CN113402635B - 一种扩张床逆流色谱分离纯化肝素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肝素分离纯化技术领域，具体涉及一种扩张床逆流色谱分离纯化肝素的方法；以阴离子交换树脂作为固体吸附介质，将其加入扩张床逆流色谱分离柱中，肝素溶液上样至扩张床逆流色谱进行吸附、洗脱、醇沉、离心、洗涤得纯化后的肝素。本发明将固定床柱层析中普遍使用的固体分离介质加入逆流色谱的分离柱中，基于逆流色谱流体动力学平衡原理，在分离柱中形成吸附介质扩张分散的状态，构建出扩张床逆流色谱，可作为一种新型的色谱分离方法用于分离极性多糖类肝素药物。该方法处理样品量高、吸附介质利用率显著提升，在极性多糖类生物活性大分子的分离纯化中具有良好的应用前景。

Description

一种扩张床逆流色谱分离纯化肝素的方法

技术领域

本发明涉及肝素分离纯化技术领域，具体涉及一种扩张床逆流色谱分离纯化 肝素的方法。

背景技术

肝素是一种结构复杂的糖胺聚糖类药物，由α-D-氨基葡萄糖(N-硫酸化，O- 硫酸化或N-乙酰化)和O-硫酸化糖醛酸(α-L-艾杜糖醛酸或β-D葡萄糖醛酸)交替 连接形成聚合物，具有延长血凝时间的作用。临床上主要用于抗凝血和防治血栓 栓塞性疾病，是防治深静脉血栓、肺血栓、弥漫性血管内凝血及某些血栓栓塞性 并发症的首选药物。

肠粘膜是生产肠衣的废弃物，肝素含量很高，从肠粘膜中提取肝素是当前市 场肝素的主要来源。肝素提取方法趋于成熟，现阶段粗品肝素的主流提取方法主 要分为盐解-树脂吸附法和酶解树脂吸附法两大类：(1)盐解-离子交换法，操作路 线：新鲜猪小肠黏膜→碱性盐解→过滤→树脂吸附滤液→洗脱→洗脱液醇沉→干 燥→粗品肝素；(2)酶解-离子交换法，操作路线：新鲜猪小肠黏膜→酶解→过滤 →树脂吸附滤液→洗脱→洗脱液醇沉→干燥→粗品肝素；但是这两种方法均是小 规模生产的通用工艺，操作简单，对设备和工业要求不高，但存在提取率不高、 资源浪费的缺点。同时由于工艺原因，当前从猪小肠中提取的肝素产品效价较低， 大大降低了其原有价值。因此，改进肝素的提取工艺对肝素的扩大生产、提高经 济效益具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种扩张床逆流色谱分离纯化肝素的方法，提高树脂 对肝素的吸附率，并减少分离时间，获取产品效价高的肝素产品。

本发明提供的技术方案如下：

一种扩张床逆流色谱分离纯化肝素的方法，以阴离子交换树脂作为固体吸附 介质，将其加入扩张床逆流色谱分离柱中，肝素溶液上样至扩张床逆流色谱进行 吸附、洗脱、醇沉、离心、洗涤得纯化后的肝素。

进一步地，所述阴离子交换树脂为D204、D208、D254和D301中的一种。

进一步地，所述扩张床逆流色谱分离纯化肝素过程中，上样和洗脱流速方向 均为由上向下，转速方向为顺时针。

进一步地，转速为200-500rpm。

进一步地，所述阴离子交换树脂的加入量和扩张床逆流色谱分离柱的有效柱 体积的比例为(2.0-5.0)g：30mL，肝素溶液的浓度为50mg/mL，上样流速为 0.5-10mL/min，上样量和扩张床逆流色谱分离柱的有效柱体积的比例为(50-200) mg：30mL。

进一步地，吸附过程中的流动相为pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液；

所述洗脱具体包括：使用2-4mol/L的NaCl作为洗脱液，洗脱流速为 1-5mL/min。

进一步地，所述上样为循环上样。

进一步地，循环上样次数为4次。

本发明还提供上述扩张床逆流色谱分离纯化肝素的方法所得到的肝素。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明将固定床柱层析中普遍使用的固体分离介质加入逆流色谱的分离柱 中，基于逆流色谱流体动力学平衡原理，在分离柱中形成吸附介质扩张分散的状 态，构建出扩张床逆流色谱，可作为一种新型的色谱分离方法用于分离极性多糖 类肝素药物。该方法处理样品量高、吸附介质利用率显著提升，在极性多糖类生 物活性大分子的分离纯化中具有良好的应用前景。

本发明基于逆流色谱操作过程中分离柱内的液体所受到的螺旋力场、重力场 与离心力场综合评价，并结合固体树脂在分离柱中保留状态，确定出扩张床逆流 色谱操作的进样和洗脱流速方向为由上向下，设备转速方向为顺时针，分别确定 转速为200-500rpm范围内合适的进样流速，使树脂在分离柱中呈稳定的扩张分 散状态。研究了不同肝素浓度、不同洗脱液流速下扩张床逆流色谱的穿透行为和 洗脱曲线。结果表明，在D204树脂加入量为5.0g，柱体积为30mL，上样浓度 为50mg/mL，流速1.5mL/min，转速300rpm下，动态吸附容量为275mg/g， 随转速的提高，动态吸附容量逐渐下降。流速对穿透点时间的影响十分显著，在 0.5mL/min流速时，于176min到达穿透点，随流速的增加到10mL/min，穿透 点时间缩短到9.5min，动态吸附容量随流速的增加而增加。与固定床柱层析对 比，扩张床逆流色谱在1mL/min流速下的吸附率最高可达到91.66％，扩张床逆 流色谱法有效提高树脂对肝素的吸附率，并减少分离时间。

