CN113388680B

CN113388680B - 上皮性卵巢癌靶点ret及其在诊断和治疗中的作用

Info

Publication number: CN113388680B
Application number: CN202010178705.8A
Authority: CN
Inventors: 卢媛; 王跃祥; 管路遥
Original assignee: Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Current assignee: Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University
Priority date: 2020-03-14
Filing date: 2020-03-14
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2040-03-14
Also published as: CN113388680A

Abstract

本发明提供了RET在卵巢癌诊断和治疗中的应用。具体地，本发明提供了RET突变蛋白或其编码序列，或相应的检测试剂的用途，它们被用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒被(a)用于检测卵巢癌和/或其易感性；或(b)用于预后。本发明还提供了相应的用于诊断卵巢癌的诊断试剂盒以及用于治疗所述卵巢癌的药物组合物。本发明的研究表明：RET的上皮性卵巢癌患者中存在多种与上皮性卵巢癌关系最为密切的RET基因突变。此外，凡德他尼等药物通过抑制RET及其下游MAPK信号通路的激活，可有效抑制卵巢癌。

Description

上皮性卵巢癌靶点RET及其在诊断和治疗中的作用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地，涉及RET在卵巢癌诊断和治疗中的应用。

背景技术

卵巢癌是发达国家女性妇科癌症死亡率最高的疾病，同时也是女性所有癌症死亡病因第四位的疾病；在发展中国家女性妇科癌症死亡率中仅次于宫颈癌位列第二，同时也是我国妇科癌症死亡率最高的疾病。

由于缺乏典型症状和有效的筛查手段，超过70％的患者在初次诊断时即已达晚期，晚期卵巢癌患者的标准治疗方案为肿瘤细胞减灭术辅以术后铂类为基础的联合化疗，虽然多数患者对初始化疗敏感，但多数病人会在初始治疗结束后18个月内复发，且在经历多次复发后最终也会发展为化疗耐药，而一旦耐药，由于对二线化疗药物的反应率很低，病人中位生存期只有1年左右。因此，复发及化疗耐药是影响卵巢癌患者生存率的一个重要因素，亟需在临床治疗中探索新的治疗策略。

因此，本领域急需开发能够早期筛查和有效治疗上皮性卵巢癌的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种早期筛查和有效治疗上皮性卵巢癌的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种RET突变蛋白或其编码序列、或用于检测 RET突变蛋白或其编码序列的检测试剂的用途，它们被用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒被(a)用于检测卵巢癌和/或其易感性；或(b)用于预后。

在另一优选例中，所述卵巢癌选自下组：上皮性卵巢癌、性索-间质肿瘤、生殖细胞肿瘤、转移性肿瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。

在另一优选例中，所述RET突变蛋白相较野生型RET蛋白，存在选自下组的突变：D58N、C197S、A641T、R693H、G727V、A750T、A750V、G751V、K780N、 N879D、N879S、R959W、A1105G、K1107N、或其组合。

在另一优选例中，所述的野生型RET蛋白是人的野生型RET蛋白。

在另一优选例中，所述RET突变蛋白相较野生型RET蛋白，存在选自下组的突变：R693H、A750T、A750V、或其组合。

在另一优选例中，所述RET突变蛋白相较野生型RET蛋白，存在选自下组的突变：R693H、A750T、或其组合。

在另一优选例中，所述RET突变蛋白为RET-R693H或RET-A750T。

在另一优选例中，所述RET-R693H突变是指相较野生型RET蛋白，所述RET 突变蛋白的氨基酸序列的第693位由精氨酸R突变为组氨酸H。

在另一优选例中，所述RET-R693H突变是指相较野生型RET基因，所述RET 基因核酸序列的第2077位由鸟嘌呤核苷酸G突变为腺嘌呤核苷酸A。

在另一优选例中，所述RET-A750T突变是指相较野生型RET蛋白，所述RET 突变蛋白的氨基酸序列的第750位由丙氨酸A突变为苏氨酸T。

在另一优选例中，所述RET-A750T突变是指相较野生型RET基因，所述RET 基因核酸序列的第2249位由胞嘧啶核苷酸C突变为胸腺嘧啶核苷酸T。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒中，所述RET突变蛋白被用作阳性对照。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒中，所述RET突变蛋白的编码序列(或多核苷酸)被用作阳性对照。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒中，所述检测试剂为检测RET突变蛋白的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的RET突变蛋白的编码序列包括基因组序列、mRNA 序列、或cDNA序列。

在另一优选例中，所述检测试剂或试剂盒还用于判断卵巢癌的亚型。

在另一优选例中，所述卵巢癌的亚型包括突变型和野生型。

在另一优选例中，所述突变型是RET基因发生突变的类型。

在另一优选例中，所述野生型是RET基因未发生突变的类型。

在另一优选例中，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、gRNA、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、蛋白质芯片、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒中，所述检测试剂为检测RET突变蛋白的编码序列的引物、探针、核酸芯片、gRNA。

在另一优选例中，所述试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

(a)针对RET基因的特异性引物；

(b)用于检测一种或多种所述基因突变位点的特异性探针；

(c)用于检测一种或多种所述基因突变位点的芯片；和

(d)用于检测一种或多种所述基因突变位点所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。

在另一优选例中，所述的RET基因、或其蛋白来源于哺乳动物，更佳地来源于灵长动物和人。

在另一优选例中，所述检测选自下组：外周血检测、细胞样品检测、体液 (如女性分泌物或阴道分泌物)样品检测。

在另一优选例中，所述的抗体偶联有或带有可检测标记，或者所述的探针偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述RET蛋白还包括RET蛋白的衍生物。

在另一优选例中，所述RET蛋白的衍生物包括经修饰的RET蛋白、氨基酸序列与天然RET蛋白同源且具有天然RET蛋白活性的蛋白分子、含有RET蛋白氨基酸序列的融合蛋白。

在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然RET蛋白同源且具有天然RET 蛋白活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与RET蛋白相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然RET蛋白活性的蛋白分子。

在本发明的第二方面，提供了一种检测卵巢癌和/或其易感性的试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)RET突变蛋白或其编码序列；和/或

