CN113402523A - 一种靶向肥大细胞MrgX2小分子荧光探针及制备方法和应用 - Google Patents

一种靶向肥大细胞MrgX2小分子荧光探针及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针及制备方法和应用，所述的靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针，是在苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物的苯环对位甲氧基侧链上，连接上以不同碳链长度取代的荧光发色团，所述的荧光发色团为香豆素型、荧光素型或Bodipy FL acid。苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物保持对MrgX2受体的激动活性，而指示性的荧光是由荧光发色团发出的。本发明公开的荧光探针既保持了对MrgX2受体的激动活性，又具有一定的荧光性能。作为一种靶向工具分子，可与肥大细胞细胞直接作用，通过其荧光性能的变化，来进行受体的可视化研究及药物筛选研究。

Description

一种靶向肥大细胞MrgX2小分子荧光探针及制备方法和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，涉及一种靶向肥大细胞MrgX2小分子荧光探针及制备方法和应用。
背景技术
药物过敏反应是临床常见的药物不良反应之一，严重时可导致休克或死亡，其中类过敏反应占药物过敏反应的70％以上。表达于肥大细胞的G蛋白偶联受体MrgX2被证实与类过敏反应的发生密切相关。多种内源性生物活性肽可在机体内激活MrgX2，从而引发生物体内复杂的生理调控或过敏性疾病；外源性的一些肽类药物，小分子药物，中药注射液中的组分等在临床使用中也能通过MrgX2激活肥大细胞，从而引发药物类过敏反应，增加临床应用的不良反应发生率。因此，MrgX2及其配体在过敏性疾病及药物不良反应中均具有重要的意义。
在药物研究中，气相色谱、液相色谱以及紫外光谱是进行药物分析的基本技术。20世纪70年代以来，特别是近年来相继出现的各种灵敏度高的荧光分析法已有效地用于药物制剂以及生物体液中药物的分析。如同步扫描荧光技术可用于违禁品中苯丙胺和吗啡加奎宁的测定；荧光偏振免疫分析法可用于血清中的庆大霉素、地答新、茶叶碱、戊巴比妥、苯巴比妥等多种药物的检测，还可进行烧伤患者体内萘替米星的药代动力学研究；特异性荧光偏振免疫法可用来监测肾移植后环孢素A的全血浓度；荧光猝灭法用来测定苦参碱和氧化苦参碱的含量；固体表面荧光测定法用于血清中茶叶碱，以及其它多种抗菌药、抗气喘病药、抗惊风病药等的临床荧光分析；电解荧光光度法测定片剂中卡马西平的含量等等。其中，荧光探针技术已经发展成为借助荧光显微镜在分子水平上进行实时检测的重要手段。这种技术灵敏度高，可视性强，而且对研究的生物大分子或细胞干扰少，因此得到广泛应用。
分子荧光探针对金属离子、生物小分子和生物大分子的响应，使得人们能够用荧光显微镜、荧光光谱，特别是荧光成像技术来实时检测活细胞内分子或离子浓度以及生物大分子结构的变化过程。这些年来，具有荧光性质的GPCR配体已经广泛用于定位受体的分布，并能够实时的监测配体-受体相互作用触发的过程(如内化、运输、螯合和回收)。因GPCR的配体结合区域通常是高粘度低极性的环境，所以开发环境敏感型的GPCR荧光配体则具有更加重要的作用。具有环境敏感型的荧光配体对周围环境的物理化学性质的变化非常敏感，其在水溶液中显示弱荧光，但在低极性或当结合到细胞中的疏水结构域中时可释放出明亮的荧光。然而，迄今为止并没有关于检测MrgX2在细胞表面分布的小分子荧光探针的报道。鉴于小分子荧光探针具有高灵敏度、高选择性以及快速响应等有点，迫切需要开发一种方便的荧光配体来追踪MrgX2，以深入理解其生理学和病理学功能。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供一种靶向肥大细胞MrgX2小分子荧光探针及制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现：
一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针，该探针结构式为；
Figure BDA0003160739010000021
其中，R代表含有羧基的荧光发色团，n代表2～5。
本发明进一步的改进在于，所述的含有羧基的荧光发色团为香豆素类荧光发色团、荧光素类荧光发色团或氟化硼二吡咯醇酸。
本发明进一步的改进在于，香豆素类荧光发色团、荧光素类荧光发色团与氟化硼二吡咯醇酸构式如下：
Figure BDA0003160739010000031
其中，R1为氢原子、甲氧基或氮烷基；R2、R3为氯原子、溴原子或氟原子。
一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针的制备方法，按照氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物∶荧光发色团∶丙基磷酸酐＝1∶1∶1的摩尔比，将氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物、含有羧基的荧光发色团以及丙基磷酸酐加入到DCM中进行反应，得到荧光探针；该荧光探针的结构式如下：
Figure BDA0003160739010000032
其中，R代表含有羧基的荧光发色团，n代表2～5。
