CN113388643A - 一种具有分子开关的基因序列、质粒和免疫细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有分子开关的基因序列、质粒和免疫细胞，属于分子生物技术领域，所述基因序列包括激发部件、连接区和应答部件，所述激发部件包括靶点结合区和转录调节区；所述应答部件包括表达区和与所述转录调节区相匹配的启动子区。激发部件的靶点结合区用于表达靶点结合受体，转录调节区用于表达转录调节因子，靶点结合受体用于与靶点结合后，转录调节因子从靶点结合受体上分离，转录调节因子结合到启动子区，并激活启动子，启动表达区中基因序列的表达；连接区将激发部件和应答部件连接在同一基因序列中，简化制备流程、提高转染的效率，利于工业化制备病毒颗粒和CAR细胞。

Description

一种具有分子开关的基因序列、质粒和免疫细胞
技术领域
本发明涉及分子生物技技术领域，具体涉及一种具有分子开关的基因序列、质粒和免疫细胞。
背景技术
随着全球环境因素的不断恶化，无论发达国家或发展中国家，恶性肿瘤的发病率和死亡率均呈上升趋势，恶性肿瘤已成为人类生命健康的最大危害。
嵌合抗原受体免疫细胞是一种杀伤肿瘤的新型精准靶向免疫细胞，近几年通过优化改良在肿瘤杀伤上取得很好的效果，是一种非常有前景的，精准、快速、高效的方式。嵌合抗原受体免疫细胞(CAR细胞)包括CAR-T、CAR-NK、CAR-B以及CAR-MP(CAR-macrophage，CAR-巨噬细胞)，是一种以嵌合型抗原受体(Chimeric Antigen Receptor,CAR)为基础的免疫细胞。通过体外基因转移技术，将编码特异的嵌合抗原受体的基因序列转导入免疫细胞，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性免疫细胞。
CAR-T细胞在治疗血液肿瘤已经取得显著的治疗效果，如治疗急性B淋巴母细胞白血病的Kymriah，治疗非何杰金氏淋巴瘤等血液病的Yescarta、Breyanzi和Tecartus，以及治疗多发性骨髓瘤的Abecma已获得FDA批准上市。但CAR细胞治疗实体瘤的治疗效果远不如血液病，进而研发进展缓慢。并且有不少CAR-T细胞治疗实体瘤在临床1/2期时因为毒性和/或有效性问题而终止试验。
主要原因有：实体瘤本身具有的特有特征微环境(Tumor Microenvironment，TME)；以及CAR-T自身的局限。迄今为止，现阶段的CAR细胞(包括CAR-T细胞)产品都是持续性地表达CAR分子，且没有组织特异性，不论CAR-T细胞是否在肿瘤组织区域CAR分子都表达。由此CAR-T细胞始终处于激活状态，CAR-T很容易衰竭失能(exhaustion、anergy)和持续性(persistence)差，并且由于没有组织特异性，on-target/off-tumor的副反应不可避免。
发明内容
针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种具有分子开关的基因序列、质粒和免疫细胞，通过连接区将激发部件和应答部件连接在一段基因序列下，基因序列中的激发部件作为应答部件的分子开关，以调节应答部件的表达。
本发明公开了一种具有分子开关的基因序列，包括激发部件、连接区和应答部件，所述激发部件包括靶点结合区和转录调节区；所述应答部件包括表达区和与所述转录调节区相匹配的启动子区。
优选的，所述靶点结合区包括单链抗体，
所述转录调节区包括synNotch和Gal4VP64；
所述启动子区包括Gal4UAS，所述表达区包括蛋白分子表达序列；所述蛋白分子包括CAR326或anti-Her2 scFv；
所述连接区的连接序列包括多聚腺嘌呤核糖核苷酸位点序列，避免激发部件与应答部件间的干扰。
优选的，所述激发部件的基因序列为SEQ ID NO:2；
所述连接序列的基因序列为SEQ ID NO:5；
所述CAR326的基因序列为SEQ ID NO:4。
优选的，所述表达区包括第一蛋白表达序列、连接短肽序列和第二蛋白表达序列；
激发部件上游设置有信号肽。
本发明还提供一种质粒，包含上述基因序列。
本发明还提供一种免疫细胞，所述免疫细胞转染有由上述质粒封装而成的病毒颗粒；所述免疫细胞包括CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-B细胞或CAR-MP细胞。
优选的，所述免疫细胞用于杀伤实体瘤细胞或血液肿瘤细胞。
优选的，所述病毒的制备方法包括：
合成所述基因序列的cDNA以及核苷酸序列；
用所述cDNA以及核苷酸序列制备慢病毒质粒；
通过慢病毒质粒制备慢病毒。
优选的，所述免疫细胞的制备方法包括：
获取单核细胞，并进行预培养；
