CN113398244A - 一种治疗帕金森病的制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种治疗帕金森病的制剂及其应用。在本发明中，发明人通过构建高效感染多巴胺D2受体神经元的腺相关病毒，采用脑立体定位注射方式，将其注射至帕金森病小鼠模型纹状体区，腺相关病毒通过激活或持续激活Cdc42，可以显著改善PD相关或D2R敲除诱导的运动协调缺陷、运动迟缓和识别记忆损伤，从而具有较好的帕金森病治疗作用，对于帕金森病预防及治疗药物的开发具有重要意义。

Description

一种治疗帕金森病的制剂及其应用
技术领域
本发明属于生物医疗领域，具体涉及一种治疗帕金森病的制剂及其应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson's disease,PD)是目前发病率位居第二的神经系统退行性疾病主要病理特征是黑质致密部(Substantianigra pars compacta，SNpc)多巴胺能神经元大量丢失，进而纹状体(尤其是背侧纹状体)多巴胺(Dopamine，DA)水平显著降低，导致纹状体表达多巴胺D1受体的直接通路和表达多巴胺D2受体的间接通路功能的失衡，进而产生帕金森病运动和非运动功能障碍。
多巴胺受体激动剂是指可以直接作用于多巴胺受体的有疾病修饰作用的药物，主要作为配合用药使用，可延长疗效、减少剂末现象、推迟异动症的发生，是治疗不伴智能减退的早发型帕金森病患者的常用药。然而，相关技术中，多巴胺受体激动剂均具有较多的副作用，如引发上消化道症状(食欲减退、恶心、呕吐等)、循环系统症状和中枢神经症状等，而且临床上常见的多巴胺D2受体激动剂特异性较差(例如泰舒达、普拉克索)，因此，极大的限制了多巴胺受体激动剂的实际临床使用。
因此，开发一种作用效果显著、副作用小的治疗帕金森病的制剂对于帕金森病的改善和治疗具有极为重要的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出Cdc42激动剂或Cdc42激活试剂在制备治疗或预防帕金森病药物中的应用，本发明主要通过脑立体定位注射方式，将制备得到的高效感染多巴胺D2受体神经元的腺相关病毒注射至纹状体区，实现靶向干预纹状体区多巴胺D2受体神经元，有效激活多巴胺D2受体下游的Cdc42，从而靶向激活多巴胺D2受体信号，能够在治疗运动功能障碍的同时，改善认知功能，实现有效替代多巴胺D2受体激动剂治疗帕金森病的目的。
本发明的第一个方面，提供Cdc42蛋白在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
发明人通过行为学检测和帕金森病致病机理的研究，发现Cdc42的活化能够显著改善了PD相关的的运动协调缺陷、运动迟缓和识别记忆损伤，从而具有较好的帕金森病治疗作用，对于帕金森病预防及治疗药物的开发具有重要意义。
细胞分裂周期蛋白42(Cdc42蛋白)是一种癌细胞转移所需的关键蛋白，它能帮助癌细胞通过血液扩散到身体的其他部位。以这种蛋白为靶点，或将成为预防继发性癌症(癌症转移)的有效方法。但相关技术中，并未发现Cdc42蛋白与帕金森病的潜在关系。
在本发明中，发明人通过转棒实验发现，特异性敲除D2R后运动协调能力受损，并且在MPTP处理后小鼠受损的运动协调能力进一步恶化，而Cdc42的活化改善了D2R敲除诱导的运动协调缺陷。
在本发明中，发明人通过爬杆实验发现，特异性敲除D2R后会出现运动迟缓症状，且在MPTP处理后该小鼠症状进一步加重，而Cdc42的活化能够改善D2R敲除诱导的运动迟缓症状。
在本发明中，发明人通过新物体识别实验发现，特异性敲除D2R后会出现新物体识别记忆受损，Cdc42的活化改善了D2R敲除诱导的新物体识别记忆的损伤。
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述Cdc42蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，所述Cdc42蛋白的氨基酸序列为：
MQTIKCVVVGDGAVGKTCLLISYTTNKFPSEYVPTVFDNYAVTVMIGGEPYTLGLFDTAGQEDYDRLRPLSYPQTDVFLVCFSVVSPSSFENVKEKWVPEITHHCPKTPFLLVGTQIDLRDDPSTIEKLAKNKQKPITPEAAEKLARDLKAVKYVECSALTQKGLKNVFDEAILAALEPPEPKKSRRCVL(SEQ ID NO.1)。
本发明的第二个方面，提供编码Cdc42蛋白的核酸分子在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述编码Cdc42蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。
所述Cdc42核酸分子的核苷酸序列为：
5’-GACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAAATGCAGACAATTAAGTGTGTTGTTGTGGGCGATGGTGCTGTTGGTAAAACATGTCTCCTGATATCCTACACAACAAACAAATTTCCATCGGAATATGTACCGACTGTTTTTGACAACTATGCAGTCACAGTTATGATTGGTGGAGAACCATATACTCTTGGACTTTTTGATACTGCAGGGCTAGAGGATTATGACAGATTACGACCGCTGAGTTATCCACAAACAGATGTATTTCTAGTCTGTTTTTCAGTGGTCTCTCCATCTTCATTTGAAAACGTGAAAGAAAAGTGGGTGCCTGAGATAACTCACCACTGTCCAAAGACTCCTTTCTTGCTTGTTGGGACTCAAATTGATCTCAGAGATGACCCCTCTACTATTGAGAAACTTGCCAAGAACAAACAGAAGCCTATCACTCCAGAGACTGCTGAAAAGCTGGCCCGTGACCTGAAGGCTGTCAAGTATGTGGAGTGTTCTGCACTTACACAGAAAGGCCTAAAGAATGTATTTGACGAAGCAATATTGGCTGCCCTGGAGCCTCCAGAACCGAAGAAGAGCCGCAGGTGTGTGCTGCTATGA-3’(SEQ ID NO.1)；或