(b)特异性扩增RET基因组序列、mRNA序列或cDNA序列的引物对；

以及(c)标签或说明书；

其中，所述的组分(a)、(b)分别位于一个或多个不同的容器或位于同一容器中。

在另一优选例中，所述组分(a)可作为对照品或参照品。

在另一优选例中，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于：

(i)检测卵巢癌和/或其易感性；和/或

(ii)判断卵巢癌的亚型。

在本发明的第三方面，提供了一种酪氨酸激酶抑制剂TKI或RET抑制剂的用途，用来制备治疗卵巢癌药物组合物。

在另一优选例中，所述的卵巢癌选自下组：上皮性卵巢癌、性索-间质肿瘤、生殖细胞肿瘤、转移性肿瘤、或其组合。

在另一优选例中，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。

在另一优选例中，所述的卵巢癌为RET突变型卵巢癌。

在另一优选例中，所述RET突变指与野生型RET蛋白相比，RET突变蛋白存在选自下组的氨基酸突变：D58N、C197S、A641T、R693H、G727V、A750T、A750V、 G751V、K780N、N879D、N879S、R959W、A1105G、K1107N、或其组合。

在另一优选例中，所述的RET突变蛋白选自下组：RET-D58N、RET-C197S、 RET-A641T、RET-R693H、RET-G727V、RET-A750T、RET-A750V、RET-G751V、RET-K780N、RET-N879D、RET-N879S、RET-R959W、RET-A1105G、RET-K1107N、或其组合。

在另一优选例中，所述RET突变选自下组：RET-R693H、RET-A750T、或其组合。

在另一优选例中，所述抑制剂选自下组：靶向RET蛋白的抗体或小分子抑制剂、RET基因靶向核酸分子或基因编辑器、或其组合。

在另一优选例中，所述RET基因靶向核酸分子或基因编辑器是靶向RET基因突变位点，进行定点突变的靶向核酸分子或基因编辑器。

在另一优选例中，所述RET基因靶向核酸分子或基因编辑器是靶向RET基因突变位点，进行定点突变的靶向核酸分子或基因编辑器，且所述RET基因突变选自下组：RET-R693H、RET-A750T、或其组合。

在另一优选例中，所述基因编辑器包括DNA基因编辑器和RNA基因编辑器。

在另一优选例中，所述基因编辑器包括gRNA和基因编辑蛋白。

在另一优选例中，所述gRNA是引导基因编辑蛋白特异性结合RET基因的 RNA。

在另一优选例中，所述基因编辑蛋白选自下组：CasRx、Cpf1、Cas9、Cas13a、Cas13b、Cas13c、或其组合。

在另一优选例中，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂TKI选自下组：凡德他尼、卡博替尼、瑞戈非尼(BAY 73-4506)、达鲁舍替(PHA-739358)、TG101209、赛博卡替尼(LOXO-292、ARRY-192)、2-D08、阿帕替尼、BMS-935177、 GSK3179106、BAW2881(NVP-BAW2881)、WHI-P180、BLU-667、AD80、或其组合。

在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂TKI为凡德他尼。

在本发明第四方面，提供了一种用于治疗卵巢癌的药物组合物，所述药物组合物包含(a)酪氨酸激酶抑制剂TKI、或RET抑制剂；(b)额外的卵巢癌抗癌活性成分；和(c)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述抗癌活性成分包括免疫治疗制剂、化学治疗制剂、和/或放射治疗制剂。

在另一优选例中，所述抗癌活性成分选自：铂类、紫杉醇、脂质体阿霉素、环磷酰胺、拓扑替康、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物的剂型选自下组：口服制剂、冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。

在另一优选例中，所述的卵巢癌是RET突变型的卵巢癌。

在另一优选例中，所述RET突变型的卵巢癌指，与野生型RET蛋白相比，存在选自下组的突变的RET突变蛋白所导致的卵巢癌：D58N、C197S、A641T、R693H、 G727V、A750T、A750V、G751V、K780N、N879D、N879S、R959W、A1105G、 K1107N、或其组合。

在本发明的第五方面，提供了一种治疗卵巢癌的方法，包括步骤：给需要的对象施用酪氨酸激酶抑制剂TKI。

在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂TKI选自下组：凡德他尼、卡博替尼、瑞戈非尼(BAY 73-4506)、达鲁舍替(PHA-739358)、TG101209、赛博卡替尼(LOXO-292、ARRY-192)、2-D08、阿帕替尼、BMS-935177、GSK3179106、 BAW2881(NVP-BAW2881)、WHI-P180、BLU-667、AD80、或其组合。

在另一优选例中，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。

在另一优选例中，所述的卵巢癌是RET突变型的卵巢癌。

在本发明的第六方面，提供了一种体外抑制卵巢癌细胞活力的方法，包括步骤：在酪氨酸激酶抑制剂TKI存在下，培养所述的卵巢癌细胞，从而抑制所述卵巢癌细胞的活力。

在另一优选例中，所述酪氨酸激酶抑制剂TKI选自下组：凡德他尼、卡博替尼、瑞戈非尼(BAY 73-4506)、达鲁舍替(PHA-739358)、TG101209、赛博卡替尼(LOXO-292、ARRY-192)、2-D08、阿帕替尼、BMS-935177、GSK3179106、BAW2881 (NVP-BAW2881)、WHI-P180、BLU-667、AD80、或其组合。

在另一优选例中，所述卵巢癌细胞为上皮性卵巢癌细胞。

在另一优选例中，所述的卵巢癌细胞是RET突变型的卵巢癌细胞。

在另一优选例中，所述RET突变指存在选自下组的突变：D58N、C197S、 A641T、R693H、G727V、A750T、A750V、G751V、K780N、N879D、N879S、 R959W、A1105G、K1107N、或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了RET蛋白质的结构与功能示意图，RET主要由细胞外的钙黏蛋白结构域，半胱氨酸结构域，跨膜结构域及细胞内的激酶结构域构成，RET蛋白通过突变等方式会导致细胞内的酪氨酸位点发生磷酸化而激活RET，进而通过下游的衔接蛋白激活MAPK及AKT信号通路发挥致癌作用。

图2显示了RET基因变异与RET基因非变异上皮性卵巢癌患者生存分析， RET基因变异病人的无进展生存期短于RET基因野生型病人，表明RET基因在上皮性卵巢癌中可能发挥致癌作用。

图3显示了Western Blot及Western Blot定量结果，将RET基因野生型及突变型质粒瞬转293T细胞，3天后收蛋白并做Western Blot实验，对Western Blot灰度进行定量，柱状图显示RET-R693H及RET-A750T相较于RET-WT，能明显提高磷酸化RET/RET的比值，表明两突变位点能显著促进RET的激活。