将慢病毒转染到预培养后的单核细胞中，经过培养，获取免疫细胞。
优选的，获取CAR-T免疫细胞的方法包括：
取50ml外周血，Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心获得单核细胞；
所述单核细胞以2x106/ml的细胞密度，在X-VIVO 15全培养液、37℃、5％CO2培养2小时，收集悬浮细胞；
悬浮细胞以1.2x106/ml的细胞密度接种到培养瓶内，以细胞比磁珠为1:3的比例加入CD3/CD28磁珠，并加入终浓度100U/ml的白介素2培养过夜；
加入所述慢病毒进行转染；
细胞转染后继续培养5天，通过磁力架去除磁珠，获得CAR-T免疫细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：激发部件的靶点结合区用于表达靶点结合受体，转录调节区用于表达转录调节因子，靶点结合受体用于与靶点结合后，转录调节因子从靶点结合受体上分离，转录调节因子结合到启动子区，并激活启动子，启动表达区中基因序列的表达；连接区将激发部件和应答部件连接在同一基因序列中，简化制备流程、提高转染的效率，利于工业化制备病毒和CAR细胞。
附图说明
图1是本发明的具有分子开关的基因序列的结构构建图；
图2是CAR结构的构建图；
图3是含分子开关的CAR细胞示意图；
图4是TNFα的检测结果对比图；
图5是IFNγ的检测结果对比图；
图6是杀伤肿瘤细胞检测结果对比图；
图7是LS1034激活后杀伤HCT116细胞检测结果对比图；
图8是动物水平试验实体瘤杀伤检测结果对比图；
图9是第一蛋白表达序列、连接短肽序列和第二蛋白表达序列的结构构建图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面结合附图对本发明做进一步的详细描述：
一种具有分子开关的基因序列，如图1所示，包括激发部件、连接区和应答部件，所述激发部件包括靶点结合区和转录调节区；所述应答部件包括表达区和与所述转录调节区相匹配的启动子区。
如图3所示，激发部件的靶点结合区用于表达靶点结合受体，转录调节区用于表达转录调节因子(TF)，靶点结合受体用于与靶点结合后，TF从靶点结合受体上分离，TF结合到含(UAS，upstream activating sequence)启动子区，激活启动子，启动表达区中基因序列的表达；连接区将激发部件和应答部件连接在同一基因序列中，简化制备流程、提高转染的效率，利于工业化制备病毒和CAR细胞。
避免了激发部件和应答部件分别构建质粒(质粒1和质粒2)，用以制备病毒(LV1和LV2)后，2种慢病毒同时进行转染，而一个细胞中同时转染到两种病毒的效率较低，因此，转染后需要进行复杂的CAR细胞筛选。本发明的基因序列构建的质粒和病毒仅具有一种基因序列，因此可以有效的简化流程，减少工作量，降低生产成本，提高效率。
其中，靶点结合区是单链抗体表达序列，也可以其它结合蛋白表达序列，可以根据靶点进行选择。其它蛋白表达序列，只要是能结合的2个蛋白分子，都可以应用到本发明中，如蛋白分子A与B结合，A的表达序列可以放在靶点结合区，以结合靶点B；也可以将B的表达序列放到靶点结合区，以识别靶点A。
表达区可以表达CAR(嵌合抗原受体)，也可以表达其他的蛋白。例如，表达CAR326(所含的单链抗体为anti-CD326 scFv)或CARHer2(所含的单链抗体为anti-Her2 scFv)，或者CAR326-Her2(所含的单链抗体为anti-CD326 scFv和anti-Her2 scFv的串联体)。
如图2所示，在一个具体实施例中，构建了带有分子开关的CAR基因序列：靶点结合区包括anti-GUCY2C scFv，转录调节区包括synNotch和Gal4VP64；启动子区包括Gal4UAS，表达区包括anti-CD326 scFv(CAR326)或anti-Her2 scFv的表达序列；连接序列包括多聚腺嘌呤核糖核苷酸位点序列。其中，激发部件还包括信号肽CD8αSP(signalpeptide)。
但不限于此，结合区的单链抗体表达序列(anti-GUCY2C scFv)可以根据靶点进行选择。转录调节区的转录调节因子还可以是Gal4ER和TetRVP64等，synNotch基因序列用于表达跨细胞膜的SynNotch受体部分。应答部件由含CMV启动子的Gal4UAS和CAR326组成。CAR326为以抗原CD326为靶点的CAR，组成部件为CD8αSP、anti-CD326 scFv、CD8α铰链区和跨膜区、CD28、CD137和CD3ζ胞内区。