本发明进一步的改进在于，氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物通过以下过程制得：
1)将甲氧基取代的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物溶于DDM后，加入三溴化硼，去甲基后得到(R)-4-(7-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)苯酚；
2)向(R)-4-(7-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)苯酚中加入叔丁基(溴乙基)氨基甲酸酯、叔丁基(溴丙基)氨基甲酸酯、叔丁基(溴丁基)氨基甲酸酯或叔丁基(溴戊基)氨基甲酸酯进行反应，得到末端为叔丁基氨基甲酸酯取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物；
3)将末端为叔丁基氨基甲酸酯取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物在盐酸中，以乙酸乙酯为溶剂，脱去氨基保护，得到氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物。
本发明进一步的改进在于，甲氧基取代的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物通过以下过程制得：
1)4-甲氧基苯甲酰乙酰乙酯与3-氨基吡唑在乙酸溶液中反应，得到5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮；
2)以POCl3为氯代试剂，取代5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮的羰基，得到7-氯-5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；
3)将7-氯-5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶溶解于二氧六环，加入DIEA后与(R)-3-(二甲基氨基)吡咯烷反应，得到甲氧基取代的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物。
本发明进一步的改进在于，其特征在于，所述的含有羧基的荧光发色团为香豆素类荧光发色团、荧光素类荧光发色团或氟化硼二吡咯醇酸。
本发明进一步的改进在于，香豆素类荧光发色团、荧光素类荧光发色团与氟化硼二吡咯醇酸构式如下：
Figure BDA0003160739010000051
其中，R1为氢原子、甲氧基或氮烷基；R2、R3为氯原子、溴原子或氟原子。
一种如上述的靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针在靶向识别肥大细胞MrgX2领域中的应用。
本发明进一步的改进在于，靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针在用于MrgX2竞争性配体筛选中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明构建的靶向肥大细胞MrgX2的荧光探针，以(R)-ZINC-3573作为基础分子结构，在其苯环的对位引入甲氧基，通过取代反应引入末端为氨基的碳原子数为2～5的直链烷基，再通过酰胺化与荧光发色团进行连接。本发明的荧光探针制备方法简单，易于实现，并且收率较高。
本发明制备的靶向肥大细胞MrgX2的荧光探针作为一种靶向工具分子，能够与肥大细胞的MrgX2特异性结合，通过其荧光性能的变化，不仅能够用于MrgX2的识别及功能的研究，还能应用于配体的筛选及相互作用机制的研究以及进行待测药物作用机制和作用效果的研究。
进一步的，不同于传统的荧光发色团，本发明所选用的荧光发色团是具有环境敏感型的香豆素发光团，其在水溶液中荧光强度低，而结合到细胞膜的疏水结构域中时可释放出明亮的荧光。由于其荧光背景干扰低，毒性小，可实现活细胞的实时监测，从而应用于MrgX2的功能学研究。
附图说明
图1为不同浓度荧光探针ZX1的荧光激发图谱及发射图谱；其中，(a)为荧光激发图谱，(b)为发射图谱。
图2为荧光探针ZX1对MrgX2受体的激动活性考察结果；其中，(a)为荧光激发图谱，(b)为发射图谱。
图3为荧光探针ZX1对人原代肥大细胞、MrgX2-HEK293细胞及HMC-1细胞中MrgX2受体的成像图。
具体实施方式
下面具体结合实施例对靶向肥大细胞的荧光探针的合成、荧光性能及对肥大细胞MrgX2的识别作用，对本发明作进一步详细的说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明提供的靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针，是在苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物中苯环对位甲氧基侧链上，连接上以不同碳链长度取代的荧光发色团，其结构通式表示为：
Figure BDA0003160739010000061
其中，R代表含有羧基的合成或市售荧光发色团，通过和不同碳链长度的氨基发生缩合反应，从而与苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物连接。n代表具有2～5个碳原子的碳链。