图4显示了Soft Agar代表性图片及克隆计数结果，将RET基因野生型及突变型慢病毒感染NIH3T3细胞，进行Soft Agar实验，3周后对克隆进行计数，柱状图表明RET-A750T及RET-R693H能显著促进NIH3T3细胞的克隆形成。

图5显示了Western Blot及Western Blot定量结果，将RET基因野生型及突变型慢病毒感染A2780细胞，收蛋白并做Western Blot实验，对Western Blot灰度进行定量，柱状图显示RET-R693H及RET-A750T相较于RET-WT，能明显提高磷酸化RET/RET的比值及磷酸化ERK/ERK，表明两突变位点能显著促进 RET/MAPK及RET/AKT信号通路的激活。

图6显示了CTG实验结果，将RET基因野生型及突变型慢病毒感染A2780细胞，进行CTG实验，柱状图表明RET-R693H及RET-A750T突变相较于RET-WT 能显著增强上皮性卵巢癌细胞活性。

图7显示了平板克隆试验代表性图片及克隆计数结果，将RET基因野生型及突变型慢病毒感染A2780细胞，进行平板克隆实验，对克隆数目计数，柱状图表明RET-R693H及RET-A750T突变相较于RET-WT能显著促进上皮性卵巢癌细胞的克隆形成。

图8显示了裸鼠移植瘤试验代表性图片及移植瘤体积及重量统计结果，将 RET基因野生型及突变型慢病毒感染A2780细胞，进行裸鼠移植瘤实验，对肿瘤的体积及重量进行测量，柱状图表明RET-R693H及RET-A750T突变相较于 RET-WT能显著增加上皮性卵巢癌细胞移植瘤的体积及重量，表明两突变能促进裸鼠移植瘤的生长。

图9显示了凡德他尼抑制RET基因突变上皮性卵巢癌细胞活性，将0,500nM,750nM,1000nM,2500nM,5000nM的凡德他尼(Vandetanib)作用于RET-R693H及 RET-A750T慢病毒感染的A2780细胞，并用CTG试验检测细胞活性，柱状图表明500nM的凡德他尼即可显著抑制RET基因突变卵巢癌细胞的增殖。

图10显示了Western Blot及Western Blot定量结果，将500nM作用于 RET-R693H及RET-A750T慢病毒感染的A2780细胞，收蛋白后进行Western Blot 实验，对Western Blot灰度进行定量，柱状图显示RET-R693H及RET-A750T相较于RET-WT，500nM凡德他尼能显著降低磷酸化RET/RET的比值及磷酸化 ERK/ERK的比值，表明500nM凡德他尼能抑制RET及下游MAPK信号通路的激活。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，上皮性卵巢癌患者中存在多种与上皮性卵巢癌关系密切的RET基因突变，其中，2种与上皮性卵巢癌关系最为密切的RET基因突变是RET-R693H及RET-A750T。相对于野生型RET， RET-R693H及RET-A750T能明显增强MAPK及AKT的磷酸化水平、增强上皮性卵巢癌细胞的活性，并能明显促进上皮性卵巢癌细胞裸鼠移植瘤生长。另外，本发明的首次意外地发现凡德他尼等TKI可通过抑制RET及其下游MAPK信号通路的激活从而有效抑制卵巢癌细胞。在此基础上，本发明人完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

卵巢癌

由于缺乏典型症状和有效的筛查手段，超过70％的患者在初次诊断时即已达晚期，晚期卵巢癌患者的标准治疗方案为肿瘤细胞减灭术辅以术后铂类为基础的联合化疗。虽然多数患者对初始化疗敏感，但多数病人会在初始治疗结束后18个月内复发，且在经历多次复发后最终也会发展为化疗耐药，而一旦耐药，由于对二线化疗药物的反应率很低，病人中位生存期只有1年左右。因此，复发及化疗耐药是影响卵巢癌患者生存率的一个重要因素。

在本发明中，卵巢癌选自下组：上皮性卵巢癌、性索间质肿瘤、生殖细胞肿瘤、转移性肿瘤、或其组合。

在本发明的一个优选例中，所述卵巢癌为上皮性卵巢癌。

在本发明的一个优选例中，所述卵巢癌为RET突变型上皮性卵巢癌。

在本发明的一个优选例中，所述卵巢癌为含有RET-R693H和/或RET-A750T位点突变的上皮性卵巢癌细胞。

RET基因及蛋白

RET基因(rearranged during transfection，转染重排基因)(转录编号 NM_02097,蛋白编号NM_066124)，位于10号染色体q11.2，其表达的蛋白产物RET是单次跨膜的酪氨酸激酶受体，由位于细胞外的钙粘蛋白样结构域、半胱氨酸富集富集结构域，跨膜结构域，以及胞内的酪氨酸激酶结构域组成。

人RET的核苷酸编码序列(cDNA)和氨基酸序列分别示于SEQ ID No:1和2。

生理状态下，当RET的配体(胶质细胞来源的神经营养因(GFLs))与RET的共受体(GDNF家族受体-α(GFRα))结合形成二元复合物后，单体形式的RET将与该复合物结合，导致RET分子二聚化及胞内酪氨酸残基的自我磷酸化，进而导致 MAPK、AKT等信号通路的激活，从而参与细胞的增殖、分化和存活等生物学活动(图1)。RET基因通过上述途径对神经系统、泌尿生殖系统及神经内分泌系统等多个系统的分化发育成熟和维持起重要作用，其功能缺失可导致多种发育异常性疾病，如先天性巨结肠等。

RET基因的突变、染色体重排及异常表达被证实与多种肿瘤的发生发展有关。多发性内分泌瘤2型(MEN2)以早发的髓样甲状腺癌(MTC)为特征，该疾病是由RET基因的点突变所致，突变的RET基因使得RET分子发生单个氨基酸的替换，其中发生于胞外半胱氨酸富集结构域的替换将导致RET单体发生配体非依赖的二聚化从而使得RET被激活，而发生于胞内酪氨酸激酶结构域的单个氨基酸的替换则通过改变蛋白质构象，减少激酶的自我抑制，增加激酶活性，增强 ATP的结合及修饰底物识别等方式激活RET，被激活的RET分子通过激活下游 MAPK、AKT等信号通路，使得细胞生长失控和去分化，从而导致癌症发生。此外，RET点突变还可导致胰腺癌、皮肤癌等。