5’-GACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAAATGCAGACAATTAAGTGTGTTGTTGTGGGCGATGGTGCTGTTGGTAAAAATTGTCTCCTGATATCCTACACAACAAACAAATTTCCATCGGAATATGTACCGACTGTTTTTGACAACTATGCAGTCACAGTTATGATTGGTGGAGAACCATATACTCTTGGACTTTTTGATACTGCAGGGCAAGAGGATTATGACAGATTACGACCGCTGAGTTATCCACAAACAGATGTATTTCTAGTCTGTTTTTCAGTGGTCTCTCCATCTTCATTTGAAAACGTGAAAGAAAAGTGGGTGCCTGAGATAACTCACCACTGTCCAAAGACTCCTTTCTTGCTTGTTGGGACTCAAATTGATCTCAGAGATGACCCCTCTACTATTGAGAAACTTGCCAAGAACAAACAGAAGCCTATCACTCCAGAGACTGCTGAAAAGCTGGCCCGTGACCTGAAGGCTGTCAAGTATGTGGAGTGTTCTGCACTTACACAGAAAGGCCTAAAGAATGTATTTGACGAAGCAATATTGGCTGCCCTGGAGCCTCCAGAACCGAAGAAGAGCCGCAGGTGTGTGCTGCTATGA-3’(SEQ ID NO.2)。
其中，SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示序列中还包括3FLAG元件。
本发明的第三个方面，提供含有编码Cdc42蛋白的核酸分子的病毒或载体在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述载体为慢病毒载体，所述慢病毒包括腺病毒和腺相关病毒。
在本发明的一些优选实施方式中，所述慢病毒为腺相关病毒。
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，选择其他替代性的载体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示。
所述载体的核苷酸序列为：
5’-NNGGNANNNTCTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGATCCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTACTAGTGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAAATGCAGACAATTAAGTGTGTTGTTGTGGGCGATGGTGCTGTTGGTAAAACATGTCTCCTGATATCCTACACAACAAACAAATTTCCATCGGAATATGTACCGACTGTTTTTGACAACTATGCAGTCACAGTTATGATTGGTGGAGAACCATATACTCTTGGACTTTTTGATACTGCAGGGCTAGAGGATTATGACAGATTACGACCGCTGAGTTATCCACAAACAGATGTATTTCTAGTCTGTTTTTCAGTGGTCTCTCCATCTTCATTTGAAAACGTGAAAGAAAAGTGGGTGCCTGAGATAACTCACCACTGTCCAAAGACTCCTTTCTTGCTTGTTGGGACTCAAATTGATCTCAGAGATGACCCCTCTACTATTGAGAAACTTGCCAAGAACAAACAGAAGCCTATCACTCCAGAGACTGCTGAAAAGCTGGCCCGTGACCTGAAGGCTGTCAAGTATGTGGAGTGTTCTGCACTTACACAGAAAGGCCTAAAGAATGTATTTGACGAAGCAATATTGGCTGCCCTGGAGCCTCCAGAACCGAAGAAGAGCCGCAGGTGTGTGCTGCTATGATCTAGACCGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGNGTGNGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACNCCTGTCAGCTCNTTCCGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATGCACGGCGGACTCATCGCCGCCTGCNGCCGCTGCTGNCAGGGCTCGGCTGTTGGGNACTGACANNNNGGNNNTGTCNGGNNNCTGACGTTCNTTCATGCNGCTNNNCCNGGTGTTGCNNCNNNNTTCCTCNGCGCNCGGGAGCGNCCTTNTCTGC-3’(SEQ ID NO.4)；或
5’-NNNNNNNNNNNTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGATCCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTACTAGTGACTACAAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAAATGCAGACAATTAAGTGTGTTGTTGTGGGCGATGGTGCTGTTGGTAAAAATTGTCTCCTGATATCCTACACAACAAACAAATTTCCATCGGAATATGTACCGACTGTTTTTGACAACTATGCAGTCACAGTTATGATTGGTGGAGAACCATATACTCTTGGACTTTTTGATACTGCAGGGCAAGAGGATTATGACAGATTACGACCGCTGAGTTATCCACAAACAGATGTATTTCTAGTCTGTTTTTCAGTGGTCTCTCCATCTTCATTTGAAAACGTGAAAGAAAAGTGGGTGCCTGAGATAACTCACCACTGTCCAAAGACTCCTTTCTTGCTTGTTGGGACTCAAATTGATCTCAGAGATGACCCCTCTACTATTGAGAAACTTGCCAAGAACAAACAGAAGCCTATCACTCCAGAGACTGCTGAAAAGCTGGCCCGTGACCTGAAGGCTGTCAAGTATGTGGAGTGTTCTGCACTTACACAGAAAGGCCTAAAGAATGTATTTGACGAAGCAATATTGGCTGCCCTGGAGCCTCCAGAACCGAAGAAGAGCCGCAGGTGTGTGCTGCTATGATCTAGACCGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTNTCAGGCAACGTGNGTGNGTGCACTGTGTTTGCTGACGCACCCCCACTGGNNGGGCATGCACACTGTCAGCTCTTTCNGGACTTCGCTTTCCCCCTCCNATGCNNGCGACTCATCGCCNCTGCTGCNCTGCTGACAGGGCTCGCTGNNGNNCTGANANNNNGNGNTTNNCGGGANCTGACGTTCNTTCATGCNNNTCGNNNNNNNACNTGGANNCGGNNGGGAGTCCNTCGTNTANNNCNNNCGNNNCNNNN-3’(SEQ ID NO.5)。
本发明的第四个方面，提供表达编码Cdc42蛋白的核酸分子的重组菌或转基因细胞在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
其中，所述重组细胞为非植物细胞。
本发明的第五个方面，提供靶向上调Cdc42表达量的试剂的核酸分子在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
根据本发明的第五个方面，在本发明的一些实施方式中，所述靶向上调Cdc42表达量的试剂为过表达腺相关病毒载体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述过表达腺相关病毒载体为Lenti-CMV-EGFP-P2A-MCS-3FLAG-CDC42(L61)。
本发明的第六个方面，提供一种帕金森病治疗试剂，所述帕金森病治疗试剂中含有如下(1)～(5)任一项或其组合中所示物质：
(1)Cdc42蛋白；
(2)编码Cdc42蛋白的核酸分子；
(3)含有编码Cdc42蛋白的核酸分子的病毒或载体；
(4)表达编码Cdc42蛋白的核酸分子的重组菌或转基因细胞；
(5)靶向上调Cdc42表达量的试剂。
其中，所述转基因细胞为非植物细胞。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，(1)中所述Cdc42蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明的第六个方面，在本发明的一些实施方式中，(2)中所述Cdc42核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。
本发明的有益效果是：
1.在本发明中，发明人发现，在帕金森病小鼠模型中，通过激活或持续激活Cdc42，可以显著改善PD相关的的运动协调缺陷、运动迟缓和识别记忆损伤，从而具有较好的帕金森病治疗作用，对于帕金森病预防及治疗药物的开发具有重要意义。
2.在本发明中，通过构建背侧纹状体特异性多巴胺D2敲除小鼠和背侧纹状体多巴胺D2敲除同时持续激活Cdc42的转基因小鼠模型，可以发现Cdc42激动剂或Cdc42激活试剂能够显著改善了D2R敲除诱导的运动协调缺陷、运动迟缓症状以及新物体识别记忆的损伤。
附图说明
图1为本发明实施例中实验小鼠的不同基因型的电泳图；
图2为本发明实施例中的Cdc42-ca质粒构建图谱；
图3为CPu-Drd2KO小鼠的构建示意图；
图4为Drd2-Cre病毒荧光染色图，比例尺＝200μm；
图5为CPu-Drd2KO小鼠鉴定图，其中，A为脑切片荧光图像，B为注射与未注射腺相关病毒的荧光对比图；
图6为本发明实施例中的CPu-Drd2KO小鼠的构建示意图；
图7为CPu-Drd2KO小鼠CPu区的病毒表达示意图；
图8为本发明实施例中的行为学检测时间轴；
图9为本发明实施例中的Cdc42相关蛋白电泳图；
图10为本发明实施例中的GTPase pull-down和western blotting检测Cdc42蛋白活性变化；
图11为本发明实施例中的GTPase pull-down和Western Blotting实验的时间轴；
图12为本发明实施例中不同处理组小鼠在转棒实验中的转棒持续时间对比图；
图13为本发明实施例中不同处理组小鼠在爬杆实验中的转身时间(A)和下杆时间(B)对比图；
图14为本发明实施例中不同处理组小鼠在新物体试别实验中的新物体识别时间。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实验材料
在本发明下述实施例中，所用的小鼠均为8～14周龄的雄性小鼠，平均体重为22～26g，小鼠模型品系为B6.129S4(FVB)-Drd2tm1.1Mrub/J(Drd2loxp/loxp小鼠)，该小鼠模型购自美国杰克森实验室。
Cdc42蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
编码Cdc42蛋白的核酸分子(核苷酸序列如SEQ ID NO.2(N17)或3(L61)所示)
Drd2loxp/loxp小鼠的筛选
为了确保实验结果的准确性，对购买的Drd2loxp/loxp小鼠进行筛选，以确保Drd2loxp /loxp小鼠均为CPu(纹状体区)特异性多巴胺D2受体基因敲除小鼠(纯合子)。
具体步骤包括：
(1)小鼠PCR DNA模板提取：
从购买得到的实验小鼠剪取适量鼠耳组织，加入300μL Genotyping缓冲液，再加入终浓度为500μg/mL蛋白酶K，混合均匀，56℃水浴孵育过夜。由于消化组织的蛋白酶K会破坏PCR体系中的Taq酶，所以为了防止Taq酶被消化，在PCR扩增前，预先95℃水浴变性10min灭活蛋白酶K。随后，组织裂解物经过8000rpm离心5min，得到DNA模板，待用。对照组采用野生型小鼠(WT)。
(2)PCR扩增：
在本实施例，用于Drd2基因型鉴定的引物的核苷酸序列为：
上游引物Drd2-F：5’-TCTCCCTCATCTCTGGACTCA-3’(SEQ ID NO.6)；
下游引物Drd2-R：5’-TGGGAAAGGGCTACAGCA-3’(SEQ ID NO.7)。
PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0003089323380000081