同时分析表明柱层析分离纯化肝素效价为205.51±7.90IU/mg，扩张床逆流 色谱分离纯化后肝素效价为216.09±11.89IU/mg，均达到药典规定180IU/mg的 标准。并以高效液相色谱(HPLC-ELSD)对肝素纯度进行检测，结果表明，层析纯 化后的肝素是分子量不同的混合物，与柱层析分离纯化肝素相比，扩张床逆流色 谱分离纯化的肝素分子量更小，Fxa/FIIa值更高，适合作为外源性抗凝剂。

附图说明

图1为本发明实施例2扩张床逆流色谱结构图(a)以及实验流程图(b)；

图2为本发明实施例2扩张床逆流色谱实验装置。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明 的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本 发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和 下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述 值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小 范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的 常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但 是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材 料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关 的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式 做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书 得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅 是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的 用语，即意指包含但不限于。

本发明以下实施例中，所使用的树脂D204，D254，D208，D301购买自上 海一基实业有限公司，物理参数见表1；

表1

实施例1：扩张床逆流色谱吸附介质的筛选

(1)树脂的预处理与再生

四种树脂各置于500mL烧杯中，加入约5倍体积的蒸馏水浸泡24h，期间 多次搅拌，沉降后倾倒上层溶液，用抽滤漏斗抽干，加入无水乙醇浸泡2h，时 刻搅拌，抽干并冲洗至无乙醇味，然后将树脂进行酸碱酸处理，先将树脂浸泡于 2mol/L的HCl中2h，期间不断搅拌，抽滤抽干，用蒸馏水冲洗至中性，将树 脂浸泡于2mol/L的NaOH中2h，期间不断搅拌，抽滤抽干，用蒸馏水冲洗， 检测抽滤液至中性，然后将树脂浸泡于2mol/L的HCl中2h，抽滤抽干，用蒸 馏水冲洗，检测抽滤液至中性，之后用蒸馏水浸泡树脂备用。

树脂使用一段时间后，吸附的杂质接近饱和状态，吸附性能下降，要进行再 生处理，使之恢复原来的组成和性能。树脂的再生用2moL/L的HCl溶液浸泡2 h，然后用水冲洗至中性。用2mol/L的NaOH浸泡2h，再次用2moL/L的HCl 溶液浸泡2h，然后用水冲洗至中性即可再次使用。

(2)采用浓硫酸氧化法来测定肝素浓度；

(3)吸附动力学曲线测定，吸附动力学曲线拟合采用准一级动力学、准二 级动力学模型、内扩散动力学模型来研究树脂对肝素吸附的微观过程，吸附等温 线拟合采用Langmuir模型和Freundlich模型拟合等温吸附行为；

取四种树脂各2.0g，放入50mL锥形瓶，加入10mL 20mg/mL肝素并放入 150rpm摇床于25℃震荡，在0，0.5，1，2，4，6，8h后分别取样检测溶液浓 度。以时间为横坐标，以肝素吸附量为纵坐标，绘制吸附动力学曲线。

结果显示，四种树脂的准二级动力学相关系数R²比准一级动力学相关系数 R²更接近1，并且拟合出来的q_e与实验所测的值也更贴近。由此说明准二级动 力学更符合树脂对肝素的吸附过程，内扩散动力学模型所拟合的直线，表明颗粒 内扩散对吸附也起到一定作用。刚开始吸附时，吸附速度很宽，吸附量增加也十 分迅速，这是因为树脂中存有大量的吸附位点。随着时间的增加，吸附剂上的吸 附位点越来越少，直至吸附反应达到吸附平衡状态。其中D204树脂吸附肝素到 达饱和吸附的时间较短且吸附量较高，2h后吸附量达到87.34％，可作为吸附介 质的备选树脂。

分别配制NaCl浓度为0、1、2、3、4mol/L的50mg/mL的肝素溶液，取四 种预处理后的树脂各2.0g，放入50mL锥形瓶，加入不同盐浓度的50mg/mL 肝素10mL并放入150rpm摇床于25℃充分震荡，在0，2，4，6，8h后分别取 样检测溶液浓度。以时间为横坐标，以肝素吸附量为纵坐标，绘制不同盐浓度下 的吸附动力学曲线。

结果显示：D204树脂在前1h左右的时间吸附量增加较快，在1h左右吸附 量接近饱和吸附量，几乎不再变化，且随着盐浓度的增加，树脂对肝素的吸附量 逐渐降低，在盐浓度为2mol/L，3mol/L和4mol/L的条件下，肝素几乎不被吸 附。测定8h内在不同盐浓度下肝素的吸附动力学，经过准一级动力学，准二级 动力学以及内扩散动力学来进行吸附研究，并进行线性拟合，结果显示，在0-4 mol/L的NaCl浓度时，D204树脂的准二级动力学相关系数R²比准一级动力学 相关系数R²更接近1，并且拟合出来的q_e与实验所测的值也更贴近。由此说明 准二级动力学更符合树脂对肝素的吸附过程。4mol/L的NaCl浓度时，内扩散动 力学模型得相关系数R²＝0.9334，且截距C接近原点，此时颗粒内扩散对吸附起 到主要作用。