在本发明的一个优选例中，涉及RET基因突变子的氨基酸改变和核苷酸改变情况如下表所示：

酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)

酪氨酸激酶抑制剂(英文缩写TKI)为一类能抑制酪氨酸激酶活性的化合物。酪氨酸激酶抑制剂可作为三磷酸腺苷(ATP)与酪氨酸激酶结合的竞争性抑制剂，也可作为酪氨酸的类似物，阻断酪氨酸激酶的活性，抑制细胞增殖。

已知临床上最常见的TKI包括凡德他尼，其他具有RET抑制作用的TKI类替代药物包括：卡博替尼、瑞戈非尼(BAY 73-4506)、达鲁舍替(PHA-739358)、 TG101209、赛博卡替尼(LOXO-292、ARRY-192)、2-D08、阿帕替尼、 BMS-935177、GSK3179106、BAW2881(NVP-BAW2881)、WHI-P180、BLU-667、 AD80等。在本发明的一个实施例中，使用的TKI为凡德他尼。

凡德他尼

凡德他尼(Vandetanib)是一种激酶抑制剂，白色固体，分子式为 C₂₂H₂₄BrFN₄O₂，分子量为475.35400，密度为1.406，熔点为240-243℃，沸点为 538.2℃(在760mmHg条件下)，闪点为279.3℃，其分子式如下所示：

凡德他尼已用于治疗不能切除，局部晚期或转移的有症状或进展的髓样甲状腺癌。本领域未见单独使用凡德他尼治疗RET-R693H及RET-A750T相关的卵巢癌治疗的研究与报道。

分子靶向治疗

分子靶向治疗将成为卵巢癌患者治疗的新策略。以往研究表明卵巢癌在临床水平、组织学水平及分子水平均存在异质性，这提示针对病人基因组特征的分子靶向治疗相对于经验性化疗,将在取得更大有效性的同时降低毒副作用。

当前卵巢癌的分子靶向药物主要包括PARP(poly ADP-ribose polymerase，多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶)抑制剂及靶向VEGF/VEGFR的单克隆抗体贝伐单抗。

临床试验表明PARP抑制剂的代表奥拉帕尼能明显提高复发性卵巢癌病人的PFS(无进展生存期)，最新试验表明奥拉帕尼作为复发性卵巢癌患者的维持治疗能显著提高病人的OS(总生存期)，该药已被FDA及EMA批准作为复发卵巢癌病人的治疗，也是我国首个获批上市的卵巢癌靶向治疗药物。由于缺乏明确的治疗靶点，当前的靶向治疗药物主要受益于铂类药物敏感的或具有BRCA基因突变的卵巢癌病人，而基因组测序数据表明，仅有50％的卵巢癌病人存在同源重组过程缺陷，说明PARP抑制剂对至少另外50％的卵巢癌病人可能无效。

而本发明经过大量数据筛选发现了14种上皮性卵巢癌RET基因潜在的激活突变，并进一步在细胞水平和动物水平，证明了其中两种突变——RET-R693H 及RET-A750T影响上皮性卵巢癌细胞和裸鼠移植瘤的生长。进一步，发明人创造性地发现，具有RET抑制作用的TKI低剂量单独使用，就可以高效地抑制 RET-R693H及RET-A750T位点突变的上皮性卵巢癌细胞的活性。

细胞系

如本文所用，A2780细胞系是卵巢癌研究常用的细胞系之一，它的构建来自未治疗的内膜样卵巢癌病人的肿瘤组织，A2780 cis是由A2780衍生出的对铂类耐药的细胞系，A2780ADR是衍生出的对阿霉素耐药的细胞系。培养A2780 细胞系用RPMI-1640培养基+10％胎牛血清，A2780细胞呈单层贴壁生长。

本发明的主要优点包括：

1.本发明首次证明，RET-R693H及RET-A750T位点突变等RET突变可促进上皮性卵巢癌的活性、克隆形成。

2.本发明首次发现，凡德他尼等为代表的TKI可以单独用于卵巢癌治疗，尤其是含有RET-R693H及RET-A750T位点突变的上皮性卵巢癌；且500nM凡德他尼即可对含有RET-R693H及RET-A750T位点突变的上皮性卵巢癌细胞的活性具有抑制作用。

3.本发明首次发现，RET-R693H及RET-A750T位点突变在上皮性卵巢癌中可能通过激活RET及下游MAPK、AKT信号通路发挥致癌作用，且凡德他尼可抑制RET及下游MAPK信号通路的激活。

4.本发明首次证明了单独使用低剂量(甚至更低)500nM凡德他尼可对含有 RET-R693H及RET-A750T位点突变的上皮性卵巢癌细胞的活性具有抑制作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

除非特别说明，否则本发明实施例中所用材料和试剂均为市售产品。

实施例1 分析与卵巢癌相关的RET基因突变

通过分析TCGA数据库中100个酪氨酸激酶受体在上皮性卵巢癌中的突变频率，突变频率排名前5的基因为：RON,PTK7,ABL1,RET,PDGFRB。在5种基因中，RET基因虽然在临床存在已上市的靶向治疗药物凡德他尼，但其在卵巢癌中的作用未报道。因此，本发明人对与卵巢癌相关的RET基因突变深入研究。

在TCGA(The Cancer Genome Atlas),COSMIC(Catalogue of Somatic Mutationsin Cancer),ICGC(International Cancer Genome Consortium),CCLE (Broad InstituteCancer Cell Line Encyclopedia)数据库中，筛选上皮性卵巢癌中 RET基因潜在的激活突变。首先，选出RET基因在上皮性卵巢癌中的突变位点。然后，筛选出PolyPhen-2点突变预测工具预测为“possibly damaging”or “probably damaging”或者及SIFT(SortingIntolerant from Tolerant)点突变预测工具预测为“damaging”的突变。进一步，再剔除其中涵盖在千人基因组计划中的氨基酸改变。

结果：

通过分析TCGA数据库，RET基因在卵巢癌中的突变频率为1.98％，且生存分析显示RET基因改变的患者具有更短的无进展生存期(图2)。

通过点突变分析，筛选出了14种RET基因潜在的激活突变，包括：RET-D58N，RET-C197S，RET-A641T，RET-R693H，RET-G727V，RET-A750T， RET-A750V，RET-G751V，RET-K780N，RET-N879D，RET-N879S，RET-R959W， RET-A1105G，RET-K1107N。

