CN113402577A

CN113402577A - 一种甾体衍生物及其应用

Info

Publication number: CN113402577A
Application number: CN202110703665.9A
Authority: CN
Inventors: 陈建军; 陈镜玄; 李玲
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2021-06-24
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2021-09-17

Abstract

本发明涉及一种甾体衍生物，该衍生物的化学结构如下式(I)所示，本发明所述的甾体衍生物具有抗炎的生物活性，在RAW264.7细胞中显著抑制LPS诱导的NO，在小鼠体内表现出明显的缓解结肠炎症的效果。

Description

一种甾体衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及有机化合物，具体涉及甾体衍生物，该化合物可制备治疗炎症性肠炎的药物。

背景技术

炎症性肠炎(Inflammatory Bowel Diseases,IBD)是一类高发于人类的自身免疫性疾病，临床表现为反复腹痛、腹泻、腹部包块、粘液血便、肠梗阻、肠穿孔、体重减轻等。随着在西方国家发病率的上升，炎症性肠炎已成为影响人类健康的重要疾病。根据病理表征和发病部位的不同，分为溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’sdisease,CD)。当肠内稳态失衡时，肠黏膜通透性增加，导致肠黏膜屏障功能受损，介导IBD发生。与正常黏膜固有层巨噬细胞相比，活动性IBD患者病变局部结肠组织中的肠黏膜巨噬细胞数量显著增加，且更趋向于激活状态，提示肠道巨噬细胞在IBD的发生发展中发挥重要作用。骨髓来源的巨噬细胞通过不同的刺激可诱导极化形成不同表型和功能的巨噬细胞，主要为M1型和M2型。其中，M1型巨噬细胞经刺激活化后分泌大量促炎细胞因子且通过高表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)分解L-精氨酸产生的NO和活性氧(ROS)，参与吞噬细菌、趋化炎性细胞、促进Th1和Th17细胞介导的免疫应答等过程，发挥宿主免疫功能，导致IBD患者肠组织的炎症损伤。

目前用于治疗IBD的药物多种多样，主要有氨基水杨酸类(如柳氮磺吡啶或美沙拉嗪(5-ASA))、肾上腺糖皮质激素(如泼尼松龙)、免疫抑制剂(如硫嘌呤或甲氨蝶呤)、生物制剂(如TNF抑制剂)等。糖皮质激素通过与细胞核内的糖皮质激素受体结合，快速缓解症状，发挥抗炎作用，适用于IBD急性发作期，且氨基水杨酸足量治疗无效时。但胃肠道吸收导致的全身性副作用，如机会性感染，糖尿病，骨质疏松等限制了糖皮质激素的适用。近年来，布地奈德(Budesonide)和倍氯米松(Beclomethasone)的口服制剂因其局部抗炎活性高、全身性副作用小而受到人们的关注。这些药物经口服后特异性地递送至肠黏膜。药物在肠道吸收后可迅速有效地灭活，从而发挥局部抗炎作用。

由于糖皮质激素在IBD治疗中发挥重要作用，因此研发新的甾体骨架类药物用于IBD的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种甾体衍生物，该化合物的抗炎效果显著。

本发明解决上述技术问题的方案如下：

一种甾体衍生物，该甾体衍生物的化学结构如下式(I)所示：

本发明的甾体衍生物的制备方法包括以下步骤：首先孕烯醇酮醋酸酯进行卤仿反应生成化合物2，再将化合物2进行缩合反应即得到所述的甾体衍生物。上述制备方法的化学反应式如下：

采用NO抑制试验测定，本发明所述甾体衍生物对LPS刺激的巨噬细胞产生的NO具有显著的抑制作用，可用于制备抗炎药物，特别是用于制备治疗炎症性肠炎药物。其中，所述治疗炎症性肠炎的药物由所述的甾体衍生物和医学上可接受的辅料组成。

本发明所述治疗炎症性肠炎的药物在RAW264.7细胞中显著抑制LPS诱导的NO，在小鼠体内表现出明显的缓解结肠炎症的效果。

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明所述甾体衍生物在RAW264.7细胞中抑制LPS诱导的NO效果的直方图，图中*表示与阳性对照地塞米松相比，*p<0.05(n＝3)。

