CN113390986B - 一种甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物分析技术领域，具体公开一种甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法。所述检测方法包括以下步骤：配制供试品溶液和对照品溶液；采用液相色谱‑质谱联用法对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行检测，所述液相色谱的色谱条件为：采用C18色谱柱，以体积浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以体积浓度为0.1％的甲酸的甲醇溶液为流动相B，梯度洗脱；所述质谱采用ESI离子源，正离子检测模式。本发明提供的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，能够快速、准确地对甲磺酸沙非胺原料药中的毒性杂质进行检测，符合ICH M7的指导原则。

Description

一种甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，尤其涉及一种甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法。
背景技术
帕金森是仅次于阿尔茨海默症的第二大常见老年慢性神经退化疾病，好发于中老年人。胺氧化酶B(MAO-B)抑制剂可以作为单药治疗早期的帕金森患者，或者被添加到晚期帕金森患者的治疗方案中以能更好地控制症状并减少所需的其他帕金森病药物的剂量。甲磺酸沙非胺又称甲磺酸沙芬酰胺，其活性成分沙芬酰胺是一种α-氨基酰胺衍生物，是一种高选择性、高效可逆的第三代胺氧化酶B(MAO-B)抑制剂，不仅可以减少多巴胺的降解，以控制大脑中多巴胺的浓度，还可以通过阻断钠通道和钙通道，进而抑制谷氨酸刺激释放。临床实践证明甲磺酸沙芬酰胺具有很好的安全谱以及类似于同类其他药物的疗效。甲磺酸沙芬酰胺的英文名称为Safinamide Mesilate，化学名称为(S)-2-[[4-[(3-氟苄基)氧基]氨基]丙酰胺甲磺酸盐，结构式如下：
Figure BDA0003092831120000011
在现有工艺合成甲磺酸沙非胺原料药的过程中可能会产生残留的痕量甲磺酸类基因毒性杂质：(S)-4-(((1-氨基-1-氧丙烷-2-甲基)氨基)甲基)苯甲磺酸酯(杂质O)，其化学结构如下所示：
Figure BDA0003092831120000021
按照ICH M7指导原则，甲磺酸沙非胺原料药中杂质O的可接受限度＝TTC×1000/MDD＝15.0ppm(ng/mg)，其中TTC表示毒理学关注阈值，其数值为1.5μg/天；MDD表示最大每日剂量，其数值为100mg/天。
目前常规液相色谱检测方法的灵敏度并不能满足甲磺酸沙非胺原料药中杂质O的检测要求，而且目前尚见能够满足该要求的检测方法的相关文献报道。因此，开发一种能够实现对痕量毒性杂质：(S)-4-(((1-氨基-1-氧丙烷-2-甲基)氨基)甲基)苯甲磺酸酯的检测方法，对甲磺酸沙芬酰胺的质量控制具有重要意义。
发明内容
针对现有对(S)-4-(((1-氨基-1-氧丙烷-2-甲基)氨基)甲基)苯甲磺酸酯的检测灵敏度不能满足原料中杂质的含量要求的问题，本发明提供一种甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
步骤一、配制供试品溶液和对照品溶液；
对照品溶液的配制：取(S)-4-(((1-氨基-1-氧丙烷-2-甲基)氨基)甲基)苯甲磺酸酯对照品，用溶剂配制成对照品溶液；
供试品溶液的配制：取甲磺酸沙非胺样品，用溶剂配制成供试品溶液；
步骤二、采用液相色谱-质谱联用法对上述供试品溶液和上述对照品溶液进行检测，所述液相色谱的色谱条件为：采用C18色谱柱，以体积浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以体积浓度为0.1％的甲酸的甲醇溶液为流动相B，梯度洗脱；所述质谱采用ESI离子源，正离子检测模式，其中所述基因毒性杂质的定量离子为：母离子为273.1m/z，子离子为228.1m/z，碰撞电压为15V，去簇电压为60V，所述基因毒性杂质的定性离子为：母离子为273.1m/z，子离子为185.1m/z，碰撞电压为26V，去簇电压为100V。
相对于现有技术，本发明提供的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，具有以下优势：
对磺酸酯类基因毒性杂质的测定，除了需要克服灵敏度、选择性以及样品基质干扰外，也要考虑克服磺酸酯的高反应活性，因此本申请采用液相色谱-质谱联用检测甲磺酸沙非胺原料药中的(S)-4-(((1-氨基-1-氧丙烷-2-甲基)氨基)甲基)苯甲磺酸酯(杂质O)的残留量，并达到了较高的灵敏度、精密度和线性关系等，符合ICH M7的指导原则。
本发明提供的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点，能够快速、准确地对甲磺酸沙非胺原料药中的毒性杂质进行检测。
优选地，上述梯度洗脱的程序如下：
0min-3min，4-6％流动相B，96-94％流动相A；
3min-5min，4-6％→20％流动相B，96-94％→80％流动相A；
5min-9min，20％→100％流动相B，80％→0％流动相A；
9min-11min，100％流动相B，0％流动相A；
11min-11.1min，100％→5％流动相B，0％→95％流动相A；
11.1min-16min，5％流动相B，95％流动相A。
进一步优选的，上述梯度洗脱的程序如下：