实施例2 筛选RET基因的激活突变

WT质粒(可获自加拿大女王大学)，采用Not1-HF(NEB#R3189S)及 Nhel-HF(NEB#R3131V)酶切质粒中的RET-WT序列，并酶切pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒表达质粒(System biosciences#CD510B-1)，利用T4连接酶(NEB#M0202V)将RET-WT片段插入酶切过的 pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro慢病毒表达质粒(System biosciences#CD510B-1), 构建出具有pCDH骨架的RET-WT质粒。由点突变试剂盒QuikChange采用点突变试剂盒(QuikChangeLightning Site-Directed Mutagenesis Kit(#210518))成功构建了含有以pCDH为骨架的14种RET基因潜在的激活突变的质粒，以及含有甲状腺髓样癌C634R致病突变质粒。

用脂质体瞬转的方法，分别用14种质粒转染293T细胞，并通过Western Blot 实验，研究了各表达RET突变基因的重组细胞中RET分子905位点的磷酸化水平。

类型	抗体	型号
			一抗	RET抗体	Cell Signaling#14556
一抗	RET磷酸化抗体Phospho-Ret(Tyr905)	Cell Signaling#3221
			二抗	GOAT ANTI-RABBIT IgG(H&L)	Invitrogen#G21234

结果：如图3所示，Western Blot结果显示，转染RET-R693H及RET-A750T 的细胞，其RET分子905的磷酸化位点的磷酸化定量与RET定量的比值 (pRET(905)/RET)较RET-WT明显升高(P<0.05)，这表明两个位点能促使RET被激活。

实施例3 验证RET-R693H及RET-A750T在卵巢癌中的致癌作用

将NIH3T3细胞用胰酶消化，培养基中和，重悬并计数，按0.25×10⁶个细胞 /孔，待细胞融合度达50％后进行pCDH、pCDHRET-WT、pCDHRET-R693H、 pCDHRET-A750T、pCDHRET-C634R病毒感染，16小时后用新鲜培养基终止感染，24小时后加入含puromycin的筛选培养基。于第四天收取蛋白做Western Blot。

筛选后的细胞用于Soft Agar实验。具体地，用2×RPMI1640培养基(Hyclone#SH30197.03)和0.7％的上层胶将筛选后的细胞稀释至5×10⁴个细胞/孔，加至凝固的下层胶上，待室温凝固后放回细胞培养箱中，每周补充两次200ul 新鲜培养基，3周后用噻唑蓝(Sigma#M5655-1G)染色并拍照，计数克隆数目。

结果：如图4所示，Soft Agar实验结果显示RET-R693H及RET-A750T感染 NIH3T3细胞，其克隆数目明显多于RET-WT感染组(P<0.05)，表明RET-R693H 及RET-A750T位点突变能促进NIH3T3细胞的克隆形成。

如图5所示，Western Blot定量结果显示，相对于RET-WT，RET-R693H及 RET-A750T突变能明显提高RET的磷酸化水平，且差异具有统计学意义 (P<0.01)。该结果表明RET-R693H及RET-A750T为上皮性卵巢癌的激活突变。另外，相对于RET-WT，RET-R693H及RET-A750T能明显增强MAPK及AKT的磷酸化水平，表明RET-R693H及RET-A750T在上皮性卵巢癌中可能通过激活 MAPK及AKT信号通路发挥致癌作用

实施例4 RET-R693H及RET-A750T位点突变对上皮性卵巢癌细胞的影响

如实施例3的实验操作，用空载(EV)、RET-WT、RET-R693H及RET-A750T 慢病毒分别感染卵巢癌A2780细胞系，并用puro筛选。

使用CTG试剂盒(CellTiter-

Luminescent Cell Viability Assay，Promega#G7572)检测筛选出的细胞的细胞活力。具体地，将感染RET野生型及突变型慢病毒的A2780细胞按2000个细胞/孔铺于96孔板中，3天后进行CTG检测，将CTG检测液用PBS按1:3的比例稀释并混合均匀，吸出96孔板中的废液，加入CTG稀释液100ul/孔，放于微孔板振荡器，650r振荡2min钟后静置10min，将孔中液体转移至白色96孔板中，避光，用酶标仪检测吸光度值。

给筛选出的细胞进行平板克隆实验(500个细胞/孔)。具体地，将感染RET 野生型及突变型慢病毒的A2780细胞按500个细胞/孔铺于6孔板中，培养3周后采用多聚甲醛固定15min，结晶紫染色3h，扫描仪进行扫描，计数克隆数目。

结果：

如图6所示，细胞活力实验显示，RET-R693H及RET-A750T位点突变相对于RET-WT能明显增强上皮性卵巢癌细胞的活性(P<0.01)。

如图7所示，平板克隆实验表明，感染RET-R693H及RET-A750T病毒的 A2780细胞相较于感染空载病毒及RET-WT病毒的A2780细胞能明显增加克隆数目(P<0.05)。

实施例5 RET-R693H及RET-A750T位点突变对上皮性卵巢癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响

使用如实施例4方法获得的4种病毒转染的卵巢癌A2780细胞，进行裸鼠移植瘤试验。将感染RET野生型及突变型慢病毒的A2780细胞按照3×10⁶细胞/只接种于6周龄BALB-C裸鼠腋下，三周后处死小鼠并剥取肿瘤拍照称重，并计算肿瘤体积，肿瘤体积计算公式为V＝(L×W²)/2。

结果：如图8所示，裸鼠移植瘤实验显示，感染RET-R693H及RET-A750T 病毒相较于感染EV及RET-WT病毒能明显增加移植瘤的体积和重量(P<0.05)，表明两种突变能明显促进上皮性卵巢癌细胞裸鼠移植瘤生长。

实施例6 凡德他尼对RET基因突变上皮性卵巢癌细胞的抑制作用

将空载(EV)、RET-WT、RET-R693H及RET-A750T慢病毒分别感染卵巢癌 A2780细胞系并用puro筛选，将筛选的细胞铺入96孔板，5000个细胞/孔，分别于第1天，加入5个浓度梯度(0、500、750、1000、2000、5000nM)的凡德他尼，作用3天后用CTG试剂盒检测细胞活力。细胞活力实验的操作如实施例4所述。

结果：如图9所示，细胞活力实验显示500nM的凡德他尼即可显著抑制 RET-R693H及RET-A750T位点突变的上皮性卵巢癌细胞的活性(P<0.05)。结果表明凡德他尼可抑制RET-R693H、RET-A750T突变上皮性卵巢癌的活性。