PCR扩增程序为：
94℃，5min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，1min，循环40次；72℃，5min。4℃保存。
扩增产物使用琼脂糖凝胶电泳进行测定，结果如图1所示。
结果发现，WT小鼠的扩增产物条带大小为497bp，Drd2loxp/loxp纯合子小鼠扩增产物条带大小约为575bp。Drd2loxP/loxP杂合子小鼠在497bp和575bp位置同时出现基因条带，选取Drd2loxp/loxp纯合子小鼠用于下述实施例。
Drd2特异性启动子Cre(Drd2-Cre)腺相关病毒的构建
本实施例中的Drd2特异性启动子Cre腺相关病毒购自武汉枢密BrainVTA，Cdc42组成型活性(Cdc42-ca)质粒(质粒图谱如图2所示)由辛辛那提大学儿童医院郭甫坤教授惠赠，慢病毒包装由和元生物Obio Technology Corp完成，慢病毒包装相关试剂由上海和元生物有限公司提供。具体信息如表1所示。质粒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4(N17)或5(Cdc42-ca(L61))所示。
表1 Drd2特异性启动子Cre腺相关病毒相关信息
Figure BDA0003089323380000091
转基因小鼠的构建
(1)CPu区特异性D2R基因敲除(CPu-Drd2KO)小鼠的构建：
将上述实施例中的Drd2-Cre腺相关病毒(AAV)立体定位注射到Drd2loxP/loxP小鼠的CPu区中，具体注射步骤如下所示：
使用戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉小鼠，备皮后用75％酒精消毒手术区域皮肤，充分暴露颅骨，将小鼠固定于立体定位仪器中，通过微调小鼠头部位置，使其前囟和后囟位于同一水平面上。参照小鼠脑立体定位图谱，确定CPu区的坐标，按照定位钻孔。使用颅钻钻孔时，注意不能损伤脑组织。在本实施例中，CPu区的注射坐标为以前囟为0点，向后0.7mm，左右旁开1.7mm，向下深度3.2mm。通过Hamilton 5μL微量注射器(7000SER，32ga，低速注射)和输液泵(Cole-Parmer)，将Drd2-Cre腺相关病毒以0.1μL/min的速度微量注射进入小鼠双侧CPu区。为促进病毒扩散完全、防止回流，完成注射后，停针时间不少于5min，然后缓慢、匀速地退针。最后缝合皮肤，将小鼠放回笼内保温处理。为确保病毒的表达，术后给予小鼠三周时间恢复。以WT小鼠作为对照组。
通过上述操作，Cre/loxP重组，Cre催化Drd2loxP/loxP小鼠中loxp位点发生同源重组，导致CPu中D2R的功能缺失，从而获得特异性Drd2基因敲除(CPu-Drd2KO)小鼠(图3)。
(2)CPu-Drd2KO小鼠的验证：
采用免疫荧光染色对步骤(1)中构建的CPu-Drd2KO小鼠进行验证，检查是否构建成功，具体步骤如下：
处死小鼠，取小鼠脑组织制备脑组织切片，用0.01M PBS洗去脑片上残留的细胞保护液(7min×3遍)，用0.1％PBST(磷酸盐吐温缓冲液)打孔(1h)，0.1M甘氨酸室温孵育(35min)，0.01M PBS洗去多余甘氨酸(7min×3遍)，封闭液(0.5g BSA，50ml 0.01M PBS，150μLTriton-x100)室温孵育(1h)。一抗稀释于封闭液中(兔抗D2 receptor抗体1：50)，4℃孵育过夜。然后用0.01M的0.1％PBST洗去残留的一抗(7min×3遍)，二抗稀释于封闭液中(抗兔Alexa Fluor 488 1：200)，室温孵育2小时，0.1％PBST洗涤(7min×3遍)。Hoechst染色液染色10min，0.01M PBS(3min)贴片于防脱载玻片上，缓冲甘油(纯无荧光甘油9份+Ph＝9.2的0.2M碳酸盐缓冲液1份)封片，采用Leica正置显微镜或Leica倒置激光共聚焦显微镜采集图像。
同时，运用荧光共定位技术，进一步验证Drd2启动子特异性敲除CPu中D2R。
结果如图4和5所示，根据荧光图像显示，在CPu-Drd2KO小鼠CPu区病毒感染区域，多巴胺D2受体表达显著降低，说明构建得到的CPu-Drd2KO小鼠CPu区多巴胺D2受体基因被成功敲除，CPu-Drd2KO小鼠构建成功。
(3)CPu区特异性D2R基因敲除同时激活Cdc42(CPu-Drd2KO+Cdc42-ca)小鼠的构建：
将上述实施例中的Drd2-Cre腺相关病毒(AAV)和CMV启动子驱动的GFP标记的Cdc42持续活化(Cdc42-ca)质粒，同时立体定位注射到Drd2loxP/loxP小鼠的CPu区中，通过Cre/loxP重组，Cre催化Drd2loxP/loxP小鼠中loxp位点发生同源重组，导致CPu中D2R的功能缺失，从而获得特异性Drd2基因敲除同时激活Cdc42(CPu-Drd2KO+Cdc42-ca)小鼠。
(4)CPu-Drd2KO+Cdc42-ca小鼠的验证：
采用免疫荧光染色对步骤(3)中构建的CPu-Drd2KO+Cdc42-ca小鼠进行验证，检查是否构建成功，具体步骤如下：
处死小鼠，取小鼠脑组织制备脑组织切片，用0.01M PBS洗去脑片上残留的细胞保护液(7min×3遍)，用0.1％PBST打孔(1h)，0.1M甘氨酸室温孵育(35min)，0.01M PBS洗去多余甘氨酸(7min×3遍)，封闭液(0.5g BSA，50ml 0.01M PBS，150μl Triton-x100)室温孵育(1h)。一抗稀释于封闭液中(兔抗GFP抗体1：200；鸡抗mCherry抗体1：200)，4℃孵育过夜。然后用0.01M的0.1％PBST洗去残留的一抗(7min×3遍)，二抗稀释于封闭液中(抗兔AlexaFluor 488 1：200；抗鸡Alexa Fluor 594 1：200)，室温孵育2小时，0.1％PBST洗涤(7min×3遍)。0.01M PBS(3min)贴片于防脱载玻片上，缓冲甘油(纯无荧光甘油9份+pH＝9.2的0.2M碳酸盐缓冲液1份)封片，采用Leica正置显微镜或Leica倒置激光共聚焦显微镜采集图像。
操作流程图如图6所示。
结果如图7所示，根据荧光图像显示，Cdc42-ca和AAV-Drd2-cre-mCherry在CPu区表达良好，说明CPu-Drd2KO+Cdc42-ca小鼠构建成功。
(5)PD模型小鼠的制备：