D208树脂在前2h左右的时间吸附量增加十分迅速，在2-6h吸附量增加十 分缓慢，在8h左右吸附量接近饱和吸附量，几乎不再变化，且随着盐浓度的增 加，树脂对肝素的吸附量逐渐降低十分明显，在盐浓度为4mol/L时，肝素几乎 不被吸附。测定8h内在不同盐浓度下肝素的吸附动力学，经过准一级动力学， 准二级动力学以及内扩散动力学来进行吸附研究，并进行线性拟合；在0-4mol/L 的NaCl浓度时，D204树脂的准二级动力学相关系数R²比准一级动力学相关系 数R²更接近1，并且拟合出来的q_e与实验所测的值也更贴近,由此说明准二级动 力学更符合树脂对肝素的吸附过程。内扩散动力学模型所拟合的直线，在低浓度 下且拟合程度较高，表明颗粒内扩散，对吸附也起到一定的作用；

D254树脂吸附量随着时间逐渐增加，但吸附过程十分缓慢，6h左右达到饱 和吸附量，且随着盐浓度的增加，树脂对肝素的吸附量逐渐降低十分明显，在盐 浓度为3mol/L和4mol/L时，肝素几乎不被吸附。测定8h内在不同盐浓度下肝 素的吸附动力学，经过准一级动力学，准二级动力学以及内扩散动力学来进行吸 附研究，并进行线性拟合；在低盐浓度时，D254树脂的准一级动力学相关系数 R²比准二级动力学相关系数R²更接近1，且拟合出来的q_e与实验所测的值接近， 说明准一级动力学更符合树脂对肝素的吸附过程，高盐浓度时，准二级动力学更 符合树脂的吸附形式。内扩散动力学模型所拟合的直线，在低浓度下且拟合程度 较高，表明颗粒内扩散，对吸附也起到一定的作用。

D301树脂吸附量随着时间逐渐增加，8h左右达到饱和吸附量，且随着盐浓 度的增加，树脂对肝素的吸附量逐渐降低十分明显，在盐浓度为2mol/L以上时， 肝素几乎不被吸附。测定8h内在不同盐浓度下肝素的吸附动力学，经过准一级 动力学，准二级动力学以及内扩散动力学来进行吸附研究，并进行线性拟合； D301树脂的准二级动力学相关系数R²比准一级动力学相关系数R²更接近1，并 且拟合出来的q_e与实验所测的值也更贴近。由此说明准二级动力学更符合树脂 对肝素的吸附过程，内扩散动力学模型所拟合的直线，且拟合程度较高，表明颗 粒内扩散在有盐存在的条件下，对吸附也起到较为重要的作用。

(4)静态吸附和解吸实验：配制50mmol/L Tris-HCl缓冲液，所有的吸附 和解吸附实验都是在50mmol/L，pH8.5的Tris-HCl缓冲体系中完成的。已经预 处理好的树脂先用缓冲液平衡，然后用漏斗抽干。分别称取4种树脂2.0g，放 入50mL锥形瓶种，再加入50mg/mL肝素溶液10mL。放入恒温振荡器，在150 rpm，25℃恒温充分吸附8h，吸取上层液体，用浓硫酸氧化法测定肝素浓度， 并根据试验前后肝素浓度差计算吸附量以及吸附率：

其中C₀为吸附前肝素初始浓度，mg/mL；C₁为吸附后肝素平衡浓度mg/mL；V₁为肝素溶液体积，mL；m为树脂的质量，g。

将静态吸附后的4种树脂用蒸馏水冲洗除去杂质，抽滤除干水分，收集。转 移到4支干净的锥形瓶中，向内加入10mL、2mol/L NaCl，使其在25℃条件下 150rpm恒温充分解吸附8h，吸取上清液，测定溶液中肝素浓度，根据试验前 后肝素浓度差以及树脂的质量来计算从而计算解吸量以及解吸率：

其中C₂为解吸后肝素溶液浓度，mg/mL；

(5)将肝素溶液分别稀释成不同梯度浓度(5、10、15、20、25、30、40、 50mg/mL)，分别取10mL稀释液，分别加入预处理后的树脂各2.0g，放入150 rpm摇床于25℃等温吸附8h，检测肝素溶液浓度。之后分别于35℃和45℃再 次测定D204树脂不同温度下的吸附等温线。以平衡时溶液中肝素浓度为横坐标， 吸附平衡时树脂的吸附量为纵坐标，绘制吸附等温线。

实验结果显示：

4种树脂D204，D208，D254，D301吸附量分别为89.66±0.99mg/g，83.98±1.61 mg/g，66.96±1.08mg/g，55.31±0.57mg/g。其中D204树脂对肝素的吸附性能最 好，吸附率达到95.52％，D301树脂吸附率最低，为56.78％。

解吸能力D204，D208，D254，D301分别为84.43±1.52mg/g，71.99±1.67mg/g，58.46±1.76mg/g，43.56±1.04mg/g，四种树脂对肝素的解吸率均达到79％以上， 其中D204树脂的解吸效果最好，解吸率达到92.68％，而D301树脂的解吸率最 低，仅能解吸79.29％；

随着肝素的初始浓度增加，四种树脂对肝素的吸附量均是迅速增加，这是因 为孔结构优越的比表面积，使树脂与肝素可以快速吸附。当肝素初始浓度达到一 定浓度时，吸附容量几乎不再增加，由于活性位点被肝素占据，吸附速率逐渐变 慢，最终趋于吸附平衡。通过Langmuir吸附等温模型拟合计算出D204，D208， D254，D301在25℃时对肝素的最大模拟单分子层吸附量分别为110.21mg/g， 88.06mg/g，69.90mg/g，58.90mg/g。D204，D208，D254，D301的Langmuir 吸附模型相关系数(R²＝0.9901、0.9466、0.9045、0.9623)均高于Freundlich模型的 相关系数(R²＝0.9335、0.7633、0.7723、0.8351)。说明树脂对肝素更契合Langmuir 吸附，属于单分子层吸附。当肝素初始浓度达到一定浓度，树脂表面的活性吸附 位点就决定的了树脂的吸附容量，由于树脂表面的活性吸附位点的数量是恒定的， 所以随着肝素浓度的增加，树脂的吸附容量没有相应的增加。四种树脂的R_L值 均在0-1之间，说明反应均有利于树脂对肝素的吸附。