实施例7 凡德他尼抑制RET基因突变在上皮性卵巢癌细胞的分子机制

将RET-R693H及RET-A750T慢病毒分别感染卵巢癌A2780细胞系并用puro 筛选4天，将凡德他尼作用4小时后收取蛋白，通过Western Blot实验，检测RET 及MAPK信号通路分子(ERK)的磷酸化水平。

结果：如图10所示，Western Blot结果显示500nM的凡德他尼能明显抑制 RET的磷酸化及下游MAPK信号通路的分子的磷酸化，表明凡德他尼可能通过抑制RET及其下游MAPK信号通路的激活从而抑制卵巢癌细胞的活性，这提示 RET-R693H及RET-A750T突变作为上皮性卵巢癌病人潜在的突变类型，可作为早期或辅助性筛查卵巢癌的靶标。此外，以凡德他尼为代表的TKI可用于治疗上皮性卵巢癌，尤其是治疗存在RET-R693H和/或RET-A750T突变的上皮性卵巢癌。

讨论：

本发明通过分析TCGA数据库发现RET基因的改变缩短了上皮性卵巢癌病人的PFS，提示RET可能在卵巢癌中可能发挥重要作用。通过分析TCGA数据库，发现上皮性卵巢癌中RET基因的突变频率达1.98％，结合突变预测工具PPh2及 SIFT预测结果，在上皮性卵巢癌中筛选出的14种RET基因潜在的激活突变感染 293T细胞，发现RET-R693H及RET-A750T位点突变能促进RET905磷酸化位点的激活，通过感染NIH3T3细胞，发现两位点的突变均可增强NIH3T3细胞的克隆形成能力。

为进一步探究其在卵巢癌中是否同样具有致癌作用，筛选出RET基因几乎不表达的上皮性卵巢癌A2780细胞系作为研究工具，发现RET-R693H及 RET-A750T两个位点的突变均能导致RET两个磷酸化位点的激活。

功能实验表明，两个位点突变均能促进上皮性卵巢癌细胞的活性及克隆形成。由于MAPK及AKT信号通路是RET分子激活后发挥作用的主要信号通路，其在肿瘤细胞的增殖，存活及侵袭等生物学活动中发挥重要作用。本发明人发现，RET-R693H及RET-A750T这两个位点突变在上皮性卵巢癌中均可促进 MAPK及AKT信号通路的激活，表明两个位点突变可能通过激活RET/MAPK及 RET/AKT信号通路发挥致癌作用。

RET当前的靶向治疗药物主要是多靶点激酶抑制剂，其中凡德他尼已被 FDA及EMA批准用于局部进展或转移甲状腺髓样甲状腺癌的治疗。临床前研究表明凡德他尼可抑制RET基因突变所导致的细胞增殖，并可抑制RET及下游 MAPK信号通路的激活。临床III期实验表明凡德他尼作用于甲状腺髓样癌病人，可显著提高病人的PFS，且亚组分析表明RET基因突变病人获益更大。

将凡德他尼作用于含有RET-R693H及RET-A750T突变的上皮性卵巢癌 A2780细胞，发现500nM的凡德他尼可显著抑制含RET-R693H及RET-A750T位点突变卵巢癌A2780细胞的活性，该抑制作用可能是通过抑制RET及其下游 MAPK信号通路的激活所致。

相较于经典的靶向治疗药物，如靶向BCL-ABL融合基因的伊马替尼显著的临床疗效，RET抑制剂的疗效相对较弱，可能与当前RET抑制剂缺乏特异性有关，“下一代”RET抑制剂如BLU-667及LOXO-292，相对于凡德他尼，其对RET 分子的特异性极大的提升，且临床前实验表明其对RET变异分子具有显著的治疗作用，目前此两种药物均已进入临床I期实验。随着其应用的推广，期待将其应用于RET-R693H及RET-A750T突变的上皮性卵巢癌病人中。

本发明为国内外首次揭示了RET基因突变在上皮性卵巢癌中致癌作用。 500nMRET抑制剂凡德他尼即可抑制RET-R693H及RET-A750T位点突变的上皮性卵巢癌细胞的生长。

本发明的研究提示，以凡德他尼为代表的TKI可应用于治疗上皮性卵巢癌，特别是RET基因突变型的上皮性卵巢癌，尤其是RET-R693H和/或RET-A750T突变型的上皮性卵巢癌。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 复旦大学附属妇产科医院

<120> 上皮性卵巢癌靶点RET及其在诊断和治疗中的作用

<130> P2019-2279

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3345

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atggcgaagg cgacgtccgg tgccgcgggg ctgcgtctgc tgttgctgct gctgctgccg 60