荧光发色团可为香豆素类、荧光素类或Bodipy FL acid(氟化硼二吡咯醇酸)，其结构式分别为：
Figure BDA0003160739010000071
其中，R1为氢原子、甲氧基或氮烷基；R2、R3为氯原子、溴原子或氟原子。
所述的含有羧基荧光发色团可通过碳原子数为2～5的末端为氨基的直链烷烃与苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物连接。
一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
a、苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物的合成：
1)4-甲氧基苯甲酰乙酰乙酯与3-氨基吡唑在乙酸溶液中反应，得到5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮；
2)以POCl3为氯代试剂，取代5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮的羰基，得到7-氯-5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；
3)7-氯-5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶溶解于二氧六环，加入DIEA后与(R)-3-(二甲基氨基)吡咯烷反应，得到甲氧基取代的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物；
b、不同碳链长度取代的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物的合成：
1)甲氧基取代的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物溶于DDM后，加入三溴化硼，去甲基后得到(R)-4-(7-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)苯酚；
2)通过向上述产物中加入叔丁基(溴乙基)氨基甲酸酯，或叔丁基(溴丙基)氨基甲酸酯，或叔丁基(溴丁基)氨基甲酸酯，或叔丁基(溴戊基)氨基甲酸酯反应，得到末端为叔丁基氨基甲酸酯取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物；
3)末端为叔丁基氨基甲酸酯取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物在盐酸中，以乙酸乙酯为溶剂，脱去氨基保护，得到氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物；
c、荧光探针的合成：
向DCM中按照氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物∶荧光发色团∶T3P＝1∶1∶1的摩尔比，加入氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物、荧光发色团以及丙基磷酸酐(T3P)，室温反应3h后得到荧光探针。
实施例1靶向肥大细胞MrgX2的荧光探针ZX1的合成
1)苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物的合成，其合成路线如下：
Figure BDA0003160739010000081
其具体的合成步骤为：
①化合物5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮(中间产物2)的合成：
将1.0g(12mmol)3-氨基吡唑加入到50mL圆底烧瓶中，用10mL乙酸溶液溶解，加入2.7g(13mmol)4-甲氧基苯甲酰乙酸乙酯。搅拌溶解后，将所得反应混合物回流3h。冷却至室温，蒸除溶剂后，将固体残余物用EtOAc稀释并过滤，得到白色固体，即为5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮。产率69％。
②化合物7-氯-5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶(中间产物3)的合成：
将1.0g(4.1mmol)中间产物2加入到50mL圆底烧瓶中，用5mL(55mmol)POCl3溶解，室温下向所得溶液中加入吡啶0.25mL(3.1mmol)。室温搅拌反应3天后，将反应混合物用50mL Et2O稀释并过滤。所得固体再次用Et2O冲洗。之后，将Et2O溶液合并，并冷却至0℃，倒入冰水混合物中。待分层后，分别用水和盐水洗涤有机层。洗涤完成后，将有机层经硫酸钠干燥并蒸发溶剂，得到淡黄色固体，即为7-氯-5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶。产率66％。
③化合物(R)-1-(5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)-N，N-二甲基吡咯烷-3-胺(中间产物4)的合成：
将100mg中间产物3(0.38mmol)溶解到2mL二恶烷溶液中，加入0.19mL DIEA(0.6mmol)，然后再加入44mg(0.38mmol)(R)-3-(二甲基氨基)吡咯烷。将所得溶液在室温搅拌16h，浓缩后通过硅胶柱纯化，得到中间产物4。产率61％。ESI-MS(m/z):338.19[M]+.