本实施例使用亚急性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)制备经典的PD模型小鼠。MPTP通过血脑屏障后会被胶质细胞摄取，然后转化为有毒性的MPP+，MPP+经多巴胺能神经元轴突末梢，通过突触前膜多巴胺转运体摄取，逆向运输到黑质多巴胺能神经元胞体，最终导致黑质多巴胺能神经元大量死亡。基于MPTP能诱发黑质多巴胺能神经元死亡的特性，从而可以将其用于PD模型小鼠的制备。
选择对MPTP敏感的8～16周龄的C57BL/6J小鼠，体重在22～26g之间。
称取适量的MPTP盐酸盐溶于0.9％无菌生理盐水，每天对小鼠腹腔内注射30mg/kg，连续5天，制备亚急性MPTP处理的PD模型小鼠。对照组采用等量0.9％无菌生理盐水注射。
小鼠CPu区Cdc42-GTPase活性测定
采用Western-blotting方法测定实验小鼠CPu区Cdc42-GTPase活性。
根据上述实施例中的实验方案(流程图如图8所示)，利用GST pull-down测定上述不同组别(对照组野生型正常小鼠、CPu-Drd2KO小鼠、CPu-Drd2KO+Cdc42-ca小鼠)小鼠注射MPTP最后一针48h后，CPu区Cdc42的活性。利用Western bloting测定注射MPTP最后一针48h后，CPu区Cdc42及下游相关效应分子的表达。
具体步骤如下：
(1)小鼠断颈取脑，将小鼠脑组织迅速转移至盛有0.01M PBS缓冲液的培养皿中，用眼科镊迅速分离出小鼠CPu区组织块，分别装入含500μL的高镁离子蛋白裂解液MLB(25mMN-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸(PH 7.5)，150mM氯化钠，1％诺纳德P-40，10％甘油，25mM氟化钠，10mM氯化镁，1mM乙二胺四乙酸，1mM正钒酸钠，10μg/mL亮抑酶肽，10μg/mL抑肽酶)的EP管中。为减缓组织块离蛋白的降解变性，可将试管置于4℃环境中保存。
(2)将超声细胞破碎仪设置为超声每4s停9s，强度为21％，超声探头温度设置为4℃，将组织块超声至澄清。超声过程中，EP管水浴在冰水混合物中，防止超声发热降解组织中的活性蛋白。
(3)将超声后的组织蛋白浑浊液在4℃环境中混匀30min，14000rpm 4℃离心15min。取上清。
(4)使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度：
根据试剂盒说明书，将标准蛋白粉末配制成25mg/mL的标准蛋白溶液，备用。取适量25mg/mL标准蛋白，用Ripa裂解液稀释成终浓度为0.5mg/ml标准蛋白溶液。将标准蛋白按0、1、2、4、8、12、16、20μL的体积加入到96孔板的标准品孔中，分别加入20、19、18、16、12、8、4、0μL的Ripa裂解液，孔中液体补足到20μL。取1μL待测蛋白原液至孔中，加入19μL Ripa裂解液。配制适量BCA工作液，并充分混匀备用。各待测孔中加入200μL BCA工作液，37℃反应30min。用562nm的波长测定光密度。根据标准蛋白曲线计算出蛋白原液中蛋白浓度。
(5)GST pull-down样品的制备：
取350μL蛋白原液，加入3.5μL Rac/Cdc42 Assay Reagent(PAK-1PBD结合的琼脂糖珠)，用枪头轻轻吹打，4℃水平摇床上混匀1h。14000rpm 4℃离心7min，弃上清，收集琼脂糖珠，再用MLB轻轻冲洗(重复三遍)。然后加入30μL的2×Loading buffer，混匀，95℃变性5min。8000rpm离心5min，收集上层液体，-80℃储存备用。
(6)Western blotting样品的制备：
根据步骤(5)中BSA测得的蛋白原液浓度，将蛋白原液分别加入不同体积的Ripa裂解液，使其调齐到统一浓度。按照蛋白原液的体积，分别加入4倍体积的5×Loadingbuffer，混匀后，95℃变性5min。8000rpm离心5min，-80℃储存备用。
(7)蛋白检测：
使用SDS-PAGE凝胶检测蛋白，曝光时加入适量ECL发光液，浸润孵育PVDF膜数秒，采用Meta-Morph成像系统采集GST pull-down或Western-blot信号。
结果如图9和10所示。
在CPu区中D2R的敲除后，给与MPTP注射48小时后和3周后，CPu-Drd2KO小鼠CPu区中Cdc42活性改变情况如图9所示，与对照组(生理盐水处理)相比，在给与MPTP注射48小时后和3周后，CPu-Drd2KO小鼠的CPu区Cdc42活性均显著降低(P<0.001)，而Cdc42总蛋白表达水平无显著改变(P>0.05)(图10)。从而可以说明，在PD中，Cdc42活性水平的降低受D2R调控。
效果验证实验
以WT小鼠和CPu-Drd2KO小鼠为对照，CPu-Drd2KO+Cdc42-ca为实验组展示Cdc42激动剂对PD的治疗作用。
将实验小鼠进行分组并进行药物，处理动物分组及药物处理如下：
LV-EGFP+Saline组：WT小鼠CPu区立体定位注射空白对照LV-EGFP慢病毒，恢复21天后，腹腔注射等体积的无菌生理盐水，连续5天。
LV-EGFP+MPTP组：WT小鼠CPu区立体定位注射空白对照LV-EGFP慢病毒，恢复21天后，腹腔注射MPTP，连续5天。
CPu-Drd2KO mice+Saline：Drd2loxP/loxP小鼠CPu区立体定位注射腺相关病毒Drd2-Cre，恢复21天后，腹腔注射等体积的无菌生理盐水，连续5天。
CPu-Drd2KO mice+MPTP：Drd2loxP/loxP小鼠CPu区立体定位注射腺相关病毒Drd2-Cre，恢复21天后，腹腔注射MPTP，连续5天。
CPu-Drd2KO mice+Cdc42-ca+Saline：Drd2loxP/loxP小鼠CPu区立体定位注射腺相关病毒Drd2-Cre和Cdc42-ca慢病毒，恢复21天后，腹腔注射等体积的无菌生理盐水，连续5天。
CPu-Drd2KO mice+Cdc42-ca+MPTP：Drd2loxP/loxP小鼠CPu区立体定位注射腺相关病毒Drd2-Cre和Cdc42-ca慢病毒，恢复21天后，腹腔注射MPTP，连续5天。
对各组小鼠进行行为学检测，以用于明确MPTP制备的PD模型小鼠中表型的改变(Cdc42激活的治疗效果)。行为学实验按照对小鼠影响最小到最大的顺序进行(流程顺序如图11所示)，在实验之前，各组小鼠需要先熟悉环境和实验人员，适应实验时间。
