CN113383708A - 一种黄瓜胚保存的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及黄瓜组织培养技术领域，尤其涉及一种黄瓜胚保存的方法，其保存黄瓜胚性愈伤组织和胚状体一定时间后，重新恢复生长再生为植株。其保存方法为：将黄瓜胚性愈伤组织和胚状体在保存培养基上进行培养，保存培养基以MS培养基为基础，还需要添加60g/L蔗糖、1.5mg/L 2,4‑D和7％琼脂，PH为5.8，本发明筛选出了特定的培养基，在该培养基上，黄瓜胚性愈伤组织和胚状体不易褐变，且能生长再生为正常小植株。一般黄瓜胚性愈伤组织和胚状体会持续发育生长，逐渐老化至死亡，本发明通过调节蔗糖的浓度比例，阻止了组织老化，可保存胚性愈伤组织和胚状体至少60天，能有效保持胚性愈伤组织的胚性发育能力，可为黄瓜遗传转化持续提供受体材料。
Description
技术领域
本发明涉及黄瓜组织培养技术领域，尤其涉及一种黄瓜胚保存的方法，其保存黄瓜胚性愈伤组织和胚状体一定时间后，重新恢复生长再生为植株。
背景技术
黄瓜(Cucumis sativus L.)是世界上普遍栽培的重要蔬菜之一，黄瓜的清脆口感深受消费者的喜爱。仅利用常规育种无法满足人们对于黄瓜品种、品质方面的需求，
目前利用基因工程技术开展黄瓜分子育种正越来越受到黄瓜育种工作者的重视。进行优良基因的遗传转化是改善其品种、品质的有效途径，易于再生和转化的受体材料是进行黄瓜基因工程育种的前提和基础。由于利用器官发生途径进行黄瓜遗传转化容易形成嵌合体且再生效率不高，因此，目前广泛应用胚状体开展黄瓜遗传转化研究。在黄瓜胚状体诱导再生过程中，外植体脱分化诱导出胚性愈伤组织，胚性愈伤组织发育形成胚状体。胚性愈伤组织和胚状体都可以作为黄瓜遗传转化的受体材料。黄瓜遗传转化需要大量的受体材料。但黄瓜胚状体诱导受基因型等影响较大，诱导效率低且胚性保持困难，极大限制了黄瓜生物技术育种的进程。胚性愈伤组织和胚状体不及时作为受体材料进行遗传转化的话，外植体会继续褐化、老化或者凋亡。重复培养消耗人力，浪费时间。因此，继续寻找简便高效的保持和扩繁黄瓜胚性愈伤组织和胚状体的方法对开展黄瓜遗传转化研究，显得尤为重要和迫切。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种黄瓜胚保存的方法，以解决现有技术存在的如何长期保存黄瓜体细胞胚发生过程中的胚性愈伤组织和胚状体。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种黄瓜胚保存的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：培养黄瓜无菌苗，切取无菌苗的子叶节作为外植体，接种到胚性愈伤组织和胚状体诱导培养基上，得到黄瓜的胚性愈伤组织和胚状体；
步骤2：取培养好的胚性愈伤组织和胚状体，接种到保存培养基上，进行保存培养；
步骤3：将保存60天后的胚性愈伤组织转移到恢复培养基上，得到恢复生长的胚性愈伤组织和胚状体；
步骤4：将得到的胚性愈伤组织和胚状体接种到MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)中，进行培养，使其萌发，获得小植株。
上述步骤1中子叶节获得的具体方法为：将消毒杀菌后的种子接种至MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)上，待子叶生长到下胚轴已伸长，种皮脱落，子叶尚未展开呈闭合状态的时候，切除子叶上部的二分之一，从中间纵向剖开，保留一点下胚轴，除去生长点，获得子叶节。
上述步骤1和步骤3中的诱导培养基和恢复培养基均为：MS+30g/L蔗糖+7％琼脂+1.5mg/L 2,4-D，PH值5.8。
上述步骤2中的保存培养基为：MS+60g/L蔗糖+7％琼脂+1.5mg/L2,4-D，PH值5.8。
上述的MS培养基为MS+30g/L蔗糖+7％琼脂。
上述培养条件均为23℃，光照时间均为16小时/天，光照强度均为2000Lx。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1、利用本发明的黄瓜胚保存的方法可使黄瓜胚性愈伤组织和胚状体得到成功的保存，在一定的时间里储存为受体材料，恢复生长后能成功得到正常植株；
2、本发明方法节省时间，节省人力，一批胚性愈伤组织可以保存后再进行扩繁培养，满足随时的遗传转化大量受体材料的需求；
3、本发明中建立的保存再恢复高效再生体系可以为黄瓜的遗传转化提供更多的受体材料；