其中，CAR326的氨基酸序列参见SEQ ID NO:3，cDNA序列参见SEQ ID NO:4；Gal4UAS核苷酸序列参见SEQ ID NO:5。激发部件的氨基酸序列参见SEQ ID NO:1，cDNA序列参见SEQ ID NO:2。所述连接序列包括多聚腺嘌呤核糖核苷酸位点序列(synthetic Poly(A)Site)，具体的，连接区的核苷酸连接序列参见SEQ ID NO:6，但不限于此。其中，连接序列不表达蛋白的核苷酸序列。
在另一个实施例中，在表达区设置了第一蛋白表达序列、连接短肽序列和第二蛋白表达序列；如图9所示。第一蛋白表达序列用于表达第一靶点结合蛋白，如CAR326；第二蛋白表达序列用于表达第二靶点结合蛋白，如anti-Her2scFv；并通过一段30个氨基酸左右的连接子(linker)串联在一起。可以避免肿瘤细胞抗原逃逸：肿瘤组织中的肿瘤细胞，一些肿瘤细胞表达第一靶点，一些肿瘤细胞可能表达第二靶点，因此采用针对双靶点(第一靶点和第二靶点)的CAR，利于更彻底清除肿瘤细胞。另外，只有CAR表达以后，才成为CAR细胞(如CAR-T，CAR-NK)，与相应的靶点结合后，CAR-T或CAR-NK被激活，发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。
本发明的基因序列可以进一步封装为质粒和病毒。病毒可以是慢病毒、腺病毒。但不限于此，也可以用于其它基因转导方式：可以封装为睡美人基因(Sleeping Beauty,SB)、PiggyBac(PB)转座子、或者doggybone系统。
具体的，病毒的制备方法包括：
步骤101：合成所述基因序列的cDNA以及核苷酸序列。
步骤102：用所述cDNA以及核苷酸序列制备慢病毒质粒。具体的，慢病毒质粒采用pCCL-CAR。
步骤103：通过慢病毒质粒制备慢病毒：
10cm细胞培养皿含10％FBS的DMEM全培养液培养6x106个HEK293T细胞。第二天细胞达到聚合度80％左右时，换无10％FBS以及无抗生素的培养液。稳定2-3小时后，进行质粒转染。
pCCL-CAR质粒6.9μg，pMDLg-pRRE质粒3.4μg，pMD2.G质粒2μg，pRSV-Rev质粒1.71μg加入1毫升培养液DMEM中，混匀。35μl每毫升1毫克浓度的聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI，分子量25000)加入1毫升培养液DMEM中，混匀。聚乙烯亚胺DMEM液加入到质粒DMEM中，混匀，室温静置20分钟后，加入到含7毫升培养液的细胞培养皿中，轻微混匀。
转染后4小时，换含有FBS的完全培养液。
换液48小时后，收集细胞培养液(含慢病毒)，用0.22μm的滤膜过滤除菌后，26000rpm，4℃离心2小时，用XVivo15全培养液重悬沉淀，分装，-80℃保存备用。
免疫细胞制备：
免疫细胞包括CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-B细胞或CAR-MP细胞。
CAR-T细胞的制备方法包括：
步骤111：获取单核细胞，并进行预培养。
50ml健康人外周血，Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心获得外周血单核细胞，2x106/ml细胞密度加入培养瓶中，X-VIVO 15全培养液，37℃，5％CO2预培养2小时，收集悬浮细胞。
步骤112：将慢病毒转染到预培养后的单核细胞中，经过培养，获取免疫细胞。
1.2x106/ml接种培养瓶，细胞与磁珠1:3比例加CD3/CD28磁珠，加入终浓度100U/ml的白细胞介素2(IL-2)培养过夜，加入慢病毒(multiplicity of infection，MOI 10)，转染后，细胞培养5天，通过磁力架去除磁珠，继续培养，收集免疫细胞液氮保存。
免疫细胞对肿瘤细胞作用测试：
在测试中，如下表所述进行分组测试：
Figure BDA0003121855100000071
其中，转染对照Cart-T的慢病毒中含有CAR326(SEQ ID NO:4)，不具有分子开关。结以下实验数据证明：CAR-T AndGate分子开关被靶点A(GUCY2C)激活，对表达靶点B(CD326)的肿瘤细胞具有明显细胞毒作用。
免疫细胞调密度至每毫升5x104个细胞。肠癌细胞HCT116(GUCY2C-，CD326+)和LS1034(GUCY2C+，CD326+)分别用RPMI-1640全培养液调至每毫升5x104个细胞，取100微升细胞悬液接种于96孔板，加入100微升免疫细胞。37℃，5％CO2细胞培养箱培养，肿瘤细胞和免疫细胞共同培养约40小时。取细胞上清100微升后，加入10微升XTT工作液，继续培养2小时后，酶标仪450纳米波长测定OD值。收集的100微升细胞上清样品，-80℃保存备用。