(1)转棒实验(Overall rotarod performance，ORP)：
转棒实验是评估小鼠运动协调和平衡的测试。
将每只小鼠置于5rpm的低速旋转杆上适应10min。适应期间落下的小鼠将被重新放回杆上继续适应。转棒实验由从12rpm至26rpm的8个转速(间隔为2rpm)构成，分别测试并记录小鼠从旋转杆上掉落的时间。每个转速的最长持续时间和实验间的间隔均为150s。根据Rozas梯形方法计算曲线下面积，评估每组的ORP值。
结果如图12所示。
在转棒实验中，与LV-EGFP+Saline组小鼠相比，LV-EGFP+MPTP组小鼠ORP分数显著降低(P<0.001)。与LV-EGFP+MPTP组小鼠相比，CPu-Drd2KO+MPTP组小鼠ORP分数无显著差异(P>0.05)，但在给予Cdc42激活后，可逆转或减缓MPTP诱导的CPu-Drd2KO小鼠ORP分数的降低(P<0.001)。与LV-EGFP+Saline组小鼠相比，CPu-Drd2KO+Saline组小鼠ORP分数出现显著降低(P<0.05)，而给予Cdc42激活后，可逆转或减缓CPu-Drd2KO小鼠ORP分数的降低(P<0.05)。以上结果提示，特异性敲除D2R后，会使小鼠的运动协调能力受损，并且在MPTP处理后，小鼠受损的运动协调能力进一步恶化，Cdc42的活化可以有效改善了D2R敲除诱导的运动协调缺陷。
(2)爬杆实验(Pole test)：
爬杆实验是用于评估纹状体多巴胺耗尽后MPTP诱导的PD模型小鼠运动迟缓的有效方法。
将小鼠头向上放置在用纱布粘贴的垂直杆(直径1cm；高度55cm)上，小鼠会转头向下并向下爬到地板上。该实验分为两天连续进行：第一天，连续五次训练小鼠以适应该实验，第二天开始正式测试，记录小鼠转头向下的转向时间和向下爬到地板的时间。滑下、跌落以及不能学会完成本实验的小鼠将不被用于后期统计分析。
结果如图13所示。
在爬杆实验中，与LV-EGFP+Saline组小鼠相比，LV-EGFP+MPTP组小鼠转向(P<0.001)和落地时间(P<0.001)显著延长。与LV-EGFP+MPTP组小鼠相比，CPu-Drd2KO+MPTP组小鼠转向(P>0.05)和落地时间(P>0.05)未发生显著变化，在给予Cdc42激活后，可逆转或缓解MPTP诱导的CPu-Drd2KO小鼠转向(P<0.05)和落地时间(P<0.001)的延长。与LV-EGFP+Saline组小鼠相比，CPu-Drd2KO+Saline组小鼠转向(P>0.01)和落地时间(P>0.001)未发生显著变化，而给予Cdc42激活后，可逆转或缓解CPu-Drd2KO小鼠转向(P>0.05)和落地时间(P>0.001)的延长。以上结果提示，特异性敲除D2R后，小鼠会出现运动迟缓症状，且在MPTP处理后，会进一步加重小鼠运动迟缓症状，而Cdc42的活化能够改善D2R敲除诱导的运动迟缓症状。
(3)新物体识别实验(Novel object recognition，NOR)：
新物体识别实验主要基于小鼠区分新物体和熟悉物体的能力。该实验分为三天连续进行：在获取认知阶段期间，将相同材料的两个物体对称地放置在实验箱(50×50×40cm)中，并让小鼠在实验箱中自由探索5min。1h后，用一个新物体取代实验箱中的一个物体，另一个物体不变，然后将小鼠再次放入实验箱中自由探索并跟踪5min。在每次探索后，彻底清洁物体和场地，以防止气味线索带来干扰。在距离物体小于1cm的位置嗅探或用鼻子触摸物体都被定义为对物体的探索。优先考虑探索新物体反映了对先前探索过的物体的成功识别，即新物体识别记忆。通过比较两个物体的探索时间来评估小鼠的新物体识别能力。
结果如图14所示。在NOR实验中，与LV-EGFP+Saline组小鼠相比，LV-EGFP+MPTP组小鼠对新物体探索时间显著减少(P<0.001)。与LV-EGFP+MPTP组小鼠相比，CPu-Drd2KO+MPTP组小鼠对新物体探索时间无显著影响(P>0.05)，给予Cdc42激活后，可逆转或缓解MPTP诱导的CPu-Drd2KO小鼠对新物体探索时间的减少(P<0.01)。与LV-EGFP+Saline组小鼠相比，CPu-Drd2KO+Saline组小鼠对新物体探索时间减少(P<0.001)，而给予Cdc42激活后，可逆转或缓解CPu-Drd2KO小鼠对新物体探索时间的减少(P<0.001)。以上结果提示，在特异性敲除D2R后，小鼠对新物体识别记忆受损，Cdc42的活化改善了D2R敲除诱导的新物体识别记忆的损伤。
综上所述，Cdc42的活化改善了D2R敲除诱导的类似帕金森病的运动和非运动损伤，因此，可以得出：Cdc42激动剂或激活试剂具有治疗帕金森病的能力。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> 一种治疗帕金森病的制剂及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 190
<212> PRT
<213> Cdc42
<400> 1
Met Gln Thr Ile Lys Cys Val Val Val Gly Asp Gly Ala Val Gly Lys
1 5 10 15
Thr Cys Leu Leu Ile Ser Tyr Thr Thr Asn Lys Phe Pro Ser Glu Tyr
20 25 30
Val Pro Thr Val Phe Asp Asn Tyr Ala Val Thr Val Met Ile Gly Gly
35 40 45
Glu Pro Tyr Thr Leu Gly Leu Phe Asp Thr Ala Gly Gln Glu Asp Tyr
50 55 60
Asp Arg Leu Arg Pro Leu Ser Tyr Pro Gln Thr Asp Val Phe Leu Val
65 70 75 80
Cys Phe Ser Val Val Ser Pro Ser Ser Phe Glu Asn Val Lys Glu Lys
85 90 95
Trp Val Pro Glu Ile Thr His His Cys Pro Lys Thr Pro Phe Leu Leu
100 105 110
Val Gly Thr Gln Ile Asp Leu Arg Asp Asp Pro Ser Thr Ile Glu Lys
115 120 125
Leu Ala Lys Asn Lys Gln Lys Pro Ile Thr Pro Glu Ala Ala Glu Lys
