度，每个样品测三次。
结果如图2所示，由缀合物与弗氏佐剂混合刺激产生的抗体，其中IgG的滴度显著高于IgM，表明，缀合物与弗氏佐剂混合产生了具有长期记忆性的免疫反应。
3.4 ELISA法检测血清中抗体IgG对ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的特异性
为了检测抗体IgG的特异性，通过上述缀合物的合成制备方法获得缀合物Sia-Gal-Gn2Gly-DSG-BSA、Sia-Gal-GnGly-DSG-BSA、Gal-Gn2Gly-DSG-BSA、Gn2Gly-DSG-BSA、Gal-GnGly-DSG-BSA，将缀合物分别溶于的碳酸氢盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中，得到糖浓度为2μg/mL的溶液，100μL每孔包被于聚苯乙烯96孔板(solarbio，3590)中，于37℃封闭1h，吸干孔内溶液，用PBST(含有0.05％吐温-20的pH 7.4磷酸盐缓冲液)清洗三次，加入100μL10％BSA-PBST溶液室温封闭1h，吸干每孔溶液，再用PBST清洗三次，将缀合物与氢氧化铝佐剂混合免疫组的血清从1：300到1：656100稀释，每孔100μL，37℃反应2h，吸干每孔的液体，用PBST清洗三次；
AP(碱性磷酸酶)标记的山羊抗鼠IgG(Thermo Fisher Scientific，G-21060)按1：1000稀释，每孔100μL室温反应1h，用PBST清洗三次。
对硝基苯基磷酸酯(PNPP)液体底物(Sigma，P7998)，每孔100μL，室温下避光反应30min。用酶标仪读取405nm吸收值。用标准曲线计算滴度，每个样品测三次。
结果如图3所示，缀合物与弗氏佐剂混合产生的抗体，其IgG能够特异性识别ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物。
由此结果可以看出，抗ALG1-CDG、PMM2-CDG抗体具有作为ALG1-CDG、PMM2-CDG体外临床诊断试剂的价值。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (1)
1.一种ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物的合成方法，其特征在于：包括，
将全乙酰化的壳二糖1在无水条件下溶于二氯甲烷与甲醇混合溶液中，加入甲醇钠，反应生成中间体2；其中，无水二氯甲烷与甲醇体积比为4：1，甲醇钠的含量为0.4%，室温下反应，反应时间为1~2 h;
将中间体2溶于饱和碳酸氢氨溶液中，反应得到中间体3，其中，反应温度为40℃，反应时间为20~26 h；
将中间体3溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N-芴甲氧羰酰甘氨酸五氟苯酯和吡啶，反应生成中间体4，其中，反应温度为4℃，反应时间为24~28 h，所述中间体3与N-芴甲氧羰酰甘氨酸五氟苯酯的摩尔比为1：1.2，所述中间体3和吡啶的摩尔比为1：1.1；
将中间体4溶于缓冲溶液中，加入供体二磷酸尿苷半乳糖，在β1，4半乳糖转移酶的催化下生成中间体5，其中，反应温度为37 ℃，反应时间为12 h，反应缓冲液为100 mM Tris-HCl、 pH 7.5，其中包含10 mM的氯化镁，所述中间体4与供体二磷酸尿苷半乳糖摩尔比为1：10，中间体4与β1，4半乳糖转移酶摩尔比为50：1；
向反应生成中间体5的反应混合溶液中加入供体胞苷5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸，在α2，6唾液酸转移酶的催化下生成带有Fmoc-Gly连接的ALG1-CDG 、PMM2-CDG生物标记物6，即得所述ALG1-CDG、PMM2-CDG生物标记物；
其中，反应温度为37℃，反应时间为0.5 h，反应混合溶液为100 mM Tris-HCl 、pH7.5，镁离子不影响α2，6唾液酸转移酶活性；所述中间体5与供体胞苷5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸摩尔比为1：12，中间体5与α2，6唾液酸转移酶摩尔比为50：1。
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| A novel N-tetrasaccharide in patients with congenital disorders of glycosylation, including asparagine-linked glycosylation protein 1, phosphomannomutase 2, and mannose phosphate isomerase deficiencies[J].;Zhang W et al.;《Clinical chemistry》;20160101;第62卷(第1期);摘要 * |
| ALG1-CDG 生物标记物疫苗的制备及免疫活性研究;贾继祥;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20220115;全文 * |
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| Jia J X et al..Chemo-enzymatic synthesis of the ALG1-CDG biomarker and evaluation of its immunogenicity.《Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters》.2020,第30卷(第24期),第127614页. * |
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