100微升细胞上清稀释1倍后，用于ELISA检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)。细胞因子如肿瘤坏死因子α(TumorNecrosisFactoralpha，TNFα)和干扰素γ(Interferon gamma,IFNγ)在CAR-T细胞抗肿瘤作用中起着重要的作用。因此，在测试中采用ELSIA方法测定CAR-T细胞和靶细胞(肠癌细胞HCT116和LS1034)以1:1比例共培养时，TNFα和IFNγ在细胞培养液中的含量。
如图4和图5所示，三组免疫细胞中TNFα和IFNγ检测结果对比，HCT116细胞不具有靶点A(GUCY2C)，因此CAR-T And Gate组与HCT116共培养时，分泌的细胞因子与对照组相当，即HCT116细胞对CAR-TAndGate组无刺激效应；LS1034中具有靶点A(GUCY2C)，与CAR-TAnd Gate共培养时，激发CAR326的表达，提高了细胞因子的含量，且具有显著差异性(**表示为p<0.01)。而与对照组比较，CAR-T 326组的TNFα和IFNγ显著增加，即对照Cart-T 326组由于缺少分子开关，分别与HCT116和LS034肠癌细胞共培养中，都能分泌大量细胞因子。其中，差异性数据通过Graphad Prism 8.0分析软件,2Way ANOVA统计分析方法获得。
XTT被活细胞中的代谢酶还原成水溶性的代谢产物在OD450处有吸收峰，OD450值降低，表明活细胞数量少，OD450值高，活细胞量多。CAR-T杀死肿瘤细胞，活细胞数量减少，OD值降低。本实施例，采用XTT方法检测细胞活力。
如图6所示，CAR-T 326组、CAR-TAndGate组分别与靶细胞(肠癌细胞HCT116或LS1034)以1:1比例共培养时，CAR-T 326细胞对所有靶细胞由明显杀伤作用(**p<0.01CAR-T 326组vs对照组)，但CAR-TAndGate细胞只对表达靶点A(GUCY2C)的LS1034肠癌细胞有杀伤作用(**p<0.01LS1034 vs HCT116,)，对没有靶点A的HCT116的杀伤作用与对照组相当，几乎无杀伤作用。
CAR-T AndGate细胞和对照T细胞分别与LS1034肠癌细胞1:1共培养约40小时后，加入HCT116肠癌细胞，继续培养16小时后，XTT方法检测细胞活力。CAR-T AndGate被LS1034细胞激活后，表达CAR326，产生对表达靶点CD326分子的HCT116肠癌细胞杀伤作用，如图7所示。
通过上述细胞水平试验表明，将激活部件和应答部件克隆到一个质粒载体制备一种慢病毒是可行的。具有分子开关的CAR-TAndGate组的免疫细胞首先需要靶点A即GUCY2C分子激活激发部件后，激发部件胞内转录调节因子(TF)从激发部件上分离，进入细胞核内，与含CAR326的应答部件区的核酸序列即GalUAS结合，启动CAR326的转录，表达CAR326。LS1034肠癌细胞表达GUCY2C和CD326靶点分子，HCT116肠癌细胞只表达CD326靶点分子，因此CAR-TAndGate组被LS1034肠癌细胞的GUCY2C靶点A分子激发后表达CAR326，成为CAR-T细胞，对表达靶点CD326的靶细胞具有杀伤作用。CAR-TAndGate组被LS1034激发表达的CAR326分子后，同样对表达靶点CD326的HCT116肠癌细胞产生杀伤作用。
GUCY2C主要肠道组织表达，如小肠和结肠，在心脏组织低丰度表达，在肾脏组织几乎不表达；CD326除了主要在肠道组织表达外，还在肾脏低丰度表达，但在心脏组织几乎不表达。采用具有分子开关的CAR-TAndGate细胞治疗肠癌时，只有在肠道组织的CAR-TAndGate被激发表达CAR326后，特异性地对表达CD326靶点的肠癌细胞产生杀伤作用。而在心脏组织被激发表达CAR326后，由于心脏组织不表达靶点分子CD326，所以CAR-TAndGate细胞不会对心脏产生毒性；同样，在肾脏组织，由于其不表达GUCY2C靶点A分子，因此在肾脏组织的CAR-TAndGate细胞不会被激发而产生CAR326，即便肾脏组织有靶点分子CD326表达，也不会产生肾脏毒性。
由上可知，目前传统的CAR-T细胞没有分子开关，如针对靶点GUCY2C的anti-GUCY2C CAR-T以及针对靶点CD326的anti-CD326 CAR-T(即CAR-T 326)在治疗肠癌时，会有心脏毒性的风险，以及肾脏毒性的风险。
由此可以推断，具有分子开关的CAR-T AndGate细胞在肿瘤区域高密集结并激活，能明显增强其效能，显著降低on-target/off-tumor副反应。
小鼠模型试验