随着温度从25℃至45℃不断升高，D204树脂对肝素的吸附量逐渐从110.21 mg/g增加到192.55mg/g，k_L随着温度的升高而逐渐降低，升温有利于树脂对肝 素的吸附。

通过以上结果，得出结论比较四种吸附树脂的吸附性能，筛选出D204树脂 作为扩张床逆流色谱的固体吸附介质。

实施例2扩张床逆流色谱吸附肝素性能研究

将D204树脂加入逆流色谱分离柱中构建扩张床逆流色谱，对其中的吸附介 质分散状态进行研究，考察相关操作参数。

(1)扩张床逆流色谱的构建

扩张床逆流色谱结构示意图如图1所示，实验装置如图2所示。按溶液，恒 流泵，扩张床逆流色谱，部分收集器的顺序连好装置，往柱中加入预处理后的树 脂，使树脂沉降在管内，逆时针将软管缠绕到柱上，将各部分接好密封，排出管 中气泡，并用扎带固定，另一侧配上相同的配重，通过恒流泵来控制流速，设定 流速方向为由上向下，通过电机控制转速。液体在恒流泵的作用下进入扩张床逆 流色谱，通过设置不同流速、转速，在分离柱中对肝素进行吸附，再从出样口流 出，并用部分收集器对溶液进行收集。

(2)扩张床逆流色谱流速方向的确定

往有效体积为100mL(Φ＝5mm)的软管中加入预处理后的D204树脂2.0g， 使树脂沉降在软管，排出管中气泡，用扎带固定，连接且密封好衔接处，设定流 速为1mL/min，转速设为顺时针，按照表2实验条件，运行1h，观察固定相在 柱中的状态。

表2实验条件

结果显示：通过在1mL/min的流速条件下设置不同转速以及流速方向，在 1h后观察树脂状态。对比实验组

a、b、c，在流速方向为下进上出时，树脂在柱中逐渐向上移动，随着转速 的提高，向上移动的更远，说明转速提供的离心力和流速提供的推力均使树脂向 上(出口端)移动，此时并不能使色谱柱介质在柱中保持分散的状态；实验组d、e、 f将流速方向改为由下向上，随着转速的增大，色谱柱介质向上(入口端)移动， 此时可调整流速与转速使色谱柱介质在色谱柱中呈稳定分散状态；但在400rpm 时，转速提供的离心力仍旧略大于流速提供的推力，使树脂在管中很缓慢的移动， 在流速为1mL/min时，还需要降低转速使色谱柱介质在色谱柱中保持平衡。后 续在实验中确定流速方向由上往下。

(3)扩张床逆流色谱转速范围的确定

确定流速方向为由上向下后，为了更进一步确定能使树脂中保留的流速、转 速范围，设置不同流速、转速进行实验观察，其中树脂为2.0g D204树脂，有效 柱体积为30mL，在200rpm-500rpm之间逐步改变转速，在1mL/min-10mL/min 之间逐步改变流速，运行2h后，观察树脂状态，确定流速与转速范围。

结果显示：在200rpm的转速和1mL/min的流速下，2h后树脂可以较为分 散的保留在柱中，随着流速增加到2、3mL/min时，流速的推力逐渐增大，树脂 逐渐从入口端向出口端移动，树脂能都较为分散的保留在柱中，而到4、5mL/min 时，由于流速的推力大于转速提供的离心力，树脂已经完全堆积在出口端，无法 呈现扩张状态。在300rpm的转速和1mL/min的流速下，2h后树脂堆积在入口 端，大部分可以较为分散的保留在柱中，随着流速从2mL/min增加到4mL/min 时，树脂均较均匀分散在柱中，而当5mL/min时，由于流速的推力，树脂已完全堆积在出口端，无法成为分散状态。在400rpm的转速和2mL/min的流速下， 2h后树脂堆积于入口端，增大流速至3-8mL/min，树脂可较均匀分散在柱中。 在500rpm的转速和8mL/min的流速下，2h后树脂堆积于入口端，流速增加到 10mL/min时，树脂可较均匀分散于柱中；

汇总不同转速下的流速范围于表3中。最终确定在200rpm时，流速在1-3 mL/min，可使树脂在柱中稳定呈扩散状态；在300rpm时，流速在1-4mL/min， 可使树脂在柱中稳定呈扩散状态；在400rpm时，流速在3-8mL/min，可使树脂 在柱中稳定呈扩散状态；在500rpm时，流速在10mL/min，可使树脂在柱中稳 定呈扩散状态；500rpm时，流速仍可以继续增加，但考虑到高流速对软管、接 口的承压能力，后续实验没有继续增大流速。

表3不同转速条件下的流速范围

(4)扩张床逆流色谱穿透曲线研究

①转速对扩张床逆流色谱穿透曲线的影响：将5.0g D204树脂装入30mL 软管中，排净管中气泡，连接好各接口，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)平衡2h后， 配制50mg/mL的肝素水溶液上样，设定流速为1.5mL/min，转速为300、400、 500rpm，流出液在出口端用分部收集器收集，用浓硫酸氧化法进行肝素浓度的 检测，根据出口端肝素浓度与进样浓度比值，绘制穿透曲线；

