CN113391060A - 一种血液样本处理剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血液样本处理剂、血液样本处理液以及用于测定血管紧张素的血液样本的前处理方法。本发明从试剂选择、浓度确定、配方优化、应用等方面进行研究，提供一种血液样本处理剂，适用于血管紧张素I、血管紧张素II免疫测定的样本前处理，使得样本采集与其他常规静脉采血流程一致。处理试剂中各组分协同作用，兼具抗凝剂、络合剂、酶抑制剂的功效，常温稳定，对光不敏感，水中溶解度大。材料混合后不发生反应。加入血液样本后不破坏蛋白结构，不影响后续免疫反应。本发明进一步研究了试剂比例，确定了使用浓度，结合各自溶解度，形成处理剂配制方法和使用方法，最大限度减少对血浆样本基质效应的影响，使免疫测定结果与对比方法一致。

Description

一种血液样本处理剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种血液样本处理试剂，以及利用所述试剂测定血液样本中血管紧张素的含量的方法。
背景技术
高血压是常见病和高发病，引起的心脑血管疾病并发症是我国居民首位死亡原因。遗传或不明原因引起的原发性高血压占比90％以上，通过长期口服降压药控制治疗。占比5-10％的继发性高血压有较明确的病因，其中内分泌性高血压可通过检测一些指标进行鉴别诊断，继而采取有针对性的治疗手段对因治疗达到治愈或缓解的目的。常用的高血压五项指标是血浆肾素活性(PRA)或肾素(Renin)，血浆血管紧张素II(AII)，血浆醛固酮(ALD)，血浆皮质醇(Cor)，血浆促肾上腺皮质激素(ACTH)。
肾素底物在血浆肾素作用下，形成一种10肽血管紧张素I(Angiotensin I，AI)，因而血浆肾素活性(PRA)可通过测定血管紧张素I产生的速率来表示。血管紧张素I被血管紧张素转化酶(ACE)作用，转化为8肽血管紧张素II(angiotensin II，AII)，AII被血浆和组织中的ACE2、氨基肽酶和中性内肽酶(NEP)酶解，生成七肽(2～8)的血管紧张素III(angiotensin III，AIII)，AIII再失去一个氨基酸残基而生成六肽(3～8)的血管紧张素IV(angiotensin IV，AIV)。上述的血管紧张素家族成员还可在氨基肽酶、羧基肽酶和肽链内切酶的作用下继续降解为无活性的小肽片段。
为阻断样本中待测AI、AII的转化，保持浓度相对恒定达到准确测定PRA和AII的目的，在采集的血液样本中及时加入络合剂、酶抑制剂等作为样本前处理是AI、AII免疫检测试剂常采用的方法。如北方所碘[125I]血管紧张素I放射免疫分析药盒、碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒中均配备三瓶试剂：0.30M EDTA，0.32M二巯基丙醇，0.34M 8-羟基喹啉硫酸盐，按照每毫升血加10ul EDTA溶液、5ul二巯基丙醇溶液、10ul 8-羟基喹啉硫酸盐溶液的比例加入采血管中进行采血；IBL公司Angiotensin I(PRA)ELISA、DioSorin公司GammaCoat Plasma Renin Activity 125I RIA Kit用EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)阻止AI生成和降解，IBL公司Angiotensin II ENZYME IMMUNOASSAY KIT用混合抑制剂(EDTA，p-hydroxy-mercuribenzoic acid，抑肽酶等)防止AII生成和降解。但上述方法都有其弊端，如二巯基丙醇遇水易分解，在空气中易被氧化；8-羟基喹啉硫酸盐见光分解；PMSF有毒性，且需乙醇溶解；抑肽酶活性易损失；故上述试剂皆需冷藏保存，有的需避光，各试剂单组分储存，血样采集后还需一步加入抑制剂的操作，这使得实验室无法有效的规范临床科室采血流程，易造成检测前质量控制失控。
本发明为克服上述不足，从试剂选择、浓度确定、配方优化、应用等方面进行研究，提供另外一种血液样本处理试剂，适用于血管紧张素I、血管紧张素II免疫测定的样本前处理，使得样本采集与其他常规静脉采血流程一致。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中血液样品处理方法的弊端易造成检测前质量控制失控的问题，提供一种用于血管紧张素I、血管紧张素II免疫测定的样本前处理方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