NSG小鼠21只，后背左右两侧分别皮下接种约1.5x106肠癌细胞：左侧接种HCT116细胞，右侧接种LS034细胞。一周后，随机均分为3组，尾静脉注射1.0x107个细胞：对照组，CAR-T 326组，CAR-TAndGate组。其中，肿瘤大小计算公式：(a x b2)/2，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。
对于小鼠左侧的HCT116肿瘤，如图8A，与对照组以及CAR-TAndGate组比较，CAR-T326组明显抑制肿瘤的生长，CAR-TAndGate和对照组一样，不能有效抑制肿瘤生长(**p<0.01,n＝5)。图8B所示，对于LS1034肿瘤，CAR-TAndGate显著抑制肿瘤的生长，明显优于CAR-T 326的治疗效果(**p<0.001,CAR-TAndGate vs对照组/CAR-T 326，n＝5)。
因此，有分子开关的CAR-TAndGate组对肿瘤的治疗效果显著优于传统的CART 326组，可能与CAR-TAndGate在肿瘤区域局部富集并激活、衰竭(exhaustion)显著减缓、持续性(persistence)明显提高有关。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0003121855170000011
Figure IDA0003121855170000021
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Figure IDA0003121855170000101

Claims (10)

1.一种具有分子开关的基因序列，其特征在于，包括激发部件、连接区和应答部件，
所述激发部件包括靶点结合区和转录调节区；
所述应答部件包括表达区和与所述转录调节区相匹配的启动子区。
2.根据权利要求1所述的基因序列，其特征在于，所述靶点结合区包括靶点结合蛋白，
所述靶点结合蛋白包括单链抗体，
所述转录调节区包括synNotch和Gal4VP64；
所述启动子区包括Gal4UAS，所述表达区包括蛋白分子表达序列；
所述连接区的连接序列包括多聚腺嘌呤核糖核苷酸位点序列。
3.根据权利要求2所述的基因序列，其特征在于，所述表达区包括anti-CD326 scFv或anti-Her2 scFv的表达序列；
所述激发部件的基因序列为SEQ ID NO:2；
所述连接序列的基因序列为SEQ ID NO:5；
所述anti-CD326 scFv表达序列为SEQ ID NO:4。
4.根据权利要求2所述的基因序列，其特征在于，所述表达区包括第一蛋白表达序列、连接短肽序列和第二蛋白表达序列；
激发部件上游设置有信号肽。
5.一种质粒，其特征在于，包含如权利要求1-4任一项所述基因序列。
6.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞转染有如权利要求5所述质粒封装而成的病毒颗粒；
所述免疫细胞包括CAR-T细胞、CAR-NK细胞、CAR-B细胞或CAR-MP细胞。
7.根据权利要求6所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞用于杀伤实体瘤细胞或血液肿瘤细胞。
8.根据权利要求6所述的免疫细胞，其特征在于，所述病毒颗粒的制备方法包括：
合成所述基因序列的cDNA以及核苷酸序列；
用所述cDNA以及核苷酸序列制备慢病毒质粒；
通过慢病毒质粒制备慢病毒。
9.根据权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞的制备方法包括：
获取单核细胞，并进行预培养；
将慢病毒转染到预培养后的单核细胞中，经过培养，获取CAR免疫细胞。
10.根据权利要求9所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括CAR-T细胞，
获取CAR-T细胞的方法包括：
取50ml外周血，Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心获得单核细胞；
所述单核细胞以2x106/ml的细胞密度，在X-VIVO 15全培养液、37℃、5％CO2培养2小时，收集悬浮细胞；
悬浮细胞以1.2x106/ml的细胞密度接种到培养瓶内，以细胞比磁珠为1:3的比例加入CD3/CD28磁珠，并加入终浓度100U/ml的白介素2培养过夜；
加入所述慢病毒进行转染；
细胞转染后继续培养5天，通过磁力架去除磁珠，获得CAR-T免疫细胞。
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