结果显示：设定流速为1.5mL/min，转速为300、400、500rpm，得到穿透 曲线，数据汇总于表4；在相同的流速条件下，随着转速的提升，穿透点提前， 这是因为在运行过程中，随着转速的增加，柱中成扩散状态的树脂逐渐向入口端 移动，减少了树脂与溶液的接触时间，树脂吸附率降低，更早的达到穿透点。动 态吸附容量也因此随转速从300rpm提高到500rpm而从275mg/g降低至125 mg/g。但由于此时树脂在柱中仍是不完全的分散状态，仅考虑转速无法有效实现 扩张床状态。要实现稳定的扩张床分离效果，需要在流速、转速配合，保持树脂 在柱中是分散运动的前提进行研究。

表4不同转速下的动态吸附容量

②流速对扩张床逆流色谱穿透曲线的影响：将5.0g D204树脂装入30mL 软管中，排净管中气泡，连接好各接口，按照设定流速为1、2、5mL/min，配 制50mg/mL的肝素水溶液上样，流出液在出口端用分部收集器收集，用浓硫酸 氧化法进行肝素浓度的检测，根据出口端肝素浓度与进样浓度比值，绘制穿透曲 线；为使树脂在柱中呈扩散状态，按照表3参数设定转速流速转速；

结果显示：动态吸附容量汇总于表5。从表5中可以看出，随着流速从0.5 mL/min提高到10mL/min的高流速，到达穿透点的时间降低十分明显，从176min 降低至9.5min。而在这个过程，中低流速0.5-5mL/min时，动态吸附容量在180 mg/g左右几乎没有变化；在300rpm至500rpm转速逐渐增加，预期动态吸附容 量从180mg/g增大到250mg/g。这可能是因为随着流速和转速的增大，树脂在 柱中与肝素的接触与交换机会显著提高，但实际吸附量仍需通过动态洗脱实验分 析。

表5不同流速下肝素在扩张床逆流色谱上的动态吸附容量

(5)扩张床逆流色谱动态吸附容量的实验测定同实施例1；

(6)扩张床逆流色谱洗脱曲线研究

①扩张床逆流色谱不同流速洗脱曲线：将树脂用1、2、5mL/min流速进行 穿透吸附后，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)冲洗2个柱体积，以除去未被吸附的肝 素，至流出液用浓硫酸氧化法检测至无色后，开始用2mol/L的NaCl进行洗脱， 洗脱时的流速分别为1、2、5mL/min。用部分收集器对洗脱下来的溶液进行收 集，并通过浓硫酸氧化法对浓度进行检测，绘制洗脱曲线；

结果显示：在扩张床逆流色谱中，当流速为1mL/min时，到达穿透点所用 的时间最长，到达穿透点后，穿透曲线上升较为平缓，说明肝素在柱中吸附的时 间越长，在柱中交换容量越大；随着流速的增加，穿透点更加的提前，穿透曲线 越陡。1、2、5mL/min三种流速的动态吸附容量分别为100mg/g，150mg/g，200 mg/g。在树脂与肝素交换充分的前提下，扩张床逆流色谱的动态吸附容量随着流 速增加而增加；

实验测定1、2、5mL/min三种流速的洗脱曲线，所的洗脱量汇总至表6。 可以看出1、2、5mL/min三种流速条件下扩张床逆流色谱动态吸附容量显著高 于固定床柱层析，在300rpm和1mL/min的流速的条件下，洗脱量达到91.66mg/g， 近乎达到静态吸附容量110.21mg/g，这是因为扩张逆流色谱在1mL/min时吸附 时间较长，树脂和肝素能够较充分接触；且扩张床逆流色谱运行过程中由于仪器 行星式运动致使树脂和肝素能够充分接触，并且仪器运行过程中色谱柱使温度增 加，有利于肝素在柱中吸附。随着流速的增加，洗脱所得到的肝素逐渐减低，这 是因为随着流速的增加，穿透时所用的时间越少，树脂与肝素没有得到充分地交 换吸附，仅仅是逆流色谱的效果将肝素捕获在螺线管色谱柱内，经未被吸附的肝 素洗脱后，吸附在树脂上的肝素较少，导致肝素吸附量降低。从吸附率对比，扩张床逆流色谱在1mL/min吸附率达到91.66％，对比固定床柱层析吸附率为 45.16％，扩张床逆流色谱能够在同等流速下有更高的吸附率，而一般柱层析的流 速在0.1-0.5mL/min，从这个角度来看，在保证高吸附率的情况下，扩张床逆流 色谱会因提高流速而显著降低分离时间，对工业化生产效率的提升有重要意义。

表6肝素动态吸附容量对比

不同流速下肝素在扩张床逆流色谱中的保留状态显示，随着流速的增加，肝 素的动态吸附容量逐渐增加，由以下三种原因的影响：1.肝素由于在分离柱中和 树脂充分接触，通过离子交换被吸附在树脂上，2.行星式运动使分离柱不断运动， 产生了类似逆流色谱液液分离的效果，使另一方面被树脂捕获在螺线管的液相中，3.仪器运行过程中温度增加，提高了肝素在吸附介质的吸附容量。之后用缓冲液 将未被吸附在树脂上的肝素洗脱后，用2mol/L的NaCl在1、2、5mL/min的流 速下进行洗脱得到的肝素的洗脱量为91.66、66.42、52.81mg/g，保留在溶液中 的肝素随流速增加而增加。

②肝素收集：将1、2、5mL/min三种流速条件下分离各管得到的肝素溶液 进行合并收集，用2倍乙醇醇沉，2000rpm离心5min，弃上清，用无水乙醇洗 涤两次，室温下烘干，研磨成粉，得到纯化后的肝素；