本发明进一步公开了血液样本处理剂以及用于测定血管紧张素的血液样本的前处理方法。
本发明从试剂选择、浓度确定、配方优化、应用等方面进行研究，提供另外一种血液样本处理剂，适用于血管紧张素I、血管紧张素II免疫测定的样本前处理，使得样本采集与其他常规静脉采血流程一致。
本发明公开了一种血液样本处理试剂，包括试剂A、试剂B和试剂C，其中试剂A为乙二胺四乙酸二钾，试剂B为3-巯基缬氨酸，试剂C为乙二胺四亚甲基叉磷酸钠。
优选的，所述处理试剂由试剂A、试剂B和试剂C组成，其中试剂A为乙二胺四乙酸二钾，试剂B为3-巯基缬氨酸，试剂C为乙二胺四亚甲基叉磷酸钠。
本发明公开了一种血液样本处理剂，将所述的处理试剂溶于水制备获得。
优选的，所述试剂A的浓度为0.231mol/L，试剂B的浓度为0.25mol/L，试剂C的浓度为0.25mmol/L。
本发明公开了一种血液样本处理剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将试剂A溶于水，搅拌溶解，所述试剂A为乙二胺四乙酸二钾；
(2)进一步添加试剂B，搅拌溶解后即可，所述试剂B为3-巯基缬氨酸；
(3)加入试剂C，搅拌溶解后即可，所述试剂C为乙二胺四亚甲基叉磷酸钠。
优选的，所述试剂A的浓度为0.231mol/L，试剂B的浓度为0.25mol/L，试剂C的浓度为0.25mmol/L。
本发明公开了一种用于测定血管紧张素的血液样本的前处理方法，包括将所述血液样本与所述的处理剂混合的步骤。
优选的，每毫升血液中加入20uL所述处理剂。
本发明公开了一种采血管，其特征在于所述采血管喷涂所述的处理剂。
优选的，3mL规格采血管喷涂60uL。
优选的，5mL规格采血管喷涂100uL。
本发明公开了一种血管紧张素检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的处理剂和/或所述的采血管。
本发明公开了所述的试剂、所述的处理剂以及所述的采血管在测定血管紧张素的血液样本预处理中的应用。
在上述本发明的制备方法中，充分研究了材料的特性，试剂A、试剂B、试剂C均具有络合作用，具备抗凝血功能，常温稳定，对光不敏感，水中溶解度大。各试剂混合后不发生反应。加入血液样本后不破坏蛋白结构，不影响后续免疫反应。
在上述本发明的制备方法中，还充分研究了材料比例配合，确定了使用浓度，结合各自溶解度，形成预处理剂配制方法和使用方法，最大限度减少对血浆样本基质效应的影响，使免疫测定结果与对比方法一致。
本发明进一步公开了血液样本处理剂以及用于测定血管紧张素的血液样本的前处理方法。本发明从试剂选择、浓度确定、配方优化、应用等方面进行研究，提供另外一种血液样本处理试剂，适用于血管紧张素I、血管紧张素II免疫测定的样本前处理，使得样本采集与其他常规静脉采血流程一致。其中，试剂A、试剂B、试剂C均具有络合作用，具备抗凝血功能，常温稳定，对光不敏感，水中溶解度大。材料混合后不发生反应。加入血液样本后不破坏蛋白结构，不影响后续免疫反应。
本发明进一步研究了材料比例配合，确定了使用浓度，结合各自溶解度，形成预处理剂配制方法和使用方法，最大限度减少对血浆样本基质效应的影响，使免疫测定结果与对比方法一致。
具体实施方式
以下结合附表对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1血液样本处理剂的配制
根据制备配方计算好1L所需试剂A乙二胺四乙酸二钾、试剂B 3-巯基缬氨酸和试剂C乙二胺四亚甲基叉磷酸钠的数量，将称取的试剂A倒入烧杯中，加入0.8L纯化水，搅拌溶解后加入称好的试剂B，搅拌溶解，加入试剂C，转入1L容量瓶。用少量纯化水分次洗涤烧杯后转入容量瓶，定容至1L。所述试剂A的浓度为0.231mol/L，试剂B的浓度为0.25mol/L，试剂C的浓度为0.25mmol/L。
实施例2血液样本的处理
往离心管中加入60uL处理剂，抽取静脉血3毫升加到上述有处理剂的离心管中，上下颠倒数次，混匀后即刻放入冰水浴中或2～8℃冰箱中，0～2小时内离心分离血浆。