4、本发明的方法简单方便操作，具有实用价值，便于推广。
附图说明
图1为本发明中外植体子叶节的图片；
图2为本发明中要保存的胚性愈伤组织和胚状体；
图3为本发明中保存60天后，蔗糖浓度为30g/L(CK)的培养基上的胚性愈伤组织；
图4为本发明中保存60天后，蔗糖浓度为60g/L的培养基上的胚性愈伤组织；
图5为本发明中保存60天后，蔗糖浓度为90g/L的培养基上的胚性愈伤组织；
图6为本发明中保存60天后，蔗糖浓度为120g/L的培养基上的胚性愈伤组织；
图7为本发明中保存60天后，蔗糖浓度为150g/L的培养基上的胚性愈伤组织；
图8为本发明中保存60天后，胚性愈伤组织在60-150g/L蔗糖浓度处理下的重量差异，不同小写字母表示胚性愈伤组织在不同蔗糖浓度处理下的差异显著(P＜0.05)；
图9为本发明中保存60天后，胚性愈伤组织在100-140g/L蔗糖浓度处理下的重量差异，不同小写字母表示胚性愈伤组织在不同蔗糖浓度处理下的差异显著(P＜0.05)；
图10为本发明中保存60天后，蔗糖浓度为100g/L的培养基上的胚性愈伤组织；
图11为本发明中保存60天后，蔗糖浓度为110g/L的培养基上的胚性愈伤组织；
图12为本发明中保存60天后，蔗糖浓度为130g/L的培养基上的胚性愈伤组织；
图13为本发明中保存60天后，蔗糖浓度为140g/L的培养基上的胚性愈伤组织；
图14为本发明中蔗糖浓度为60g/L的条件下保存的胚性愈伤组织恢复胚性分化能力；
图15为本发明中蔗糖浓度为60g/L的条件下保存的胚性愈伤组织恢复胚性分化能力后再生出的小植株。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种黄瓜胚保存的方法步骤为：
步骤1：将消毒杀菌后的种子接种至MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)上，待子叶生长到下胚轴已伸长，种皮脱落，子叶尚未展开呈闭合状态的时候，切除子叶上部的二分之一，从中间纵向剖开，保留一点下胚轴，除去生长点，获得子叶节作为外植体，接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，得到黄瓜的胚性愈伤组织；
步骤2：取培养好的胚性愈伤组织，接种到保存培养基上，进行保存培养；
步骤3：将保存60天后的胚性愈伤组织，转移到恢复培养基上，得到恢复生长的胚性愈伤组织和胚状体；
步骤4：将所述胚性愈伤组织和胚状体接种到MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)中，进行培养，使其萌发，获得小植株。
上述步骤1和步骤3中的诱导培养基和恢复培养基均为：MS+30g/L蔗糖+7％琼脂+1.5mg/L 2,4-D，PH值5.8。
上述步骤2中的保存培养基为：MS+60g/L蔗糖+7％琼脂+1.5mg/L2,4-D，PH值5.8。
上述培养条件均为23℃，光照时间均为16小时/天，光照强度均为2000Lx。
实施例：
本发明所采用的试剂，2,4-D的化学成分为2,4-二氯苯氧乙酸，使用时配制成高浓度母液，即1mg/mL。具体配制方法：准确称量2,4-D 100mg，先用2mL 95％乙醇完全溶解后，加蒸馏水定容至100mL，即配成浓度为1mg/mL的母液。
一种黄瓜胚保存的方法，步骤如下：
1、实验操作
1.1种子消毒：挑选饱满的黄瓜No.14种子，于ddH2O中浸泡2-4小时使种皮软化，清除杂质，然后在超净工作台中用8％的次氯酸钠浸泡消毒15分钟，用无菌水冲洗3遍，再用75％的乙醇处理30s，后用无菌水冲洗3次，放置在已灭菌的滤纸上晾干水分，将种子接种到MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)上，培养条件：23℃，光照2000Lx，光照时间16小时/天。
1.2外植体的获得：将种子接种至MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)上约5-6天时，子叶生长到下胚轴已伸长，种皮脱落，子叶尚未展开呈闭合状态，切除子叶上部的二分之一，从中间纵向剖开，保留一点下胚轴，除去生长点，获得子叶节。
1.3胚性愈伤组织的诱导：将子叶节叶背面朝下，接入2,4-D为1.5mg/L的MS培养基(蔗糖浓度为30g/L)上诱导胚性愈伤组织产生，每瓶接种6个外植体，三次生物学重复(参见图1)。
1.4保存胚性愈伤组织和胚状体：将其转移到不同浓度梯度的高糖培养基(MS+1.5mg/L 2,4-D)上保存，每30天继代一次(参见图2)。观察胚性愈伤组织是否继续老化，失去胚性分化能力。