0min-3min，5％流动相B，95％流动相A；
3min-5min，5％→20％流动相B，95％→80％流动相A；
5min-9min，20％→100％流动相B，80％→0％流动相A；
9min-11min，100％流动相B，0％流动相A；
11min-11.1min，100％→5％流动相B，0％→95％流动相A；
11.1min-16min，5％流动相B，95％流动相A。
优选地，上述质谱的离子源参数为：离子源气体1压力为55psi，离子源气体2压力为55psi，气帘气压力为40psi，离子源温度为550℃，喷雾电压为5500V，摄入电压为10V，碰撞室射出电压为10V。
优选地，流速为0.55-0.65mL/min，柱温为27℃-33℃。
进一步优选地，流速为0.6mL/min，柱温为30℃。
优选地，上述色谱柱的规格为4.6mm×100mm×3um。
优选地，上述色谱柱的型号为YMC Triart C18色谱柱。
优选地，上述液相色谱的进样体积为10μL。
优选地，上述对照品溶液的浓度为15ng/mL。
优选地，上述供试品溶液的浓度为0.9-1.1mg/mL。
优选的，上述溶剂为甲醇。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1提供的空白溶液的高效液相色谱图；
图2是本发明实施例1提供的对照品溶液的高效液相色谱图；
图3是本发明实施例1提供的供试品溶液的高效液相色谱图；
图4是本发明实施例1提供的混合溶液的高效液相色谱图；
图5是本发明实施例3提供的线性回归曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供一种甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
步骤一、配制供试品溶液、对照品溶液、空白溶液和混合溶液；
上述对照品溶液的配制方法为：以(S)-4-(((1-氨基-1-氧丙烷-2-甲基)氨基)甲基)苯甲磺酸酯为对照品，以甲醇为溶剂，得到浓度为305.45ng/mL贮备溶液，然后对上述贮备溶液进行稀释得到浓度为15ng/mL对照品溶液。
上述供试品溶液的配制方法为：取供试品10mg置于10mL容量瓶中，采用甲醇溶解并稀释值刻度，得到浓度为1mg/mL的供试品溶液。
空白溶液为甲醇；
上述混合溶液的配制方法为：取供试品10mg置于10mL容量瓶中，加入浓度305.45ng/mL对照品贮备溶液0.5mL，加入甲醇溶解并稀释值刻度，得到混合溶液；
步骤二、采用液相色谱-质谱联用法对上述空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和混合溶液进行检测，记录谱图，其色谱图分别如图1、图2、图3和图4所示，上述液相色谱的色谱条件为：采用YMC Triart C18色谱柱(4.6mm×100mm×3um)，以体积浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以体积浓度为0.1％的甲酸的甲醇溶液为流动相B，流速为0.6mL/min，柱温为30℃，梯度洗脱，进样体积为10μL；所述质谱采用ESI离子源，正离子检测模式，所述基因毒性杂质的定量离子为：母离子为273.1m/z，子离子为228.1m/z，碰撞电压为15V，去簇电压为60V，所述基因毒性杂质的定性离子为：母离子为273.1m/z，子离子为185.1m/z，碰撞电压为26V，去簇电压为100V，其离子源参数为：离子源气体1压力为55psi，离子源气体2压力为55psi，气帘气压力为40psi，离子源温度为550℃，喷雾电压为5500V，摄入电压为10V，碰撞室射出电压为10V；其中梯度洗脱的程序如下：
0min-3min，5％流动相B；
3min-5min，5％-20％流动相B；
5min-9min，20％-100％流动相B；
9min-11min，100％流动相B；
11min-11.1min，100％-5％流动相B；
11.1min-16min，5％流动相B。
从2和图4中可以看出，在保留时间为4.79min时出现了了对照品(S)-4-(((1-氨基-1-氧丙烷-2-甲基)氨基)甲基)苯甲磺酸酯的色谱峰，且色谱峰分离度良好。
从图1-图4中可以看出，甲醇溶剂和甲磺酸沙非胺原料药对杂质O的检测无干扰，说明本发明提供的液相色谱-质谱联用法专属性良好。
实施例2检测限和定量限
检测限：将实施例1制备的浓度为15ng/mL对照品溶液采用甲醇逐级定量稀释，然后采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图，按信噪比不低于3:1，得到检测限，结果见表1。
定量限：将实施例1制备的浓度为15ng/mL对照品溶液采用甲醇逐级定量稀释，然后采用液相色谱-质谱联用法对定量限溶液进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图，按信噪比不低于10:1，得到定量限，结果见表1。
表1检测限、定量限检测结果
Figure BDA0003092831120000061
平行制备定量限溶液6份，然后采用液相色谱-质谱联用法对定量限溶液进行检测，结果见表2，由此测定的定量限具有优异的精密度。
表2定量限重复性检测结果
Figure BDA0003092831120000071
实施例3线性
将实施例1制备的浓度为305.45ng/mL对照品贮备溶液，采用甲醇稀释，分别得到浓度为1.53ng/mL、3.05ng/mL、9.16ng/mL、15.27ng/mL、21.38ng/mL、30.54ng/mL的线性溶液。
