CN113388615A - 一种预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA及其制药应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA及其制药应用，属于生物医药技术领域。本发明提供了miR‑133a激动剂在制备抑制急性胰腺炎药物中的应用，明确了miR‑133a激动剂是核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的一种miRNA。通过模拟临床相关的急性胰腺炎模型证实了miR‑133a激动剂能显著改善上述AP模型的发生发展，可用于临床预防/治疗AP。同时，本发明还通过体外腺泡细胞AP模型证实miR‑133a激动剂对急性胰腺炎的保护作用是通过巨噬细胞靶向“清除”损伤的腺泡细胞而实现减轻AP炎症反应、降低AP严重程度的作用。本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究胰腺炎疾病提供了一种新的药物来源，且容易推广应用临床，能够在较短时间内产生巨大的临床应用前景和社会效益。

Description

一种预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA及其制药应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA及其制药应用。

背景技术

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是一类具有起病急，进展快，病死率高的消化道炎症性疾病，发病机制尚不明确。国内外学者认为AP临床病因较为复杂，过量饮酒，胆结石症，高脂血症，十二指肠返流等都可能首先影响腺泡细胞，引起酶原过度激活，诱导AP的发生发展。大多数临床患者仅表现为胰腺局部损伤及炎症反应，经内科保守治疗可恢复，约20％-30％可能因控制不佳或反复发作等进展为重症急性胰腺炎(Sever acutepancreatitis，SAP)，病死率极高，引起临床和基础学者广泛重视(Garg P K,Singh V P,etal.Organ Failure Due to Systemic Injury in Acute Pancreatitis[J].Gastroenterology,2019May；156(7):2008-2023)(Portelli M,Jones C D,et al.Severeacute pancreatitis:pathogenesis,diagnosis and surgical management[J].Hepatobiliary&Pancreatic Diseases International,2017,16(02):45-49.)。

众所周知，AP是一种胰腺外分泌急性炎症性疾病，腺泡细胞的死亡方式决定AP严重程度和预后。早期AP病变主要引起胰腺局部损伤/死亡及炎症免疫细胞浸润。有文献报道，未被及时清除的受损细胞可进一步加重胰腺损伤并累远端脏器，进展为重症急性胰腺炎，引起大量炎症细胞浸润致全身炎症反应。如何在AP早期清除受损的腺泡细胞，在AP研究中尚不可知。文献指出，巨噬细胞可在动脉粥样硬化病变早期被招募至病变处“清除”粥样斑块，改善疾病进展(Kojima Y,Volkmer JP,McKenna K,Civelek M,Lusis AJ,Miller CL,Direnzo D,Nanda V,Ye J,Connolly AJ,Schadt EE,Quertermous T,Betancur P,Maegdefessel L,Matic LP,Hedin U,Weissman IL,Leeper NJ.CD47-blockingantibodies restore phagocytosis and prevent atherosclerosis.Nature.2016Jul20.doi:10.1038/nature18935)。因此，靶向“清除”受损的腺泡细胞或许能成为临床上防治AP的新靶点。

MicroRNAs(miRNAs)是一类近年来备受重视的约19-25个碱基内源性非编码RNA，广泛存在于真核生物中。早期研究证实，miR-133在大多数动物物种中是进化保守的，包括果蝇、人，并且已被证实在小鼠和猪的骨骼肌发育中起重要作用。miR-133包括miR-133a和miR-133b两个成员。miR-133a是一种高度保守的miRNAs。大量临床和基础研究在不同侧面均明确提示miR-133a可参与调控炎症相关性疾病。如在心肌梗死患者及动物模型中，心肌组织中miR-133a表达水平均明显降低，上调mir-133a表达可维持细胞内钙稳态来控制α-肾上腺素能受体途径的下游组分，进而改善心功能(miRNA[9]Hui Li,Yan Wang,Yan-ZhongLi.MicroRNA-133a suppresses the proliferation,migration,and invasion oflaryngeal carcinoma cells by targeting CD47[J].Tumor Biology,2016.Oct 11.016-5451.)(Suzuki S,Yokobori T,Tanaka N,et al.CD47 expression regulated by themiR-133a tumor suppressor is a novel prognostic marker in esophageal squamouscell carcinoma[J].Oncology Reports,2012,28(2):465-472.)。