或者，将处理剂喷涂于采血管内，按照真空采血管制备流程制备含处理剂的真空采血管。3mL规格喷涂60uL，5mL规格喷涂100uL。用此真空采血管按常规方法采血后上下颠倒数次，混匀后即刻放入冰水浴中或2～8℃冰箱中，0～2小时内离心分离血浆。
实施例3不同处理方法处理的相同患者血浆样本中血管紧张素I含量的测定
北方所碘[125I]血管紧张素I放射免疫分析药盒，国药准字S10950162；
对照血浆：往离心管加入试剂盒中0.30M EDTA 30ul，0.32M二巯基丙醇15ul，0.34M 8-羟基喹啉硫酸盐30ul，抽取静脉血3毫升加到上述有预处理剂的离心管中，上下颠倒数次，混匀后即刻放入冰水浴中或2～8℃冰箱中，0～2小时内离心分离血浆。
本发明处理剂血浆：按照实施例2制备方法获得的血浆。
1.测定原理
采用竞争法原理，标准或样品中的AI和加入的125I-AI共同与一定量的特异性抗体产生竞争性免疫反应。125I-AI与抗体的结合量与标准或样品中AI的含量呈一定的函数关系。用免疫分离剂(PR)将结合部分(B)与游离部分(F)分离后，测定结合部分的放射性计数，计算相应结合率B/B0。并使用log-logit数据处理模式，计算待测样品中AI的含量。
血浆肾素活性(PRA)的测定，实际上是测定血浆中血管紧张素I的产生速率。即同一血浆样品取双份，一份在2-8℃直接与抗体反应，测其AI的浓度，称为对照管；另一份则在37℃温育一段时间后，再让其与抗体反应，测其AI浓度称作测定管。测定管的AI浓度减去对照管的AI浓度除以温育时间，则为单位时间内AI的产生速率，称之为肾素活性。
2.测定步骤
检测步骤按照说明书进行，使用12×75mm试管。具体操作如下表1：
表1血管紧张素I放射免疫分析药盒操作程序表 单位：μl
Figure BSA0000242384760000061
4.测定结果如下表2：
表2血管紧张素I放射免疫分析药盒结果
Figure BSA0000242384760000062
Figure BSA0000242384760000071
对两组样本的测定值进行T检验，P值为0.126，大于0.05，无显著性差异，测值相关系数0.9952，可以认为本发明提供的预处理剂适用于血管紧张素I免疫测定的血液样本前处理。
实施例4不同处理方法处理的相同患者血浆样本中血管紧张素II含量的测定
1.主要材料
北方所碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒，国药准字S10950163；
对照血浆：往离心管加入试剂盒中0.30M EDTA 30ul，0.32M二巯基丙醇15ul，0.34M 8-羟基喹啉硫酸盐30ul，抽取静脉血3毫升加到上述有预处理剂的离心管中，上下颠倒数次，混匀后即刻放入冰水浴中或2～8℃冰箱中，0～2小时内离心分离血浆。
本发明处理剂血浆：按照实施例2制备方法获得的血浆。
2.测定原理
采用竞争法原理，标准或样品中的AII和加入的125I-AII共同与一定量的特异性抗体产生竞争性免疫反应。125I-AII与抗体的结合量与标准或样品中AII的含量呈一定的函数关系。用免疫分离剂(PR)将结合部分(B)与游离部分(F)分离后，测定结合部分的放射性计数，计算相应结合率B/B0。并使用log-logit数据处理模式，计算待测样品中AII的含量。
3.测定步骤
检测步骤按照说明书进行，使用12×75mm试管。具体操作如下表3：
表3血管紧张素II放射免疫分析药盒操作程序表 单位：μl
Figure BSA0000242384760000081
4.测定结果如表4：
表4血管紧张素II放射免疫分析药盒结果
Figure BSA0000242384760000082
Figure BSA0000242384760000091
对两组样本的测定值进行T检验，P值为0.403，大于0.05，无显著性差异，测值相关系数0.9951，可以认为本发明提供的预处理剂适用于血管紧张素II免疫测定的血液样本前处理。
实施例5不同组合处理剂选择
用北方所碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒检测同一批血样，用试剂盒中样本处理方式处理血样作为参比，不同组合处理剂处理血样作为待测，与参比血样测值做偏差计算，结果见表5。
试剂A浓度在EDTA抗凝管行业标准规定浓度范围内；试剂B随浓度增高测值偏差缩小；加入0.15mM试剂C，偏差进一步缩小；试剂C浓度0.25mM时，10#处理剂和11#处理剂所用样本偏差均在10％以内，选择10#处理剂成本更低。
