CN113376226B - 一种通过反转产电菌的胞外电子传递方向强化其检测水质毒性的方法 - Google Patents
一种通过反转产电菌的胞外电子传递方向强化其检测水质毒性的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种通过反转产电菌的胞外电子传递方向强化其检测水质毒性的方法,主要针对利用产电菌的正向胞外电子传递检测水质毒性时存在着灵敏度较低的问题,通过反转产电菌的胞外电子传递方向,采用产电菌的反向胞外电子传递过程检测水质毒性,利用能够全部地反映产电菌代谢活性的输入电流作为检测水质毒性的电信号,提高产电菌检测水质毒性的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及生物监测技术领域,具体涉及通过反转产电菌的胞外电子传递方向强化其检测水质毒性的方法。
背景技术
随着现代工业的飞速发展,各类有毒污染物对水环境的危害逐渐趋于复杂化和综合化,严重威胁着生态安全和人类健康。传统的理化监测手段(如HPLC、GC-MS、LC-MS等)虽然可以分析常见污染物种类并实现定量,但设备昂贵且操作过程复杂。另外,理化指标仅针对已知的污染物,无法探知水体中可能含有的新型污染物。更重要的是,理化检测结果不能真实反映污染物作用于环境的综合毒性效应,因此,理化监测技术无法快速、有效地应对各种突发性水体污染事件。
生物监测是基于生物与环境相适应的原理,依赖生命应对环境变化做出的反应来反映水质毒性。一般以藻类、蚤类、鱼类和发光细菌等作为指示生物,通过检测有毒物质对生物的运动、形态、呼吸活动及生理代谢的变化来评估水质毒性,一定程度上弥补了理化监测技术的不足。鱼类是最先被应用于水质监测的指示生物,以鱼类的行为强度和生理特征等反映水体的污染程度。鱼类毒性实验可靠性高、易于观察,但存在着培养时间长和检测下限相对较高等不足。藻类作为水环境中主要的初级生产者,可以对水质变化迅速做出反应,通过藻类的生长状况就能够评价水质毒性。藻类具有易于培养、个体小、繁殖快的优势,但由于受基准藻类培养质量的影响,存在着实验结果重复性较差的缺点。蚤类已成为一种国际公认的毒性试验标准受试生物体,以蚤类的存活率、游泳速度等指标进行毒性分析。基于蚤类的生物方法具有操作简单和成本较低等优点,但测试灵敏度低、且实验易受各类因素影响。发光细菌法是发光细菌利用自身胞内特异的荧光酶、还原性黄素、脂肪醛和氧气共同参与完成发光。有毒物质通过抑制酶的活性或抑制胞内与发光反应相关的代谢过程降低荧光强度,此方法已被广泛应用于水体毒性监测领域。但由于发光细菌属于海洋微生物,检测缓冲液需添加2-3%NaCl以维持细菌活性,而NaCl可能会降低重金属的生物利用度并增加有机物的不溶性。此外,发光细菌的发光强度极易受到污染物颜色和浊度干扰,容易出现误报警。总而言之,现有的生物监测方法能够直接反映污染物对生物的具体影响,但存在周期长、重复性差、检测下线较高、误报警等不足,无法满足水质急性毒性监测的需要。
产电菌是一类具有独特的胞外电子传递能力的环境微生物,能够将有机物氧化产生的电子跨膜传递至胞外电子受体或从细胞外的电子供体吸收电子维持能量代谢。产电菌已被证明能够检测水体中重金属、抗生素、有机磷农药等多种污染物,展现出良好的应用前景。产电菌检测水质毒性的基本原理是微生物的活性与产生的电信号呈正相关,当水体中出现有毒污染物时,污染物会干扰产电菌的生长和代谢,影响胞外呼吸过程进而抑制电信号。因此,产电菌能够在不借助额外的信号转导装置的条件下,直接将水质生物毒性转换为电信号,实现对水质毒性的在线监测。当前,研究人员已经对产电菌检测水质毒性技术进行了大量的优化研究,主要包括优化传感器构型、底物浓度、控制模式和进水方式等关键结构和运行参数,但产电菌在水质毒性领域的检测依旧受限于较低的灵敏度,如何准确有效地检测水体中可能含有的微量毒性污染物仍有待解决。