2)4-(3-氨基丙氧基)苯基吡唑衍生物的合成，其合成路线如下：
Figure BDA0003160739010000101
①化合物(R)-4-(7-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)苯酚(中间产物5)的合成：
向100mL单口瓶中加入中间产物4(150mg,0.45mmol)和30mL DCM，0℃滴加三溴化硼(550mg,2.3mmol)，反应10分钟后升至室温，继续搅拌反应8小时。将上述反应液分批加入到-78℃的100ml甲醇中，再加入1ml水，减压除去溶剂(水浴：45℃)，残余物经FLASH纯化(MeOH:DCM(0.1％NH3)＝0-20％，1h)，得到白色固体产物，即为(R)-4-(7-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)苯酚。产率83％。ESI-MS(m/z):324.30[M]+.
②化合物(R)-(3-(4-(7-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)苯氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(中间产物6)的合成：
向100mL的单口瓶中加入中间产物5(120mg，0.37mmol)，碳酸铯(360mg，1mmol)，叔丁基(溴丙基)氨基甲酸酯(180mg，0.8mmol)和10ml DMF，于室温搅拌反应6小时。反应完成后，加入20mL水稀释。经乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相。用无水硫酸钠干燥有机相，减压除去溶剂(水浴：45℃)，残余物经FLASH纯化(MeOH:DCM(0.1％NH3)＝0–5％，1h)，得到白色固体产物，即为(R)-(3-(4-(7-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)苯氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯。产率63％。ESI-MS(m/z):481.45[M]+.
③化合物(R)-1-(5-(4-(4-(3-氨基丙氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)-N，N-二甲基吡咯烷-3-胺(中间产物7)的合成
向100mL的单口瓶中加入中间产物6(110mg，0.23mmol)和10ml盐酸到乙酸乙酯中。室温搅拌反应3小时。反应结束后减压除去溶剂(水浴：45℃)，得到白色固体产物，即为(R)-1-(5-(4-(4-(3-氨基丙氧基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)-N，N-二甲基吡咯烷-3-胺。产率91％。ESI-MS(m/z):381.25[M]+.
3)小分子荧光探针ZX1的合成，合成路线如下所示：
Figure BDA0003160739010000111
向100mL的单口瓶中加入中间产物7(80mg，0.22mmol)，7-二乙氨基香豆素-3-羧酸(60mg,0.22mmol)，DIEA(N,N-二异丙基乙胺，120mg，1.1mmol)，T3P(50％EA)(140mg，0.22mmol)，得到混合物，将将以上混合物混合后加入到10ml DCM中，室温搅拌反应3小时。减压除去溶剂(水浴：45℃)，残余物经FLASH纯化(MeOH：DCM(0.1％NH3)＝0–5％，1h)，得到黄色固体产物。产率19％。
ESI-MS(m/z):647.31[M]+.1H NMR(400MHz,MeOD)δ(ppm):8.59(s,1H),7.93-7.91(m,3H),7.52-7.50(d,1H),7.09-7.06(d,2H),6.79-6.76(dd,1H),6.55(s,1H),6.35(s,1H),6.22(s,1H),4.39-4.34(m,1H),4.19-4.16(m,3H),4.04-3.94(m,2H),3.65-3.62(m,2H),3.54-3.48(m,4H),3.12-3.08(m,1H),2.46(s,6H),2.37-2.34(m,1H)，2.14-2.09(m,2H),2.05-1.97(m,1H),1.24-1.20(m,6H).