③扩张床逆流色谱体系扩大实验：用2mL/min时的实验条件进行体系2倍 放大，将10.0g树脂装入60mL软管中，排净管中气泡，连接好各接口，配制 50mg/mL的肝素水溶液上样，设定流速为2mL/min，转速为300rpm，流出液 在出口端用分部收集器收集，用浓硫酸氧化法进行肝素浓度的检测，根据出口端 肝素浓度与进样浓度比值，绘制穿透曲线。

经过穿透吸附后，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)冲洗2个柱体积，以除去未被 吸附的肝素，经浓硫酸氧化法法检测无肝素后，开始进行洗脱，洗脱时的条件为 流速2mL/min，转速为300rpm。用分部收集器对洗脱下来的溶液进行收集，并 通过浓硫酸氧化法对浓度进行检测，绘制洗脱曲线；

结果显示：经过2倍体系扩大后，穿透点时间明显由42.5min推迟至60min， 说明放大体系后，在扩张床逆流色谱中树脂与肝素接触更为充分，吸附量增加， 导致穿透点延后，扩张床逆流色谱动态吸附容量增加；

扩大体系后的洗脱曲线相关参数列于表7，实际洗脱量为136.48mg/g，扩张 床逆流色谱在吸附量上能较好地形成线性放大关系，且扩大扩张床逆流色谱分离 体系后，树脂在柱中与肝素可以更为充分地接触，吸附率达到55.59％，比之前 有所提升。

表7肝素动态吸附容量对比

(7)样量对吸附效果的影响

①上样量对吸附效果的影响：将5.0g D204树脂装入30mL软管中，排净 管中气泡，连接好各接口，设定流速2mL/min，转速为300rpm，分别以50、100、 200mg上样，用Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)冲洗2个柱体积，以除去未被吸附的肝 素，用2mol/L的NaCl进行洗脱，用分部收集器对洗脱下来的溶液进行收集， 并通过浓硫酸氧化法对浓度进行检测，绘制洗脱曲线；

数据列于表8中。在上样量为50、100、200mg时，所得到的肝素为13.73、 21.48、36.23mg；随着上样量的增加，肝素的回收量也逐渐增加，但随上样量增 加，回收率逐渐降低。这是因为扩张床逆流色谱行星式运动使肝素主要被捕获 在螺线管的液相中，将未被吸附在树脂中的肝素除去后，使肝素的回收率下降。

②循环上样量对吸附效果的影响：将5.0g D204树脂装入30mL软管中， 排净管中气泡，连接好各接口，设定流速2mL/min，转速为300rpm，上样200mg， 以Tris-HCl缓冲液(pH8.5)为流动相，循环上样，1h后每隔30min检测流出液 浓度，8h后以水为流动相，冲洗未被吸附的肝素，之后用2mol/L的NaCl进行 洗脱，用分部收集器对洗脱下来的溶液进行收集，并通过浓硫酸氧化法对浓度进 行检测，绘制洗脱曲线；

根据公式计算肝素回收率：

式中，η为肝素回收率；m₁为肝素洗脱量，mg；m₂为肝素上样量，mg。

结果显示，在初始时间0min时上样200mg，60min后，每隔30min进行 一次取样检测，510min停止检测，期间一共经历4次循环，之后用2mol/L的 氯化钠进行洗脱，循环上样后洗脱量为170.51mg，将回收率汇总到表8中，可 以看出经过4次循环后回收率达到85.75％，比未经循环时提高约4.7倍，显著提 高肝素回收率。

表8不同上样量的洗脱情况

(8)结论

将逆流色谱构建为扩张床逆流色谱，并对其运行参数进行考察，D204树脂 作为吸附介质，对肝素进行吸附；对不同流速进行穿透研究，并测定动态吸附容 量以及洗脱量；研究不同上样量对吸附效果的影响，并通过循环上样后洗脱，实 现肝素的高效回收，得到结论如下：

通过研究树脂在柱中保留状态，确定扩张床逆流色谱流速方向为由上向下， 转速方向为顺时针，可使树脂在柱中呈稳定的扩张床状态。

扩张床状态流速转速范围的确定：在转速为200rpm，流速1-3mL/min；转 速为300rpm时，流速为1-4mL/min；转速400rpm时，流速为3-8mL/min；转 速500rpm，流速在10mL/min时，可使树脂在柱中稳定呈扩张床状态。

1.5mL/min时，转速从300rpm增大到500rpm，柱中成扩散状态的树脂逐 渐向入口端移动，使穿透曲线更早的到达穿透点，动态吸附容量从275mg/g降 低至125mg/g。

流速对穿透点的影响十分显著，流速从0.5mL/min提高到10mL/min的高 流速，到达穿透点的时间从176min降低至9.5min，动态吸附容量从180mg/g 增加到250mg/g，动态吸附容量随流速的增加而增加。

与固定床柱层析对比，相同流速下，扩张床逆流色谱的洗脱量明显高于固定 床柱层析。扩张床逆流色谱在1mL/min吸附率最高达到91.66％，且洗脱量近乎 达到静态吸附容量110.21mg/g。扩张床逆流色谱可将肝素保留在螺线管色谱柱 内，使动态吸附容量随流速的增加而增加，而柱层析动态吸附容量随流速的增加 而降低。结果表明扩张床逆流色谱可在较高流速下有效提高树脂对肝素的吸附率， 减少分离时间。

扩大实验表明在流速为2mL/min，转速为300rpm时，能较好地形成线性放 大关系。

上样量对吸附效果的影响表明扩张床逆流色谱更适合高浓度上样分离，在上 样量为50、100、200mg时，回收得到的肝素为13.73、21.48、36.23mg；上样 200mg单次回收率18.11％，4次循环后回收率达到85.75％，实验结果表明，循 环上样会提高约4.7倍肝素收率。