但是，目前尚未有关于针对急性胰腺炎的MicroRNA的相关报道。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA及其制药应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA，该miRNA为miR-133a激动剂，该miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明公开了miR-133a激动剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用，所述的miR-133a激动剂为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的miRNA。

优选地，所述的药物为通过巨噬细胞靶向清除损伤的腺泡细胞减轻炎症反应的药物。

进一步优选地，所述的药物为显著上调巨噬细胞吞噬作用及吞噬比例的药物。

优选地，所述的药物为改善胰腺损伤的药物。

优选地，所述的药物为降低血清淀粉酶和血清脂肪酶水平的药物。

本发明公开了一种产品，其活性成分为上述的预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA，所述产品的用途至少包括下述用途中的一种：

a)改善急性胰腺炎的炎症反应；

b)增强巨噬细胞清除吞噬作用；

c)抑制急性胰腺炎的疾病发生/发展；

所述产品为药物、添加剂或活性成分剂。

本发明公开了一种用于预防/治疗急性胰腺炎的药物，所述药物是由miR-133a激动剂和药学上可添加的辅料组成，所述的miR-133a激动剂为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的miRNA。

优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。

优选地，所述药物能够通过口服、注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收，以及物理或化学介导的方法导入机体组织中；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了miR-133a激动剂在制备抑制急性胰腺炎药物中的应用，明确了miR-133a激动剂是核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的一种miRNA。本发明通过模拟一种临床相关的急性胰腺炎模型：雨蛙素(100ug/kg，每小时1针，连续7针)腹腔注射诱导C57BL/6小鼠急性胰腺炎；将miR-133a激动剂(agomir-miR-133a)腹腔注射小鼠体内，能显著改善上述AP模型的发生发展，可用于临床预防/治疗AP。同时，本发明通过体外腺泡细胞AP模型验证：①小鼠胰腺腺泡细胞应用胆囊收缩素(CCK)干预6小时，构建AP模型；②266-6细胞(小鼠腺泡细胞癌株)CCK干预12小时，构建AP模型。结果提示miR-133a激动剂对急性胰腺炎的保护作用是通过巨噬细胞靶向“清除”损伤的腺泡细胞而实现减轻AP炎症反应、降低AP严重程度的作用。

本发明提供的抑制急性胰腺炎的药物安全度高，药理作用较强，疗效明确。本发明为预防，诊断，检测，保护，治疗和研究胰腺炎疾病提供了一种新的药物来源，且容易推广应用临床，能够在较短时间内产生巨大的临床应用前景和社会效益。

附图说明

图1为实施例1中雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠胰腺组织miR-133a表达情况及其统计结果；其中，(a)为小鼠胰腺组织miR-133a mRNA水平；(b)-(c)为小鼠胰腺组织miR-133a荧光原位杂交染色图。

图2为实施例2中agomir-miR-133a腹腔注射可显著改善雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠胰腺损伤结果图(水肿，炎症渗出，坏死)；其中，(a)为小鼠胰腺组织HE染色病理图；(b)为胰腺损伤病理评分统计图。

图3为实施例2中agomir-miR-133a腹腔注射可降低雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎血清淀粉酶和血清脂肪酶水平结果图；其中，(a)为血清淀粉酶水平；(b)为血清脂肪酶水平。

图4为实施例2中agomir-miR-133a腹腔注射可显著增加巨噬细胞“胞葬清除作用”；其中，(a)为小鼠胰腺组织电镜图，scar bar＝2uM；(b)为巨噬细胞吞噬损伤腺泡细胞比例统计图。

图5为实施例3中在胆囊收缩素(CCK)诱导的腺泡细胞体外急性胰腺炎模型中miR-133a表达活化情况；其中，(a)为小鼠胰腺腺泡细胞miR-133a mRNA水平；(b)为266-6细胞miR-133a mRNA水平。