图2为实验小鼠DAI评分(n＝5)的直方图，其中，A图为小鼠腹泻评分差异，B图为小鼠血便评分差异。图中，###表示与Control组比较，###p<0.001；***表示与DSS组比较，***p<0.001。

图3为小鼠结肠组织的HE染色切片的显微照片(200X)，其中A图为A组小鼠结肠组织的HE染色切片，B图为B组小鼠结肠组织的HE染色切片，C图为C组小鼠结肠组织的HE染色切片，D图D组小鼠结肠组织的HE染色切片，E图为E组小鼠结肠组织的HE染色切片，F图为F组小鼠结肠组织的HE染色切片。

图4为小鼠结肠组织的CD86免疫组织化学分析的显微照片(400X)，其中A图为A组小鼠结肠组织的CD86免疫组织化学分析，B图为B组小鼠结肠组织的CD86免疫组织化学分析，C图为C组小鼠结肠组织的CD86免疫组织化学分析，D图为D组小鼠结肠组织的CD86免疫组织化学分析，E图为E组小鼠结肠组织的CD86免疫组织化学分析，F图为F组小鼠结肠组织的CD86免疫组织化学分析。

具体实施方式

实施例1(化合物的制备)

本例中所述甾体衍生物由以下步骤组成：

步骤一：

将2.1g氢氧化钠溶解于18mL水，冰浴滴加2.88g溴素，当溴完全溶解，将混合物加入12mL二氧六环得混合液；取该混合液加入含1.44g孕烯醇酮醋酸酯(1)的溶液(56mL二氧六环和16mL水的混合溶液)，搅拌过夜后加入亚硫酸钠，加热回流直到固体完全溶解，加盐酸酸化后析出白色固体，固体水洗至溶液无色。

上述步骤一的化学反应式如下：

将所得到的白色固体采用核磁共振谱进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.88(s,1H),5.26(d,J＝4.7Hz,1H),4.61(s,1H),3.25(ddd,J＝15.2,10.4,4.4Hz,1H),2.26(t,J＝9.2Hz,1H),2.18–2.02(m,2H),1.95(dd,J＝19.3,11.9Hz,3H),1.76(dd,J＝13.3,3.2Hz,1H),1.73-1.64(m,2H),1.63–1.47(m,3H),1.45–1.30(m,3H),1.28–1.14(m,2H),1.12–1.04(m,1H),1.00(dd,J＝13.6,3.3Hz,1H),0.95–0.86(m,4H),0.63(s,3H).由上述鉴定结果可知，所得白色固体为化合物2。

步骤二：

取318mg(1mmol)步骤一所得到的化合物2溶于无水DMF中，加入HOBt 135mg,加入三乙胺4滴,再加入EDCI 192mg，最后加入咪唑68mg搅拌过夜。反应结束后加水析出白色固体。

上述步骤二的化学反应式如下：

将所得到的化合物采用核磁共振谱进行鉴定，鉴定结果为¹H NMR(400MHz,DMSO)δ8.44(s,1H),7.73(s,1H),7.06(s,1H),5.28(d,J＝3.1Hz,1H),4.59(d,J＝4.4Hz,1H),3.41(t,J＝8.8Hz,1H),3.29–3.20(m,1H),2.14(dt,J＝35.9,11.9Hz,3H),1.93(dd,J＝33.6,11.3Hz,2H),1.71(dd,J＝29.3,10.3Hz,3H),1.55(dd,J＝27.2,11.6Hz,4H),1.40–1.21(m,5H),1.08–0.88(m,5H),0.65(s,3H)。由上述鉴定结果可知，所得产物为化合物3，即式(I)所示甾体衍生物。

实施例2(细胞实验研究)

一、实验目的及原理

实验目的：采用NO抑制试验检测合成的一系列甾体类化合物对LPS刺激的巨噬细胞产生的NO抑制效果。

实验原理：NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO₂ ^-，在酸性条件下，NO₂ ^-与重氮盐磺胺发生重氮反应，并生成重氮化合物，后者进一步与萘基乙烯基二胺发生偶合反应，该反应生成的产物浓度与NO₂ ^-浓度具有线性关系，在540nm-560nm处有最大吸收峰。

二、试剂基本信息

试剂名称	品牌
		NaNO<sub>2</sub>	Macklin
N-1-萘乙二胺盐酸盐	Macklin
		对氨基苯磺酸	Macklin
RPMI-1640基础培养基	Gibco
		胎牛血清	Gibco
青霉素-链霉素溶液	Gibco
		二甲基亚砜(DMSO)	Macklin