采用液相色谱-质谱联用法对线性溶液进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，记录谱图信息，然后以对照品杂质O的浓度(ng/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程，结果见表3，线性图见图5。从图5中可以看出，杂质O在1.53～30.54ng/mL的浓度范围内线性关系良好。
表3杂质O线性试验结果
Figure BDA0003092831120000072
实施例4重复性
取同一批样品，按照实施例1所述甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法中的供试品制备方法制备6份供试品溶液，在实施例1所述的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法的色谱、质谱条件下进行重复性考察，结果如表4所示。检测结果显示，所测定6份供试品溶液均未检出，表明本申请提供的检测方法的重复性良好。
表4杂质O重复性试验结果
Figure BDA0003092831120000073
Figure BDA0003092831120000081
实施例5准确度
杂质O的准确度试验以回收率(％)表示，分别取杂质O 9ppm、15ppm、21ppm限度水平(相当于杂质限度60％、100％和140％)作为回收率测试样品。
配制对照品贮备溶液：取杂质O适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制得到浓度为305.45ng/mL的杂质O对照品贮备溶液。
对照品溶液：精密量取对照品贮备溶液液0.5mL，置于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得。
回收率9ppm溶液：取供试品10mg，置于10mL容量瓶中，加入上述对照品贮备溶液0.3mL，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
回收率15ppm溶液：取供试品10mg，置于10ml容量瓶中，加入上述对照品贮备溶液0.5mL，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
回收率21ppm溶液：取供试品10mg，置于10ml容量瓶中，加入上述对照品贮备溶液0.7mL，用甲醇稀释至刻度线，摇匀，即得，平行制备三份。
采用液相色谱-质谱联用法对上述制备的对照品溶液和回收率溶液进行检测，回收率结果见表5，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述。
根据以下公式计算回收率：
回收率(％)＝(测得量-原有量)/理论加入量×100％
表5杂质O回收率检测结果
Figure BDA0003092831120000082
试验结论：杂质O在9ppm-21ppm浓度范围内，回收率在96.73％-101.45％之间，平均回收率为：99.42％，相对标准偏差(RSD)为1.83％。
实施例6精密度
取实施例1所制备的对照品溶液，并采用液相色谱-质谱联用法对上述制备的对照品溶液进行检测，重复进样6次，每次进样10μL，检测结果见表6，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述。
表6精密度实验结果
Figure BDA0003092831120000091
上表的数据表明：对照品溶液连续测定6次，杂质O峰面积的RSD为1.74％，表明本发明的方法有较好的精密度。
实施例7耐用性
将实施例1制备的浓度为15ng/mL的对照品溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，液相色谱和质谱的具体条件如实施例1所述，并记录其峰面积。
流速调整：将实施例1制备的浓度为15ng/mL的对照品溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，流速为0.65mL/min，液相色谱和质谱的其他条件与实施例1的相同，并记录其峰面积。
流速调整：将实施例1制备的浓度为15ng/mL的对照品溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，流速为0.55mL/min，液相色谱和质谱的其他条件与实施例1的相同，并记录其峰面积。
柱温调整：将实施例1制备的浓度为15ng/mL的对照品溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，柱温为33℃，液相色谱和质谱的其他条件与实施例1的相同，并记录其峰面积。
柱温调整：将实施例1制备的浓度为15ng/mL的对照品溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，柱温为27℃，液相色谱和质谱的其他条件与实施例1的相同，并记录其峰面积。
梯度洗脱流动相B初始值调整：将实施例1制备的浓度为15ng/mL的对照品溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，流动相B初始值为4％，液相色谱和质谱的其他条件与实施例1的相同，并记录其峰面积。
梯度洗脱流动相B初始值调整：将实施例1制备的浓度为15ng/mL的对照品溶液采用液相色谱-质谱联用法进行检测，流动相B初始值为6％，液相色谱和质谱的其他条件与实施例1的相同，并记录其峰面积。
上述检测试验如表7所示，从表7中可以看出，微调色谱条件对对杂质O检测无影响，表明本发明提供的检测方法耐用性良好。
表7耐用性试验结果
方法条件 峰面积
实施例1检测条件 82329
流速0.65mL/min 80347
流速0.55mL/min 89499