图6为实施案例4中agomir-miR-133a上调巨噬细胞吞噬作用,且不影响腺泡细胞死亡(CCK诱导的体外急性AP模型)结果图；其中，(a)为巨噬细胞吞噬腺泡细胞流式图，(b)为细胞CCK8检测水平。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明实施例所用到的实验方法，如没有特殊说明，均为常规方法。实施例中所应用的试剂材料均可常规购买，实施例中涉及的定量实验，均设置至少三次重复实验，结果取平均值。

所用C57/BL6小鼠购买自南京大学模式动物中心。

所用雨蛙素(Caerulein)购买自MCE公司，货号为HY-A0190。

所用胆囊收缩素(CCK)购买自sigma-aldrich公司，货号为T6515。

所用miR-133a激动剂(agomir-miR-133a)于苏州吉玛公司构建；

序列为(5’to 3’)：UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUG GCUGGUUGAAGGGGACCAAAUU(如SEQID NO：1所示)

实施例1:miR-133a在雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎中的表达情况

雨蛙素诱导的小鼠轻症急性胰腺炎模型

实验动物：6-8周雄性C57BL/6J小鼠(体重20-25g)。

将实验动物分为正常对照组和不同时间(3h,6h,12h)模型组。模型组小鼠腹腔注射雨蛙素(100ug/kg，间隔1h，连续7针)构建急性胰腺炎模型。对照组小鼠给予严格PBS对照腹腔注射。留取小鼠血清进行血清酶学水平和炎症因子水平检测。随后，小鼠进行在体心脏灌流，以除去循环中的血液，快速提取胰腺组织进行固定脱水，制作HE染色的石蜡切片和荧光原位杂交染色，结果参见图1，在雨蛙素诱导的急性胰腺炎中，胰腺组织水肿，炎症渗出，腺泡细胞坏死是反应疾病严重程度的重要指标。如图1中(a)所示，通过Q-PCR观察小鼠胰腺组织miR-133amRNA水平显著下降(AP3H胰腺组织miR-133a几乎不表达)；图1(b)-(c)所示，通过荧光原位杂交染色可见miR-133a表达显著下调。

实施例2:miR-133a激动剂在预防/治疗急性胰腺炎中的应用

一、雨蛙素诱导的小鼠急性胰腺炎模型

根据实施例1实际操作和模型诱导情况，选取12h雨蛙素诱导模型作为后续研究。造模方式同实施例1。

二、miR-133a激动剂腹腔注射

模型组小鼠随机分为Control组，AP(acute pancreatitis)组，miR-133a激动剂(1ug/只)预防治疗组，每组7只，于雨蛙素造模前五天连续腹腔注射agomir-miR-133a(溶于PBS溶液)上调miR-133a的表达。对照组小鼠给以严格对照agomir。第六天所有小鼠于腹腔注射雨蛙素构建小鼠AP模型，第一针雨蛙素12h后腹腔注射5％水合氯醛麻醉，留取小鼠血清进行血清酶学水平。随后，小鼠进行在体心脏灌流，以除去循环中的血液，快速提取胰腺组织进行固定脱水，制作HE染色的石蜡切片。

结果如图2和图3所示，可以看出，miR-133a激动剂可以显著改善胰腺组织损伤情况(水肿，炎症渗出和腺泡细胞坏死)，改善血清酶学和血清淀粉酶水平。此外，巨噬细胞对于损伤/死亡的腺泡细胞早期清除作用能够改善小鼠急性胰腺炎损伤情况，且如图4小鼠胰腺组织电镜图(scar bar＝2uM)提示：miR-133a激动剂腹腔注射小鼠体内可显著增加巨噬细胞吞噬作用及吞噬比例。上述结果提示上调miR-133a可能改善或缓解急性胰腺炎的发生发展。*代表显著差异P＜0.05，**代表显著差异P＜0.01，***代表显著差异P＜0.001。