130 135 140
Leu Ala Arg Asp Leu Lys Ala Val Lys Tyr Val Glu Cys Ser Ala Leu
145 150 155 160
Thr Gln Lys Gly Leu Lys Asn Val Phe Asp Glu Ala Ile Leu Ala Ala
165 170 175
Leu Glu Pro Pro Glu Pro Lys Lys Ser Arg Arg Cys Val Leu
180 185 190
<210> 2
<211> 648
<212> DNA
<213> Cdc42
<400> 2
gactacaagg atgacgatga caaggattac aaagacgacg atgataagga ctataaggat 60
gatgacgaca aaatgcagac aattaagtgt gttgttgtgg gcgatggtgc tgttggtaaa 120
acatgtctcc tgatatccta cacaacaaac aaatttccat cggaatatgt accgactgtt 180
tttgacaact atgcagtcac agttatgatt ggtggagaac catatactct tggacttttt 240
gatactgcag ggctagagga ttatgacaga ttacgaccgc tgagttatcc acaaacagat 300
gtatttctag tctgtttttc agtggtctct ccatcttcat ttgaaaacgt gaaagaaaag 360
tgggtgcctg agataactca ccactgtcca aagactcctt tcttgcttgt tgggactcaa 420
attgatctca gagatgaccc ctctactatt gagaaacttg ccaagaacaa acagaagcct 480
atcactccag agactgctga aaagctggcc cgtgacctga aggctgtcaa gtatgtggag 540
tgttctgcac ttacacagaa aggcctaaag aatgtatttg acgaagcaat attggctgcc 600
ctggagcctc cagaaccgaa gaagagccgc aggtgtgtgc tgctatga 648
<210> 3
<211> 648
<212> DNA
<213> Cdc42
<400> 3
gactacaagg atgacgatga caaggattac aaagacgacg atgataagga ctataaggat 60
gatgacgaca aaatgcagac aattaagtgt gttgttgtgg gcgatggtgc tgttggtaaa 120
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<210> 4
<211> 1233
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(2)
<223> n is a, c, g, or t
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<223> n is a, c, g, or t
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<223> n is a, c, g, or t
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<222> (1089)..(1089)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1097)..(1097)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1117)..(1118)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1120)..(1121)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1126)..(1126)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1128)..(1131)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1133)..(1133)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1135)..(1135)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1138)..(1139)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1145)..(1145)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1155)..(1155)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1163)..(1165)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1169)..(1175)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1178)..(1178)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1183)..(1184)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1188)..(1189)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1198)..(1198)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1203)..(1203)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1206)..(1208)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1210)..(1212)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1215)..(1217)