三、试剂配制

1、RPMI-1640完全培养基

将50mL血清悬空倒入450mL RPMI-1640培养基中，然后按照1:100的比例加入5mL青霉素-链霉素溶液，使其成完全培养基，即可用于细胞培养。

2、Griess试剂配制

2.1 10mM NaNO2标准储存液的配制：精确称取NaNO₂ 6.9mg，加去离子水定容至10mL，即为10mM NaNO2储存液。

2.2Griess试剂配制

试剂A：浓磷酸(85％)6mL；去离子水70mL；无水对氨基苯磺酸1.0g。将上述试剂充分溶解后，定容至100mL。

试剂B：N-1-萘乙二胺盐酸盐0.1g，溶于去离子水中，定容至100mL。

3、化合物配制

称取1mg上述实施例1所制备的甾体衍生物(化合物Ⅰ)置于经高压灭菌过的EP管中，然后向EP管中加入136μl的DMSO配制成20mM的母液，使用前用完全培养基将母液稀释至40μM，20μM，10μM，5μM，和2.5μM。

四、实验过程

(1)取对数生长期的RAW 264.7细胞，消化后调整细胞数浓度为5×10⁴/mL，按100μL/孔接种到96孔板中。在37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁。

(2)吸除原有培养基，每孔加入含LPS(100ng/mL)的培养基100μL，空白组加入不含LPS刺激的培养基100μL，2h后每孔加入100μL配制好的不同浓度的化合物，即化合物实际处理浓度为20μM，10μM，5μM，2.5μM和1.2 5μM。以0.1％的DMSO为阴性对照组，地塞米松(Dex)为阳性对照组。在细胞培养箱中继续培养24h后，每孔取50μL培养基待用。

(3)NO标准液稀释如下

(4)加样：向96孔板中分别加入稀释好的标准应用液或待测样品各50μL。然后向各孔中加入50μL试剂A，于37℃孵箱中反应10min；再向各孔中加入50μL试剂B，于37℃孵箱中反应10min。

(5)将96孔板轻轻振荡数次，待各孔反应液完全混匀后，用酶联免疫检测仪于540nm波长处检测各孔的OD值。根据所得OD值，拟合NO反应标准曲线，并由标准曲线计算各待测样品的NO含量。

(6)按以下公式计算NO抑制率：

抑制率＝[(Al-Ab)-(As-Ab)]/(Al-Ab)×100％

Al：对照孔的吸光度(经LPS刺激，无化合物处理)；As：实验孔的吸光度(经LPS刺激，化合物处理)；Ab：空白孔的吸光度(无细胞)

根据药物在不同剂量下对细胞增殖的抑制率，通过GraphPad Prism 8.2.1软件计算化合物在不同浓度下的抑制率。测得化合物对LPS诱导的NO抑制结果如表1所示：

表1化合物对NO的抑制效果

五、实验结果

NO抑制实验的结果如图1所示，当浓度为5-20μM时，化合物Ⅰ对LPS诱导产生的NO显示出与地塞米松相当或高于地塞米松的活性，其中，浓度为10μM时化合物Ⅰ与地塞米松对NO的抑制活性具有显著性差异。结果表明，化合物Ⅰ在浓度大于10μM具有显著的抑制NO生成的活性。

实施例3(动物实验研究)

一.动物模型

在炎症性肠炎的新药研发过程中，葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate SodiumSalt,DSS)诱导的结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型应用最为广泛。通过给予小鼠自由饮用不同浓度的DSS水溶液，根据用药时间及用药周期可制成急性和慢性两种结肠炎模型。该模型症状表现与人类UC极为相似，主要表现为腹泻、黏液样便、粪便潜血、肉眼血便、重量减轻、活动度减少，毛色变差等。慢性期结肠炎模型主要表现有结肠明显缩短,粘膜增厚、淋巴结肿大，杯状细胞缺失、隐窝缺失，小部分动物出现腺瘤性息肉、肿瘤样改变。急性期结肠炎模型主要表现有结肠充血、水肿、变短、变脆、重量长度比增加，出现不同程度的结肠溃疡，黏膜水肿、杯状细胞缺失、隐窝肿胀破坏，黏膜和黏膜下层出现不同程度的炎症细胞浸润，上皮细胞损伤。