实施例3:miR-133a在胆囊收缩素(CCK)诱导的AP腺泡细胞损伤中表达情况

原代腺泡细胞：提取6-8周C57/BL6雄性小鼠胰腺腺泡细胞，接种于六孔板中，使用1M Hepes培养基(含10％FBS)，37摄氏度，5％CO2温箱中稳定培养。给以CCK建立体外细胞损伤(0h，1h，3h，6h)模型。

小鼠胰腺腺泡细胞癌株(266-6细胞)：将266-6细胞(购买自ATCC库)接种于25cm²细胞培养瓶中，使用DMEM培养基(含10％FBS,100U/ML青霉素和100ug/ml链霉素)，37摄氏度，5％CO₂温箱中稳定培养传代。取对数生长期内状态良好的细胞接种到六孔板，更换新的DMEM培养基，给以CCK建立体外细胞损伤(0h，3h，6h，9h)模型。

通过Q-PCR观察腺泡细胞miR-133a mRNA水平。如图5中(a)和(b)所示，可以看出，miR-133a在坏死的腺泡细胞上低表达。*代表显著差异P＜0.05，**代表显著差异P＜0.01，***代表显著差异P＜0.001。

实施例4:miR-133a激动剂上调巨噬细胞吞噬作用,且不影响腺泡细胞死亡的应用(CCK诱导的腺泡细胞损伤模型)

提取小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)接种到10mm细胞平皿上，使用1640培养基(含10％FBS,100U/ML青霉素和100ug/ml链霉素)培养细胞，同时加入M-CSF刺激因子体外诱导巨噬细胞成熟后接种到24孔板上。应用脂多糖(LPS)诱导BMDM极化。266-6细胞处理同实施案例3。将上述两种细胞进行共培养6小时后收取细胞进行后续实验。具体分组如下：

对照组：培养6小时；

mimic-对照组：转染mimic对照，培养6小时；

CCK+mimic-对照组：每孔加入5uM胆囊收缩素(CCK)和转染mimic-对照，培养6小时；

CCK+mimic-miR-133a组：每孔加入5uM胆囊收缩素(CCK)和转染mimic-miR-133a，培养6小时。

收集各组细胞，进行腺泡细胞示踪染色和免疫细胞染色。结果如图6所示，可以看出，损伤的腺泡细胞会被巨噬细胞吞噬，应用miR-133a激动剂可显著上调巨噬细胞吞噬比例。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

序列表

<110> 扬州大学附属医院；胡良皞；路国涛

<120> 一种预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA及其制药应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 44

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

uuuggucccc uucaaccagc uggcugguug aaggggacca aauu 44

Claims (10)

1.一种预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA，其特征在于，该miRNA为miR-133a激动剂，该miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.miR-133a激动剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用，其特征在于，所述的miR-133a激动剂为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的miRNA。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为通过巨噬细胞靶向清除损伤的腺泡细胞减轻炎症反应的药物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的药物为显著上调巨噬细胞吞噬作用及吞噬比例的药物。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为改善胰腺损伤的药物。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为降低血清淀粉酶和血清脂肪酶水平的药物。

7.一种产品，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述的预防和/或治疗急性胰腺炎的miRNA，所述产品的用途至少包括下述用途中的一种：

a)改善急性胰腺炎的炎症反应；

b)增强巨噬细胞清除吞噬作用；

c)抑制急性胰腺炎的疾病发生/发展；

所述产品为药物、添加剂或活性成分剂。

8.一种用于预防/治疗急性胰腺炎的药物，其特征在于，所述药物是由miR-133a激动剂和药学上可添加的辅料组成，所述的miR-133a激动剂为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的miRNA。

9.如权利要求8所述的用于预防/治疗急性胰腺炎的药物，其特征在于，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。

10.如权利要求8或9所述的用于预防/治疗急性胰腺炎的药物，其特征在于，所述药物能够通过口服、注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收，以及物理或化学介导的方法导入机体组织中；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

Images