表5不同组合处理剂样本检测结果
Figure BSA0000242384760000101
实施例6不同检测方法对于本发明处理剂处理血浆的血管紧张素I检测影响
用北方所碘[125I]血管紧张素I放射免疫分析药盒和北方所血管紧张素I(AI)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)检测同一批血样，分别用各自试剂盒中样本处理方式处理血样得到血浆，统计两个系统测值的相关系数。
1.主要材料
北方所碘[125I]血管紧张素I放射免疫分析药盒，国药准字S10950162；
北方所血管紧张素I(AI)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)
放射免疫分析药盒检测用血浆样本：按照实施例3中“对照血浆”制备方法获得的血浆。
磁微粒化学发光免疫分析法测定试剂盒检测用血浆样本：按照实施例2制备方法获得的血浆。
2.测定原理
碘[125I]血管紧张素I放射免疫分析药盒测定原理见实施例3。
血管紧张素I(AI)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)测定原理如下：运用磁微粒化学发光免疫检测技术，采用竞争法检测血浆样本AI含量，样本中的AI抗原与吖啶酯标记的AI抗原竞争结合抗AI多克隆抗体，之后加入偶联驴抗兔IgG多克隆抗体的磁微粒捕获AI抗体，形成磁微粒二抗-AI抗体-吖啶酯AI抗原的免疫复合物，然后外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗，直接进入样本测量室，仪器自动注入预激发液和激发液，检测发光强度(RLU)。AI浓度与RLU成一定的比例关系，测定仪自动拟合计算AI的浓度。
3.测定步骤
碘[125I]血管紧张素I放射免疫分析药盒测定步骤见实施例3。
血管紧张素I(AI)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)测定步骤如下：往反应杯中加入100μL样本和20μL抗体试剂，37℃8分钟，加20μL磁微粒试剂和20μL发光试剂，37℃12分钟，洗3次，加入200μL预激发液和200μL激发液，发光仪测量发光值。拟合方式：LogX-LogY双对数五参数。
4.测定结果如下表6：
表6放免和发光检测系统检测AI结果
Figure BSA0000242384760000121
Figure BSA0000242384760000131
两种检测系统分别检测两个样本处理方式获得的血浆，测值相关系数0.9939，高于0.9750，证明本发明预处理剂应用于血管紧张素I(AI)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)样本处理可获得AI准确测值。
实施例7不同检测方法对于本发明处理剂处理血浆的血管紧张素II检测影响
用北方所碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒和北方所血管紧张素II(AII)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)检测同一批血样，分别用各自试剂盒中样本处理方式处理血样得到血浆，统计两个系统测值的相关系数。
1.主要材料
北方所碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒，国药准字S10950163；
北方所血管紧张素II(AII)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)
放射免疫分析药盒检测用血浆样本：按照实施例4中“对照血浆”制备方法获得的血浆。
磁微粒化学发光免疫分析法测定试剂盒检测用血浆样本：按照实施例3制备方法获得的血浆。
2.测定原理
碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒测定原理见实施例4。