1.5恢复和再生：60天后将保存的胚性愈伤组织移至2,4-D为1.5mg/L的MS培养基上，出现胚状体后移至MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)上使其萌发，获得再生的小植株。
2、实验结果与分析
将胚性愈伤组织转移至不同浓度梯度的高糖培养基(MS+1.5mg/L 2,4-D)上保存，60天后发现蔗糖浓度为30g/L(CK)的培养基上的胚性愈伤组织已经变褐老化，失去分化能力(参见图3)；蔗糖浓度为60、90、120、150g/L的条件下胚性愈伤组织依旧保持鲜嫩的外表，呈黄色，质黏(参见图4-7)。同时也观察到不同浓度梯度的高糖培养基(MS+1.5mg/L 2,4-D)上保存的胚性愈伤组织的大小发生了变化，将保存的胚性愈伤组织称重，发现与CK相比，不同蔗糖浓度处理下的胚性愈伤重量显著降低，分别是对照重量的36.63％、12.35％、9.88％和6.58％(参见图8)。蔗糖浓度为100、110、130、140g/L的胚性愈伤的重量差异显著(参见图9)。且观察表型发现在100-140g/L的蔗糖浓度下的胚性愈伤组织依然保持胚性，具有鲜嫩的外表，呈黄色，质黏(参见图10-13)。但作为对照的30g/L浓度下的胚性愈伤组织已经老化，呈白化，质硬(参见图3)。说明在蔗糖浓度90-150g/L范围内的培养基上能保存胚性愈伤组织，在此条件下胚性愈伤组织会停止分化，不会成熟老化，且大小和形态都与60天前相差不大，几乎没有发生变化。将在不同蔗糖浓度上的胚性愈伤组织在保存60天后转移至正常蔗糖浓度的培养基上观察恢复其胚状体的分化能力，发现在蔗糖浓度为60g/L的条件下保存的胚性愈伤组织能继续分化，生出胚状体，然后转移到MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)上培育出小植株(参见图14、15)。
根据以上实验结果可知：在保存培养基里调整蔗糖的浓度为60g/L，不仅能有效保存黄瓜的胚性愈伤组织和胚状体。而且不影响之后的胚性发育能力，能重新恢复生长，并且再生为植株。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围。上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的基本原理和主要特征，本领域技术人员阅读本申请后依然可对申请的具体实施方式进行各种变化和修改，但这些变化和修改都包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种黄瓜胚保存的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：培养黄瓜无菌苗，切取无菌苗的子叶节作为外植体，接种到胚性愈伤组织和胚状体诱导培养基上，得到黄瓜的胚性愈伤组织和胚状体；
步骤2：取培养好的胚性愈伤组织和胚状体，接种到保存培养基上，进行保存培养；
步骤3：将保存60天后的胚性愈伤组织转移到恢复培养基上，得到恢复生长的胚性愈伤组织和胚状体；
步骤4：将得到的胚性愈伤组织和胚状体接种到MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)中，进行培养，使其萌发，获得小植株。
2.根据权利要求1所述的一种黄瓜胚保存的方法，其特征在于：所述步骤1中子叶节获得的具体方法为：将消毒杀菌后的种子接种至MS培养基(MS+30g/L蔗糖+7％琼脂)上，待子叶生长到下胚轴已伸长，种皮脱落，子叶尚未展开呈闭合状态的时候，切除子叶上部的二分之一，从中间纵向剖开，保留一点下胚轴，除去生长点，获得子叶节。
3.根据权利要求1或2所述的一种黄瓜胚保存的方法，其特征在于，所述步骤1和步骤3中的诱导培养基和恢复培养基均为：MS+30g/L蔗糖+7％琼脂+1.5mg/L 2,4-D，PH值5.8。
4.根据权利要求3所述的一种黄瓜胚保存的方法，其特征在于，所述步骤2中的保存培养基为：MS+60g/L蔗糖+7％琼脂+1.5mg/L2,4-D，PH值5.8。
5.根据权利要求4所述的一种黄瓜胚保存的方法，其特征在于，所述的MS培养基为MS+30g/L蔗糖+7％琼脂。
6.根据权利要求5所述的一种黄瓜胚保存的方法，其特征在于，所述培养条件均为23℃，光照时间均为16小时/天，光照强度均为2000Lx。
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