<223> n is a, c, g, or t
<221> misc_feature
<222> (1219)..(1222)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 5
nnnnnnnnnn ntctcggcat ggacgagctg tacaagggat ccggaagcgg agctactaac 60
ttcagcctgc tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc ctggacctac tagtgactac 120
aaggatgacg atgacaagga ttacaaagac gacgatgata aggactataa ggatgatgac 180
gacaaaatgc agacaattaa gtgtgttgtt gtgggcgatg gtgctgttgg taaaaattgt 240
ctcctgatat cctacacaac aaacaaattt ccatcggaat atgtaccgac tgtttttgac 300
aactatgcag tcacagttat gattggtgga gaaccatata ctcttggact ttttgatact 360
gcagggcaag aggattatga cagattacga ccgctgagtt atccacaaac agatgtattt 420
ctagtctgtt tttcagtggt ctctccatct tcatttgaaa acgtgaaaga aaagtgggtg 480
cctgagataa ctcaccactg tccaaagact cctttcttgc ttgttgggac tcaaattgat 540
ctcagagatg acccctctac tattgagaaa cttgccaaga acaaacagaa gcctatcact 600
ccagagactg ctgaaaagct ggcccgtgac ctgaaggctg tcaagtatgt ggagtgttct 660
gcacttacac agaaaggcct aaagaatgta tttgacgaag caatattggc tgccctggag 720
cctccagaac cgaagaagag ccgcaggtgt gtgctgctat gatctagacc gcgtctggaa 780
caatcaacct ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc 840
tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg 900
tatggctttc attttctcct ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt 960
gtggcccgtt ntcaggcaac gtgngtgngt gcactgtgtt tgctgacgca cccccactgg 1020
nngggcatgc acactgtcag ctctttcngg acttcgcttt ccccctccna tgcnngcgac 1080
tcatcgccnc tgctgcnctg ctgacagggc tcgctgnngn nctganannn ngngnttnnc 1140
ggganctgac gttcnttcat gcnnntcgnn nnnnnacntg ganncggnng ggagtccntc 1200
gtntannncn nncgnnncnn nn 1222
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctccctcat ctctggactc a 21
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgggaaaggg ctacagca 18

Claims (9)

1.Cdc42蛋白在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
2.编码Cdc42蛋白的核酸分子在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述编码Cdc42蛋白的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。
4.含有编码Cdc42蛋白的核酸分子的病毒或载体在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述载体为慢病毒载体，所述慢病毒包括腺病毒和腺相关病毒，所述慢病毒优选为腺相关病毒。
6.表达编码Cdc42蛋白的核酸分子的重组菌或转基因细胞在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
7.靶向上调Cdc42表达量的试剂在如下(1)～(4)中任一项中的应用；
(1)制备治疗或预防帕金森病药物；
(2)制备改善运动协调相关试剂；
(3)制备改善运动迟缓相关试剂；
(4)制备改善识别记忆损伤修复试剂。
8.一种帕金森病治疗试剂，其特征在于，所述帕金森病治疗试剂中含有如下(1)～(5)任一项或其组合中所示物质：
(1)Cdc42蛋白；
(2)编码Cdc42蛋白的核酸分子；
(3)含有编码Cdc42蛋白的核酸分子的病毒或载体；
(4)表达编码Cdc42蛋白的核酸分子的重组菌或转基因细胞；
(5)靶向上调Cdc42表达量的试剂。
9.根据权利要求8所述的帕金森病治疗试剂，其特征在于，(1)中所述Cdc42蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)中所述Cdc42核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。
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