血管紧张素II(AII)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)测定原理如下：运用磁微粒化学发光免疫检测技术，采用竞争法检测血浆样本AII含量，样本中的AII抗原与吖啶酯标记的AII抗原竞争结合抗AII多克隆抗体，之后加入偶联驴抗兔IgG多克隆抗体的磁微粒捕获AII抗体，形成磁微粒二抗-AII抗体-吖啶酯AII抗原的免疫复合物，然后外加磁场沉淀，去掉上清液，用洗液清洗，直接进入样本测量室，仪器自动注入预激发液和激发液，检测发光强度(RLU)。AII浓度与RLU成一定的比例关系，测定仪自动拟合计算AII的浓度。
3.测定步骤
碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒测定步骤见实施例4。
血管紧张素II(AII)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)测定步骤如下：往反应杯中加入100μL样本和50μL抗体试剂，37℃8分钟，加20μL磁微粒试剂和50μL发光试剂，37℃10分钟，洗3次，加入200μL预激发液和200μL激发液，发光仪测量发光值。拟合方式：LogX-LogY双对数五参数。
4.测定结果如下表7：
表7放免和发光检测系统检测AII结果
Figure BSA0000242384760000141
Figure BSA0000242384760000151
两种检测系统分别检测两个样本处理方式获得的血浆，测值相关系数0.9875，高于0.9750，证明本发明预处理剂应用于血管紧张素II(AII)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)样本处理可获得AII准确测值。
用本发明方法研制的预处理剂对血液样本进行预处理，成功应用于碘[125I]血管紧张素I放射免疫分析药盒、碘[125I]血管紧张素II放射免疫分析药盒、血管紧张素I(AI)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)、血管紧张素II(AII)测定试剂盒(磁微粒化学发光免疫分析法)，可简化样本处理流程，制备含此预处理剂的真空采血管，使得样本采集与其他常规静脉采血流程一致。
本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种血液样本处理试剂，其特征在于，所述处理试剂包括试剂A、试剂B和试剂C，其中试剂A为乙二胺四乙酸二钾，试剂B为3-巯基缬氨酸，试剂C为乙二胺四亚甲基叉磷酸钠。
2.根据权利要求1所述的血液样本处理试剂，其特征在于，所述处理试剂由试剂A、试剂B和试剂C组成，其中试剂A为乙二胺四乙酸二钾，试剂B为3-巯基缬氨酸，试剂C为乙二胺四亚甲基叉磷酸钠。
3.一种血液样本处理剂，其特征在于，将权利要求1或2任一权利要求所述的处理试剂溶于水制备获得。
4.根据权利要求3所述的处理剂，其特征在于，所述试剂A的浓度为0.231mol/L，试剂B的浓度为0.25mol/L，试剂C的浓度为0.25mmol/L。
5.一种血液样本处理剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将试剂A溶于水，搅拌溶解，所述试剂A为乙二胺四乙酸二钾；
(2)进一步添加试剂B，搅拌溶解后即可，所述试剂B为3-巯基缬氨酸；
(3)加入试剂C，搅拌溶解后即可，所述试剂C为乙二胺四亚甲基叉磷酸钠。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述试剂A的浓度为0.231mol/L，试剂B的浓度为0.25mol/L，试剂C的浓度为0.25mmol/L。
7.一种用于测定血管紧张素的血液样本的前处理方法，其特征在于，包括将所述血液样本与权利要求3-4任一权利要求所述的处理剂混合的步骤，优选的，每毫升血液中加入20uL所述处理剂。
8.一种采血管，其特征在于，所述采血管喷涂权利要求3-4任一权利要求所述的处理剂，优选的，3mL规格采血管喷涂60uL，5mL规格采血管喷涂100uL。
9.一种血管紧张素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3-4任一权利要求所述的处理剂和/或权利要求8所述的采血管。
10.权利要求1-2任一权利要求所述的试剂、权利要求3-4任一权利要求所述的处理剂以及权利要求8所述的采血管在测定血管紧张素的血液样本预处理中的应用。
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