ctgctaggca aagtggcatt gggcctctac ttctcgaggg atgcttactg ggagaagctg 120

tatgtggacc aggcagccgg cacgcccttg ctgtacgtcc atgccctgcg ggacgcccct 180

gaggaggtgc ccagcttccg cctgggccag catctctacg gcacgtaccg cacacggctg 240

catgagaaca actggatctg catccaggag gacaccggcc tcctctacct taaccggagc 300

ctggaccata gctcctggga gaagctcagt gtccgcaacc gcggctttcc cctgctcacc 360

gtctacctca aggtcttcct gtcacccaca tcccttcgtg agggcgagtg ccagtggcca 420

ggctgtgccc gcgtatactt ctccttcttc aacacctcct ttccagcctg cagctccctc 480

aagccccggg agctctgctt cccagagaca aggccctcct tccgcattcg ggagaaccga 540

cccccaggca ccttccacca gttccgcctg ctgcctgtgc agttcttgtg ccccaacatc 600

agcgtggcct acaggctcct ggagggtgag ggtctgccct tccgctgcgc cccggacagc 660

ctggaggtga gcacgcgctg ggccctggac cgcgagcagc gggagaagta cgagctggtg 720

gccgtgtgca ccgtgcacgc cggcgcgcgc gaggaggtgg tgatggtgcc cttcccggtg 780

accgtgtacg acgaggacga ctcggcgccc accttccccg cgggcgtcga caccgccagc 840

gccgtggtgg agttcaagcg gaaggaggac accgtggtgg ccacgctgcg tgtcttcgat 900

gcagacgtgg tacctgcatc aggggagctg gtgaggcggt acacaagcac gctgctcccc 960

ggggacacct gggcccagca gaccttccgg gtggaacact ggcccaacga gacctcggtc 1020

caggccaacg gcagcttcgt gcgggcgacc gtacatgact ataggctggt tctcaaccgg 1080

aacctctcca tctcggagaa ccgcaccatg cagctggcgg tgctggtcaa tgactcagac 1140

ttccagggcc caggagcggg cgtcctcttg ctccacttca acgtgtcggt gctgccggtc 1200

agcctgcacc tgcccagtac ctactccctc tccgtgagca ggagggctcg ccgatttgcc 1260

cagatcggga aagtctgtgt ggaaaactgc caggcattca gtggcatcaa cgtccagtac 1320

aagctgcatt cctctggtgc caactgcagc acgctagggg tggtcacctc agccgaggac 1380

acctcgggga tcctgtttgt gaatgacacc aaggccctgc ggcggcccaa gtgtgccgaa 1440

cttcactaca tggtggtggc caccgaccag cagacctcta ggcaggccca ggcccagctg 1500

cttgtaacag tggaggggtc atatgtggcc gaggaggcgg gctgccccct gtcctgtgca 1560

gtcagcaaga gacggctgga gtgtgaggag tgtggcggcc tgggctcccc aacaggcagg 1620

tgtgagtgga ggcaaggaga tggcaaaggg atcaccagga acttctccac ctgctctccc 1680

agcaccaaga cctgccccga cggccactgc gatgttgtgg agacccaaga catcaacatt 1740

tgccctcagg actgcctccg gggcagcatt gttgggggac acgagcctgg ggagccccgg 1800

gggattaaag ctggctatgg cacctgcaac tgcttccctg aggaggagaa gtgcttctgc 1860

gagcccgaag acatccagga tccactgtgc gacgagctgt gccgcacggt gatcgcagcc 1920

gctgtcctct tctccttcat cgtctcggtg ctgctgtctg ccttctgcat ccactgctac 1980

cacaagtttg cccacaagcc acccatctcc tcagctgaga tgaccttccg gaggcccgcc 2040

caggccttcc cggtcagcta ctcctcttcc ggtgcccgcc ggccctcgct ggactccatg 2100

gagaaccagg tctccgtgga tgccttcaag atcctggagg atccaaagtg ggaattccct 2160

cggaagaact tggttcttgg aaaaactcta ggagaaggcg aatttggaaa agtggtcaag 2220

gcaacggcct tccatctgaa aggcagagca gggtacacca cggtggccgt gaagatgctg 2280

aaagagaacg cctccccgag tgagctgcga gacctgctgt cagagttcaa cgtcctgaag 2340

caggtcaacc acccacatgt catcaaattg tatggggcct gcagccagga tggcccgctc 2400

ctcctcatcg tggagtacgc caaatacggc tccctgcggg gcttcctccg cgagagccgc 2460

aaagtggggc ctggctacct gggcagtgga ggcagccgca actccagctc cctggaccac 2520

ccggatgagc gggccctcac catgggcgac ctcatctcat ttgcctggca gatctcacag 2580

gggatgcagt atctggccga gatgaagctc gttcatcggg acttggcagc cagaaacatc 2640

ctggtagctg aggggcggaa gatgaagatt tcggatttcg gcttgtcccg agatgtttat 2700

gaagaggatt cctacgtgaa gaggagccag ggtcggattc cagttaaatg gatggcaatt 2760

gaatcccttt ttgatcatat ctacaccacg caaagtgatg tatggtcttt tggtgtcctg 2820

ctgtgggaga tcgtgaccct agggggaaac ccctatcctg ggattcctcc tgagcggctc 2880

ttcaaccttc tgaagaccgg ccaccggatg gagaggccag acaactgcag cgaggagatg 2940

taccgcctga tgctgcaatg ctggaagcag gagccggaca aaaggccggt gtttgcggac 3000

atcagcaaag acctggagaa gatgatggtt aagaggagag actacttgga ccttgcggcg 3060

tccactccat ctgactccct gatttatgac gacggcctct cagaggagga gacaccgctg 3120

gtggactgta ataatgcccc cctccctcga gccctccctt ccacatggat tgaaaacaaa 3180

ctctatggca tgtcagaccc gaactggcct ggagagagtc ctgtaccact cacgagagct 3240

gatggcacta acactgggtt tccaagatat ccaaatgata gtgtatatgc taactggatg 3300

ctttcaccct cagcggcaaa attaatggac acgtttgata gttaa 3345

<210> 2

<211> 1114

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Lys Val Ala Leu Gly Leu Tyr Phe Ser

20 25 30

Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys Leu Tyr Val Asp Gln Ala Ala Gly Thr

35 40 45

Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Glu Glu Val Pro

50 55 60

Ser Phe Arg Leu Gly Gln His Leu Tyr Gly Thr Tyr Arg Thr Arg Leu

65 70 75 80

His Glu Asn Asn Trp Ile Cys Ile Gln Glu Asp Thr Gly Leu Leu Tyr

85 90 95

Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys Leu Ser Val Arg

100 105 110

Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys Val Phe Leu Ser

115 120 125

Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro Gly Cys Ala Arg

130 135 140

Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala Cys Ser Ser Leu

145 150 155 160

Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro Ser Phe Arg Ile

165 170 175

Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe Arg Leu Leu Pro

180 185 190

Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr Arg Leu Leu Glu

195 200 205

Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser Leu Glu Val Ser

210 215 220

Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys Tyr Glu Leu Val

225 230 235 240

Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu Val Val Met Val

245 250 255

Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Ala Pro Thr Phe

260 265 270

Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu Phe Lys Arg Lys

275 280 285

Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp Ala Asp Val Val

290 295 300

Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro

305 310 315 320

Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu His Trp Pro Asn

325 330 335

Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg Ala Thr Val His

340 345 350

Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile Ser Glu Asn Arg

355 360 365

Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp Phe Gln Gly Pro

370 375 380

Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser Val Leu Pro Val

385 390 395 400

Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val Ser Arg Arg Ala

405 410 415

Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln Ala

420 425 430

Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser Ser Gly Ala Asn

435 440 445

Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp Thr Ser Gly Ile

450 455 460

Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro Lys Cys Ala Glu

465 470 475 480

Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr Ser Arg Gln Ala

485 490 495

Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Glu

500 505 510

Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Arg Arg Leu Glu Cys

515 520 525

Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Cys Glu Trp Arg

530 535 540

Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg Asn Phe Ser Thr Cys Ser Pro