具有靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针的荧光光谱测定具体步骤如下：
1)待测物储备液的配制
分别准确称取上述制备的ZX1作为待测物，用DMSO溶解，配成1.0×10-2mol/L的储备液。
2)待测物荧光光谱的测定
应用F-4500型分光光度计测定上述储备液的荧光激发及发射光谱。根据储备液的浓度，以PBS(pH＝7.4)为溶剂，在测试前将待测物浓度配制为4.0×10-6mol/L、2.0×10- 6mol/L及1.0×10-6mol/L。测试条件：室温，样品池为1cm×1cm×4cm石英比色皿，狭缝宽度10nm，灵敏度为2。ZX1的荧光激发光谱(左)及发射光谱(右)如图1中(a)和(b)所示，其中横坐标为波长、纵坐标为相对荧光强度。由图1可知，随着浓度的增加，ZX1的荧光激发强度及发射强度均相应的增加。其最大激发波长为437nm，最大发射波长为482nm。
具有靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针的钙动员活性考察具体步骤如下：
1)将适宜浓度的MrgX2-HEK293细胞的悬液混匀后以每孔100μL接种于96孔板中。接种好的细胞在37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养24h，使其贴壁。
2)测定前，37℃水浴提前预热CIB缓冲液，贴壁后的细胞弃培养基，用预热后的CIB清洗2次。在避光的条件下，每孔加入100μL(5μM)的Fluo-3钙离子探针染料，放置于培养箱中孵育30min；
3)孵育结束后，弃去孵育液，加入CIB缓冲液洗涤2次后，每孔加入50μL CIB；
6)静置5min后，于荧光显微镜下，每孔依次加入50μL不同浓度的ZX1，测定加入前后细胞荧光强弱差异。
以(R)-ZINC-3573为阳性对照，通过钙动员实验考察ZX1与阳性药激活MrgX2受体的活性差异。结果如图2中(a)和(b)，阳性化合物和ZX1均可以引起MrgX2受体的激活从而引发胞内钙离子浓度的增加。然而，由于结构上的差异，导致两种化合物激活能力的差异，(R)-ZINC-3573和ZX1激活MrgX2引起钙动员的EC50值分别为0.622±0.12μM和2.609±0.588μM。表明，在(R)-ZINC-3573结构中引入荧光团后会导致其活性降低4倍左右。
具有靶向肥大细胞MrgX2受体的荧光探针的细胞成像研究的具体步骤如下：
1)将状态良好的人原代肥大细胞、MrgX2-HEK293细胞及HMC-1细胞离心后，用PBS稀释混匀，接种于共聚焦成像细胞培养皿(20000个/皿)，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养过夜。
2)拍照前，将ZX1用PBS稀释至相应浓度，加入细胞培养皿中，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中培养5min。培养结束后，置于激光共聚焦显微镜下(63×物镜)进行成像研究。
人原代肥大细胞MrgX2表达量较高，而肥大细胞系HMC-1细胞则基本无MrgX2表达。为考察ZX1对肥大细胞中MrgX2受体的靶向作用，以HMC-1细胞为阴性对照，开展了ZX1对人原代肥大细胞以及MrgX2转染的HEK293细胞的成像实验。结果如图3所示，可以看出ZX1荧光探针的背景荧光非常微弱，无需洗涤，即可实现对活细胞的成像。当探针结合到人原代肥大细胞以及MrgX2-HEK293细胞后，呈现出明亮的绿色荧光，而对HMC-1细胞则不能染色，证明了其对MrgX2受体的选择性。细胞成像实验结果表明，ZX1可作为一种环境敏感型的小分子荧光探针，实现对MrgX2受体的实时动态监测，从而用于其可视化的研究。
说明靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针能够用于MrgX2竞争性配体筛选中的应用。
本发明中香豆素类荧光发色团、荧光素类荧光发色团与氟化硼二吡咯醇酸中R1为氢原子、甲氧基或氮烷基；R2、R3为氯原子、溴原子或氟原子时，均可以保持对MrgX2受体的激动活性。
本发明中苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物保持对MrgX2受体的激动活性，而指示性的荧光是由荧光发色团发出的。本发明公开的荧光探针既保持了对MrgX2受体的激动活性，又具有一定的荧光性能。作为一种靶向工具分子，可与肥大细胞细胞直接作用，通过其荧光性能的变化，来进行受体的可视化研究及药物筛选研究。

Claims (10)

1.一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针，其特征在于，该探针结构式为；
Figure FDA0003160739000000011
其中，R代表含有羧基的荧光发色团，n代表2～5。