实施例3层析分离纯化的肝素抗凝血活性及纯度考察

分别通过天青A比色法，生色底物法，羊血浆法来检测实施例2以及柱层 析分离后肝素的抗凝血活性，并对三种测定方法进行对比，分析评价柱层析和扩 张床逆流色谱制取肝素的抗凝血活性和纯度。

结果显示：

(1)天青A法检测肝素效价：如表9所示，肝素标准品效价为197IU/mg， 天青A比色法测定肝素粗品效价为118.42±3.06IU/mg。经过分离纯化后肝素的 抗凝血效价均有提高，其中柱层析1、2mL/min流速下肝素效价由118.42IU/mg 分别提高至156.61IU/mg、153.68IU/mg；扩张床逆流色谱1、2mL/min流速下 肝素效价由118.42IU/mg分别提高至145.13IU/mg、156.73IU/mg；5mL/min 流速下得到的肝素效价较高，其中柱层析效价达到182.74IU/mg，扩张床逆流色 谱达到192.35IU/mg，略高于柱层析。

表9天青A比色法测定肝素效价

(2)羊血浆法测定效价：实验得到肝素效价如表10所示，肝素粗品测定效 价为134.17±4.12IU/mg。对比用天青A比色法，用羊血浆法测定更为准确，柱 层析分离纯化肝素效价为205.51±7.90IU/mg，扩张床逆流色谱分离纯化后肝素 效价为216.09±11.89IU/mg，均达到药典规定180IU/mg的标准。扩张床逆流色 谱分离纯化后的肝素效价略高于柱层析分离纯化后的肝素效价。

表10羊血浆法测定肝素效价

(3)生色底物法检测肝素效价：实验得到肝素效价如表11所示，柱层析不 同流速下分离纯化得到的肝素抗FXa效价比肝素粗品有所提降低，抗FIIa效价 比肝素粗品有所提高，而扩张床逆流色谱经1mL/min分离纯化后肝素FXa效价 比肝素粗品有所提降低，抗FIIa效价比肝素粗品有所提高，2、5mL/min的抗 FXa效价和抗FIIa效价比肝素粗品均有所提高。由于在抑制FⅡa活性时，肝素 链(至少要有18个单糖组分且含五糖单位)必须同时与抗凝血酶和凝血酶形成三 元复合物。分子量较大的肝素的大部分糖链符合此条件，而低分子的肝素则有一 部分肝素链不符合。低分子肝素主要对FⅩa发挥抑制作用，而保留了部分FⅡa活性，有皮下注射吸收良好、生物利用度高、出血倾向小等优势。柱层析吸附的 肝素分子量较大，而逆流色谱吸附的肝素分子量较小，Fxa/FIIa较高，抗凝血性 效果较好，更适合作为外源性抗凝剂。

表11生色底物法测定肝素效价

(4)HPLC检测肝素纯度

将肝素粗品、标准品、不同流速穿透后洗脱得到的肝素经过HPLC-ELSD检 测结果，通过分子量标准曲线的计算，得到肝素标准品和粗品都是分子量不同的 混合物，肝素标准品分子量范围在7177-14293Da，肝素粗品分子量范围在 6793-14769Da，肝素粗品中含有NaCl较高，经过柱层析或扩张床逆流色谱穿透 吸附后，可将肝素粗品进行不同程度的纯化，纯化后NaCl明显减少。

肝素经过分离纯化后按保留时间6.72min，7.48min，8.15min，10.99min，13.29min大致分为三个组分Hp-1，Hp-2，Hp-3，以及Cl^-和Na⁺，根据各个峰的 面积将各个组分的百分比列于表12，凝胶过滤色谱按分子量大小出峰，肝素标 准品含量从高分子量到低分子量均有分布且分布均匀，而肝素粗品分子量不同且 含量不均一。通过与肝素粗品的色谱图对比，经过柱层析得到的肝素含NaCl显 著减少，含较高分子量的Hp-1，Hp-2较多，而经过扩张床逆流色谱分离纯化后 得到的肝素含较低分子量的Hp-2，Hp-3较多，结果与Fxa/FⅡa值相吻合。

表12不同流速下肝素百分比含量

(5)结论

肝素的主要质量指标是其效价和分子量，本实施例主用天青A比色法、生 色底物法和羊血浆法法测定肝素的效价，并用HPLC-ELSD对肝素成分进行初步 分析，具体结果如下：

(1)标志为140IU/mg的肝素，使用天青A比色法测定效价为118.42±3.06 IU/mg，羊血浆法肝素粗品效价为134.17±4.12IU/mg，羊血浆法更为准确，经柱 层析分离纯化的肝素效价为205.51±7.90IU/mg，扩张床逆流色谱分离纯化后肝 素效价为216.09±11.89IU/mg，均达到药典规定180IU/mg的标准。

(2)生色底物法测定肝素粗品抗FXa为173.48IU/mg、抗FIIa效价为80.32 IU/mg，Fxa/FIIa＝2.16，经过柱层析分离纯化后Fxa/FIIa在1.46-1.90，经过2 mL/min和5mL/min流速下扩张床逆流色谱分离纯化后肝素Fxa/FIIa分别为4.03、 3.89，说明经柱层析分离纯化后的肝素分子量较高，而扩张床逆流色谱分离纯化 后的肝素分子量较低。