545 550 555 560

Ser Thr Lys Thr Cys Pro Asp Gly His Cys Asp Val Val Glu Thr Gln

565 570 575

Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln Asp Cys Leu Arg Gly Ser Ile Val Gly

580 585 590

Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile Lys Ala Gly Tyr Gly Thr

595 600 605

Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys Phe Cys Glu Pro Glu Asp

610 615 620

Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys Arg Thr Val Ile Ala Ala

625 630 635 640

Ala Val Leu Phe Ser Phe Ile Val Ser Val Leu Leu Ser Ala Phe Cys

645 650 655

Ile His Cys Tyr His Lys Phe Ala His Lys Pro Pro Ile Ser Ser Ala

660 665 670

Glu Met Thr Phe Arg Arg Pro Ala Gln Ala Phe Pro Val Ser Tyr Ser

675 680 685

Ser Ser Gly Ala Arg Arg Pro Ser Leu Asp Ser Met Glu Asn Gln Val

690 695 700

Ser Val Asp Ala Phe Lys Ile Leu Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro

705 710 715 720

Arg Lys Asn Leu Val Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly

725 730 735

Lys Val Val Lys Ala Thr Ala Phe His Leu Lys Gly Arg Ala Gly Tyr

740 745 750

Thr Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu

755 760 765

Leu Arg Asp Leu Leu Ser Glu Phe Asn Val Leu Lys Gln Val Asn His

770 775 780

Pro His Val Ile Lys Leu Tyr Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu

785 790 795 800

Leu Leu Ile Val Glu Tyr Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu

805 810 815

Arg Glu Ser Arg Lys Val Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser

820 825 830

Arg Asn Ser Ser Ser Leu Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr Met

835 840 845

Gly Asp Leu Ile Ser Phe Ala Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met Gln Tyr

850 855 860

Leu Ala Glu Met Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile

865 870 875 880

Leu Val Ala Glu Gly Arg Lys Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser

885 890 895

Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Val Lys Arg Ser Gln Gly Arg

900 905 910

Ile Pro Val Lys Trp Met Ala Ile Glu Ser Leu Phe Asp His Ile Tyr

915 920 925

Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile

930 935 940

Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu

945 950 955 960

Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys

965 970 975

Ser Glu Glu Met Tyr Arg Leu Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro

980 985 990

Asp Lys Arg Pro Val Phe Ala Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met

995 1000 1005

Met Val Lys Arg Arg Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro Ser

1010 1015 1020

Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr Pro Leu

1025 1030 1035 1040

Val Asp Cys Asn Asn Ala Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro Ser Thr Trp

1045 1050 1055

Ile Glu Asn Lys Leu Tyr Gly Met Ser Asp Pro Asn Trp Pro Gly Glu

1060 1065 1070

Ser Pro Val Pro Leu Thr Arg Ala Asp Gly Thr Asn Thr Gly Phe Pro

1075 1080 1085

Arg Tyr Pro Asn Asp Ser Val Tyr Ala Asn Trp Met Leu Ser Pro Ser

1090 1095 1100

Ala Ala Lys Leu Met Asp Thr Phe Asp Ser

1105 1110

Claims

1.一种检测RET突变蛋白或其编码序列的检测试剂在制备一诊断试剂或试剂盒中的用途，其中，所述诊断试剂或试剂盒被(a)用于检测上皮性卵巢癌和/或其易感性；或(b)用于检测其预后，

其中，所述RET突变蛋白相较野生型RET蛋白，存在选自下组的突变：R693H、A750T或其组合；所述突变能促使RET被激活。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述RET突变蛋白相较野生型RET蛋白，存在以下突变：R693H。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的RET突变蛋白的编码序列包括cDNA序列。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂选自下组：抗体、引物、探针、gRNA、测序文库、核酸芯片、蛋白质芯片或其组合。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒中，所述检测试剂为检测RET突变蛋白的特异性抗体。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：

(i) 针对RET突变蛋白的编码序列的特异性引物；

(ii) 用于检测一种或多种所述RET突变蛋白的编码序列的突变的特异性探针；

(iii) 用于检测一种或多种所述RET突变蛋白的编码序列的突变的芯片；和

(iv) 用于检测一种或多种所述RET突变蛋白的突变所对应的氨基酸突变的特异性抗体。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测针对选自下组的样品：外周血、细胞样品或体液样品，所述体液样品包括阴道分泌物。

8.一种试剂盒在制备检测上皮性卵巢癌和/或其易感性的诊断试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒包括：

(a) 检测RET突变蛋白或其编码序列的检测试剂，所述RET突变蛋白相较野生型RET蛋白，存在选自下组的突变：R693H、A750T或其组合；和

(b) 特异性扩增RET 基因组序列、mRNA序列或cDNA序列的引物对；

以及(c)标签或说明书；

其中，所述的组分(a)、(b)分别位于不同的容器或位于同一容器中。

9. 一种酪氨酸激酶抑制剂TKI或RET抑制剂在制备治疗上皮性卵巢癌药物组合物中的用途，其中所述上皮性卵巢癌为RET突变型上皮性卵巢癌，所述RET突变指与野生型RET蛋白相比，RET突变蛋白存在选自下组的氨基酸突变： R693H或A750T，

其中，所述酪氨酸激酶抑制剂TKI或RET抑制剂为凡德他尼。

10.一种药物组合物在制备用于治疗上皮性卵巢癌的药物中的用途，其特征在于，所述药物组合物包含(M1)凡德他尼；(M2)额外的卵巢癌抗癌活性成分，所述额外的卵巢癌抗癌活性成分选自下组：铂类、紫杉醇、脂质体阿霉素、环磷酰胺、拓扑替康或其组合；和(M3)药学上可接受的载体，其中所述上皮性卵巢癌为RET突变型上皮性卵巢癌，所述RET突变指与野生型RET蛋白相比，RET突变蛋白存在选自下组的氨基酸突变：R693H或A750T。

11.一种体外非诊断非治疗性抑制上皮性卵巢癌细胞活力的方法，其特征在于，包括步骤：在酪氨酸激酶抑制剂TKI存在下，培养所述的上皮性卵巢癌细胞，从而抑制所述上皮性卵巢癌细胞的活力，其中所述上皮性卵巢癌为RET突变型上皮性卵巢癌，所述RET突变指与野生型RET蛋白相比，RET突变蛋白存在选自下组的氨基酸突变：R693H或A750T，所述酪氨酸激酶抑制剂TKI为凡德他尼。