2.根据权利要求1所述的一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针，其特征在于，所述的含有羧基的荧光发色团为香豆素类荧光发色团、荧光素类荧光发色团或氟化硼二吡咯醇酸。
3.根据权利要求1所述的一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针，其特征在于，香豆素类荧光发色团、荧光素类荧光发色团与氟化硼二吡咯醇酸构式如下：
Figure FDA0003160739000000012
其中，R1为氢原子、甲氧基或氮烷基；R2、R3为氯原子、溴原子或氟原子。
4.一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，按照氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物∶荧光发色团∶丙基磷酸酐＝1∶1∶1的摩尔比，将氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物、含有羧基的荧光发色团以及丙基磷酸酐加入到DCM中进行反应，得到荧光探针；该荧光探针的结构式如下：
Figure FDA0003160739000000021
其中，R代表含有羧基的荧光发色团，n代表2～5。
5.根据权利要求4所述的一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物通过以下过程制得：
1)将甲氧基取代的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物溶于DDM后，加入三溴化硼，去甲基后得到(R)-4-(7-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)苯酚；
2)向(R)-4-(7-(3-(二甲基氨基)吡咯烷-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)苯酚中加入叔丁基(溴乙基)氨基甲酸酯、叔丁基(溴丙基)氨基甲酸酯、叔丁基(溴丁基)氨基甲酸酯或叔丁基(溴戊基)氨基甲酸酯进行反应，得到末端为叔丁基氨基甲酸酯取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物；
3)将末端为叔丁基氨基甲酸酯取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物在盐酸中，以乙酸乙酯为溶剂，脱去氨基保护，得到氨基取代的2～5个不同碳链长度的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物。
6.根据权利要求5所述的一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，甲氧基取代的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物通过以下过程制得：
1)4-甲氧基苯甲酰乙酰乙酯与3-氨基吡唑在乙酸溶液中反应，得到5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮；
2)以POCl3为氯代试剂，取代5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮的羰基，得到7-氯-5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶；
3)将7-氯-5-(4-甲氧基苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶溶解于二氧六环，加入DIEA后与(R)-3-(二甲基氨基)吡咯烷反应，得到甲氧基取代的苯基取代的吡唑并嘧啶类衍生物。
7.根据权利要求4所述的一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的含有羧基的荧光发色团为香豆素类荧光发色团、荧光素类荧光发色团或氟化硼二吡咯醇酸。
8.根据权利要求7所述的一种靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针，其特征在于，香豆素类荧光发色团、荧光素类荧光发色团与氟化硼二吡咯醇酸构式如下：
Figure FDA0003160739000000031
其中，R1为氢原子、甲氧基或氮烷基；R2、R3为氯原子、溴原子或氟原子。
9.一种如权利要求1所述的靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针在靶向识别肥大细胞MrgX2领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，靶向肥大细胞MrgX2受体的小分子荧光探针在用于MrgX2竞争性配体筛选中的应用。
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