(4)肝素经分离纯化后用HPLC-ELSD检测，实验结果表明，肝素是分子量不 同的混合物，分离纯化后肝素大致分为三个组分Hp-1，Hp-2，Hp-3，与柱层析 分离纯化肝素相比，扩张床逆流色谱分离纯化的肝素分子量较小，Fxa/FIIa较高， 扩张床逆流色谱在2mL/min的流速下纯化肝素效果较好。

综上可得结论：

通过将固体吸附介质D204树脂加加入到逆流色谱的分离柱中的方式构建一 种扩张床逆流色谱分离纯化方法，并对其分离纯化肝素进行深入研究，优化肝素 提取工艺参数，并与固定床柱层析提取肝素进行比较，对比研究两种不同肝素提 取工艺所制备的肝素抗凝血活性的差异，主要研究结果如下：

(1)通过吸附动力学研究，结果表明，树脂吸附肝素的吸附动力学符合准二 级动力学模型，颗粒内扩散对吸附过程有一定影响；通过静态吸附、解吸实验得 到四种树脂的静态饱和吸附量和解析能力由高到低为：D204>D208>D254>D301； D204在25℃饱和吸附量达到110.21mg/g，45℃饱和吸附量可达到192.55mg/g， 表明升温有利于离子交换树脂对肝素的吸附；通过Langmuir和Freundlich两种 模型对四种树脂吸附肝素的数据进行拟合，四种树脂吸附肝素的过程与Langmuir 吸附等温曲线拟合良好，属于单分子层吸附。筛选出D204树脂作为后续实验的 吸附介质。

(2)通过研究树脂在柱中保留状态，确定扩张床逆流色谱流速方向为由上向 下，转速方向为顺时针，分别确定转速为200-500rpm范围内合适的进样流速， 使树脂在分离柱中呈稳定的扩张分散状态。研究了不同肝素浓度、流速下扩张床 逆流色谱的穿透行为和洗脱曲线，实验结果表明，在5.0g D204树脂，柱体积为 30mL，上样浓度为50mg/mL，流速1.5mL/min，转速300rpm下，动态吸附容 量为275mg/g，随转速的提高，动态吸附容量逐渐下降。流速对穿透点时间的影 响十分显著，在0.5mL/min流速时，于176min到达穿透点，随流速的增加到 10mL/min，穿透点时间逐渐提前到9.5min，动态吸附容量随流速的增加而增加。 将200mg肝素循环上样，单次循环回收率18.11％，4次循环后回收率达到85.75％， 实验结果表明，循环上样会显著提高4.7倍的肝素收率。与固定床柱层析对比， 在1、2、5mL/min相同流速下，二者均在穿透吸附后进行洗脱，扩张床逆流色 谱的洗脱量分别为固定床柱层析洗脱量的1.69、2.06、2.58倍。扩张床逆流色谱 在1mL/min吸附率最高达到91.66％，结果表明扩张床逆流色谱在较高流速下有 效提高树脂对肝素的吸附率，减少肝素产品的分离时间。

(3)标识为140IU/mg的肝素粗品，使用天青A比色法测定效价为118.42±3.06 IU/mg，羊血浆法肝素粗品效价为134.17±4.12IU/mg，羊血浆法更为准确，经柱 层析分离纯化的肝素效价为205.51±7.90IU/mg，扩张床逆流色谱分离纯化后肝 素效价为216.09±11.89IU/mg，均达到药典规定180IU/mg的标准。生色底物法 测定肝素粗品抗FXa为173.48IU/mg、抗FIIa效价为80.32IU/mg，Fxa/FIIa＝2.16， 经过柱层析分离纯化后Fxa/FIIa在1.46-1.90，经过2mL/min和5mL/min流速下 扩张床逆流色谱分离纯化后肝素Fxa/FIIa分别为4.03、3.89，说明经柱层析分离 纯化后的肝素分子量较高，而扩张床逆流色谱分离纯化后的肝素分子量较较低。 肝素经分离纯化后用HPLC-ELSD检测，实验结果表明，肝素是分子量不同的混 合物，得到肝素大致分为三个组分Hp-1，Hp-2，Hp-3，与柱层析分离纯化肝素 相比，扩张床逆流色谱分离纯化的肝素分子量较小，Fxa/FIIa较高，抗凝血性效 果较好，更适合作为外源性抗凝剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范 围之内。

Claims (2)

1.一种扩张床逆流色谱分离纯化肝素的方法，其特征在于，以阴离子交换树脂作为固体吸附介质，将其加入扩张床逆流色谱分离柱中，肝素溶液上样至扩张床逆流色谱进行吸附、洗脱、醇沉、离心、洗涤得纯化后的肝素；

所述阴离子交换树脂为D204；

所述扩张床逆流色谱分离纯化肝素过程中，上样和洗脱流速方向均为由上向下；

所述阴离子交换树脂的加入量和扩张床逆流色谱分离柱的有效柱体积的比例为(2.0-5.0)g：30mL；肝素上样量和扩张床逆流色谱分离柱的有效柱体积的比例为(50-200)mg：30mL；在所述上样中转速与流速为：在转速200rpm下，上样流速为1-3mL/min，或者在转速300rpm下，上样流速为1-4mL/min，或者在转速400rpm下，上样流速为3-8mL/min，或者在转速500rpm下，上样流速为10mL/min；

吸附过程中的流动相为pH值为8.5的Tris-HCl缓冲液；

所述洗脱具体包括：使用2-4mol/L的NaCl作为洗脱液，洗脱流速为1-5mL/min；

所述上样为循环上样；循环上样次数为4次。

2.一种根据权利要求1所述的扩张床逆流色谱分离纯化肝素的方法所得到的肝素，所述上样是在转速200rpm或300rpm下，上样流速为2mL/min。

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