柱温33℃ 85154
柱温27℃ 81503
B相初始值4％ 81643
B相初始值6％ 82494
平均值 83281
RSD(％) 3.74
实施例8中间精密度
取同一批样品，按照实施例1所述甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法中的供试品制备方法制备6份供试品溶液，采用与实施例4的不同的检测日期，不同的检测者，在实施例1所述甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法的色谱、质谱条件下进行检测，结果如表8所示。检测结果显示，所测定6份供试品溶液均未检出，与重复性结果一致，表明本申请提供的检测方法的中间精密度性良好。
表8中间精密度试验结果
Figure BDA0003092831120000111
实施例9稳定性
取实施例1制备的供试品溶液和对照品溶液，分别放置0、2、4、6、8小时后，采用实施例1所述甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法的色谱、质谱条件进行检测，每次进样10μL，考察其峰面积，计算其RSD(％)，试验结果如下表9和表10所示。从表9-10中可以看出，供试品溶液在室温条件下，放置8小时，杂质O均未检出；对照品溶液在室温条件下，放置8小时，峰面积的RSD为3.84％(≤10％)，表明上述供试品溶液和对照品溶液的稳定性均良好。
表9对照品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003092831120000112
表10供试品溶液稳定性试验结果
Figure BDA0003092831120000113
实施例10样品检测
按照实施例1提供的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，检测7批甲磺酸沙非酰胺原料样品中的杂质O含量。结果见表10。
表10样品检测结果
批次 含量(ng/mg)
1 未检出
2 未检出
3 未检出
4 未检出
5 未检出
6 未检出
7 未检出
从表10中可以看出，此次7批甲磺酸沙非酰胺原料药样品中杂质O含量均未检出，符合限度规定(≤15ppm)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
步骤一、配制供试品溶液和对照品溶液；
对照品溶液的配制：取(S)-4-(((1-氨基-1-氧丙烷-2-甲基)氨基)甲基)苯甲磺酸酯对照品，其化学结构如下所示，用溶剂配制成对照品溶液；
Figure FDA0003497321510000011
供试品溶液的配制：取甲磺酸沙非胺样品，用溶剂配制成供试品溶液；
步骤二、采用液相色谱-质谱联用法对所述供试品溶液和所述对照品溶液进行检测，所述液相色谱的色谱条件为：
采用C18色谱柱，以体积浓度为0.1％的甲酸水溶液为流动相A，以体积浓度为0.1％的甲酸的甲醇溶液为流动相B，梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序如下：
0min-3min，4-6％流动相B，96-94％流动相A；
3min-5min，4-6％→20％流动相B，96-94％→80％流动相A；
5min-9min，20％→100％流动相B，80％→0％流动相A；
9min-11min，100％流动相B，0％流动相A；
11min-11.1min，100％→5％流动相B，0％→95％流动相A；
11.1min-16min，5％流动相B，95％流动相A；
所述质谱采用ESI离子源，正离子检测模式，其中所述基因毒性杂质的定量离子为：母离子为273.1m/z，子离子为228.1m/z，碰撞电压为15V，去簇电压为60V，所述基因毒性杂质的定性离子为：母离子为273.1m/z，子离子为185.1m/z，碰撞电压为26V，去簇电压为100V。
2.如权利要求1所述的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述质谱的离子源参数为：离子源气体1压力为55psi，离子源气体2压力为55psi，气帘气压力为40psi，离子源温度为550℃，喷雾电压为5500V，摄入电压为10V，碰撞室射出电压为10V。
3.如权利要求1所述的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：流速为0.55-0.65mL/min，柱温为27℃-33℃。
4.如权利要求1所述的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述色谱柱规格为4.6mm×100mm×3um。
5.如权利要求1所述的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述色谱柱的型号为YMC Triart C18色谱柱。
6.如权利要求1所述的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述液相色谱的进样体积为10μL。
7.如权利要求1所述的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述对照品溶液的浓度为15ng/mL。
8.如权利要求1所述的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述供试品溶液的浓度为0.9-1.1mg/mL。
9.如权利要求1～8任一项所述的甲磺酸沙非胺中基因毒性杂质的检测方法，其特征在于：所述溶剂为甲醇。
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