二.实验动物与试剂

动物：c57小鼠，雄性，5周龄

试剂：试剂信息如下表所示

试剂名称	品牌
		葡聚糖硫酸钠(DSS)	MeilunBio
蓖麻油	aladdin
		聚乙二醇	Macklin
乙醇	Macklin
		二甲基亚砜(DMSO)	Macklin

三.试剂配制

1.DSS溶液：将DSS溶于消毒过的饮用水，配制成重量百分浓度为3.5％的DSS溶液。

2.化合物配制：取上述实施例1所制备的甾体衍生物(化合物Ⅰ)溶于盐水，加入蓖麻油、乙醇和DMSO(70：10：15：5)，配制成20mg/mL,10mg/mL,5mg/mL等不同浓度的溶液待用；按照同样方法将地塞米松配制成5mg/mL的溶液待用。

四.实验过程

1.将购买的5周龄C57小鼠饲养于SPF级动物房，饮用正常水一周以适应环境。

2.待小鼠长至约20g时，将小鼠随机分为6组，A组给予正常饮用水；B组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用；C组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用，同时腹腔注射20mg/mL的化合物Ⅰ溶液100μL/只(100mg/kg)；D组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用，同时腹腔注射10mg/mL的化合物Ⅰ溶液100μL/只(50mg/kg)；E组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用，同时腹腔注射5mg/mL的化合物Ⅰ溶液100μL/只(25mg/kg)；F组给予3.5％的DSS溶液供其随意饮用，同时腹腔注射5mg/mL的地塞米松溶液100μL/只(25mg/kg)。

3.记录小鼠拉稀便血等情况。评分标准：(1)大便稠度：0，形成良好的颗粒；2，糊状且不成形的大便，不粘在肛门上；4，液体大便且粘在肛门上。(2)大便出血：0，血液中无血；2，出血；4，大出血。

4.对结肠组织进行HE染色。一周后，将小鼠处死，解剖取其结肠，将样品固定在10％福尔马林中，石蜡包埋，切成薄片，用苏木精和曙红(HE)染色，以200X的放大率在显微镜下观察。

5.对结肠组织进行免疫组织化学分析。将切片除蜡后在柠檬酸盐缓冲液中回收抗原，然后将样品与一抗(CD86，1：200稀释)孵育，再在IgG-HRP抗体(1：200稀释)中孵育。孵育后，样品在二氨基联苯显微镜下显影，用苏木精重新染色，脱水，密封成微片。使用光学显微镜，以400X的放大率观察到结肠结构。

五.实验结果

1.如图2所示，与未经DSS处理的小鼠相比，经DSS处理的小鼠粪便黏度和出血分数显著升高，表现出明显的拉稀便血的炎性症状。治疗组小鼠经不同剂量化合物Ⅰ处理后，其粪便黏度和便血分数均显著降低，其中，50mg/kg化合物Ⅰ处理组的小鼠疾病活动指数最低。结果表明化合物Ⅰ可有效缓解小鼠的结肠炎症。

2.如图3所示，与未经DSS处理的小鼠相比，经DSS处理的小鼠表现出隐窝脓肿，杯状细胞丢失，黏液层丢失，嗜中性白细胞浸润到固有层等病理学特征(图3B)，D组结肠(50mg/kg化合物Ⅰ)炎症细胞减少，且显示出完整的结构(图3D)。结果表明化合物Ⅰ可有效缓解小鼠结肠的炎症。

3.如图4所示，与未经DSS处理的小鼠相比，经DSS处理的小鼠结肠组织内CD86(+)细胞聚集且形成几个显著的阳性群落(图4B)，而在未经DSS处理、经DSS和化合物Ⅰ等组别的小鼠结肠内，CD86(+)细胞处于分散状态(图4A，C,，D，E，F)。结果表明化合物Ⅰ可有效缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症。基于此，化合物Ⅰ有望应用于炎症性肠炎即IBD。

Claims

1.一种甾体衍生物，该甾体衍生物的化学结构如下式(I)所示：

2.权利要求1所述的甾体衍生物在制备治疗炎症性肠炎药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的抗炎药物由权利要求1所述的甾体衍生物和医学上可接受的辅料组成。