此前产电菌在水质监测中的研究主要基于产电菌的正向胞外电子传递过程,即利用有机物作为电子供体,电极为电子受体产生的输出电流作为检测信号。然而,当水体中同时出现有机物和毒性污染物时,由于有机物和毒性污染物对产电菌的正向胞外电子传递过程的影响分别为促进作用和抑制作用,因此最终可能出现假阴性结果。此外,当产电菌利用正向胞外电子传递呼吸时,所产生的电子传递至胞外的比例通常不超过30%,因此输出电流信号仅能反映产电菌部分的呼吸和代谢活性。现有研究发现,当利用产电菌的正向胞外电子传递检测水质毒性时,电流抑制率明显小于微生物活性抑制率,同时还发现,当水体中毒性污染物浓度较低时,尽管产电菌已经明显失活,但输出电流几乎不受影响,只有当污染物浓度超过检测限后,输出电流才出现下降。这些研究结果均表明了产电菌的正向胞外电子传递过程并不能及时反映其代谢活性的下降。
除了正向胞外电子传递外,某些产电菌还具有反向胞外电子传递的能力。当产电菌采用反向胞外电子传递代谢时,产电菌通过将胞外电子转移到胞内维持呼吸作用和能量代谢,因此呼吸作用的还原力全部来源于胞外,能量代谢则全部来源于电能。当产电菌接触到毒性污染物导致代谢活性下降时,污染物的毒性效应会直接降低产电菌的能量代谢水平和反向电子传递速率,进而导致输入电流的下降,因此输入电流可以直接和全部地反映水质毒性。同时,当水体中同时出现有机物和毒性污染物时,两者都会抑制产电菌的反向电子传递速率,因此利用产电菌的反向胞外电子传递可以避免出现假阳性预警。
发明内容
本发明提出了一种通过反转产电菌的胞外电子传递方向强化其检测水质毒性的方法,该方法基于以具有双向胞外电子传递能力的产电菌为核心的微生物电化学水质毒性传感器,通过改变电极电势和添加电子受体反转产电菌的胞外电子传递方向,以产电菌利用反向胞外电子传递生长代谢时的输入电流作为检测水质毒性的电信号,提高产电菌检测水质毒性的灵敏度;所述方法的原理具体为:当产电菌采用正向胞外电子传递进行呼吸作用时,由于呼吸链上产生的电子除用于形成输出电流外还用于ATP合成等生理活动,这导致输出电流信号仅能部分地反映产电菌胞内的能量代谢水平,而反转产电菌的胞外电子传递方向后,产电菌只能利用胞外电子和输入电流维持自身的代谢活性,因此输入电流可以全部地反映产电菌胞内的能量代谢水平;由于产电菌检测水质毒性的基本原理是水体毒性污染物通过抑制产电菌的代谢活性,进而导致其电流变化,因此与利用产电菌的正向胞外电子传递相比,由于在反向胞外电子传递条件下电流信号可以更准确地反映产电菌胞内的能量代谢水平变化,因此利用产电菌的反向胞外电子传递可以更灵敏地检测水质毒性;
该方法具体步骤包括:
(1)构建含有工作电极、对电极、参比电极和电解池的三电极电化学系统;
(2)利用LB培养基纯培养具有双向胞外电子传递能力的产电菌,将一定浓度的菌悬液加入到电化学系统中;
(3)静置一定时间,使产电菌吸附到工作电极上,之后倒掉菌悬液;
(4)无毒水样除氧和配液;
(5)将经过步骤(4)处理后的无毒水样加入至电化学系统中,通过施加特定电势使产电菌利用反向胞外电子传递维持能量代谢,监测并记录电化学系统输入电流;
(6)待测水样除氧和配液;
(7)将除氧后的待测水样加入至电化学系统中,通过施加特定电势使产电菌利用反向胞外电子传递维持能量代谢,监测并记录电化学系统输入电流;
(8)比较步骤(5)和步骤(7)的系统输入电流,判断待测水样水质有无毒性及毒性程度。
(9)如权利要求1所述方法,所述产电菌具体包括Shewanella oneidensis MR-1或Shewanella loihica PV-4。
其中,步骤(1)所述的工作电极为边长1cm的正方形碳布,对电极为直径为0.5mm的铂丝,参比电极为Ag/AgCl电极,电解池的体积为10mL;步骤(2)所述菌悬液的OD600为1.0到2.0;步骤(3)中除氧是持续通入氮气不少于15min;步骤(3)中配液是向水样中额外添加10mM的富马酸或者氧化三甲胺作为电子受体,额外添加1g NaHCO3、0.13g KCl、0.027gCaCl2·2H2O、0.2g MgCl2·6H2O、5.85g NaCl和7.2g HEPES;步骤(5)和(7)所述电势范围为-0.4V到-0.6V,相对于Ag/AgCl参比电极,监测电化学系统输入电流时间为20-30min;步骤(8)根据公式(1)计算电流偏离系数DRi,以评价水质毒性:
DRi=100×(Ib-Ia)/Ib (1)
其中Ib为步骤(5)监测并记录电化学系统输入电流的平均值,Ia为步骤(7)监测并记录电化学系统输入电流的平均值,当10>DRi≥0时,则判断水样水质无毒;当20>DRi≥10时,则判断水样轻微有毒;当DRi≥20时,则判断水样严重有毒。
本发明的优点如下:与现有技术相比,本发明所述方法通过反转产电菌的胞外电子传递方向,以反映产电菌全部代谢活性的输入电流作为检测水质毒性的电信号,能够显著提高产电菌检测水质毒性的灵敏度,可以更有效地对水污染进行早期预警;同时,本发明所建立的方法无需孵育生物膜,可以实现即时检测,适用于水质毒性机动检测和应急检测,对于环保人员现场执法和保障人员临时用水安全具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中胞外电子传递方向对Shewanella oneidensis MR-1检测Cd2+的影响(a.Shewanella oneidensis MR-1以正向胞外电子传递检测Cd2+;b.Shewanellaoneidensis MR-1以反向胞外电子传递检测Cd2+;c.Shewanella oneidensis MR-1在正向和反向胞外电子传递条件下的电流偏离系数比较)
图2为本发明实施例1中胞外电子传递方向对Shewanella oneidensis MR-1检测苯酚的影响(a.Shewanella oneidensis MR-1以正向胞外电子传递检测苯酚;b.Shewanella oneidensis MR-1以反向胞外电子传递检测苯酚;c.Shewanellaoneidensis MR-1在正向和反向胞外电子传递条件下的电流偏离系数比较)
具体实施方式
实施例1
构建4组含有工作电极、对电极和参比电极组成的生物电化学系统(BES1-4)。碳布在使用前需要在丙酮溶液中过夜浸泡,以去除表面残留杂质,次日用超纯水将丙酮溶液充分漂洗干净,然后置于烘箱内烘干,最后进行高温处理。除参比电极外的所有配件需经过高温高压灭菌,参比电极则用75%医用酒精浸泡过夜,最后在洁净工作台(SW-CJ-1F,苏净安泰)内完成电化学系统的组装。
将Shewanella oneidensis MR-1从-80℃低温冰箱中取出,置于37℃水浴锅迅速融化以防止冰晶对细胞造成损伤。将完全融化的菌种接种至100mL LB液体培养基内,然后置于22℃,200rpm摇床内过夜,次日,取1mL新鲜菌液添加至250mL LB液体培养基内再次活化,待菌液OD600≈2时终止培养。
将完成组装的电化学系统分为两组,其中BES1-2采用正向胞外电子传递检测水质毒性,BES3-4采用反向胞外电子传递检测水质毒性。
将菌悬液和无菌电解液加入至4组电化学系统中,其中BES1-2加入正向电解液,而BES3-4加入反向电解液。正向电解液中额外添加10mM乳酸钠作为电子供体,而反向电解液则添加了10mM氧化三甲胺作为电子受体。BES1-2施加+0.5V电势使Shewanella oneidensisMR-1以正向胞外电子传递进行代谢,BES3-4施加-0.5V电势使Shewanella oneidensis MR-1以反向胞外电子传递进行代谢。将所有BES置于22℃恒温培养箱(HPS-500,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)内,并实时记录电化学系统的输出/输入电流。待电流信号基本稳定后向电化学系统加入毒性污染物模拟毒性冲击,计算电流偏离系数评价水质毒性情况。
从图1中可以看到,当持续监测电化学系统20min后,发现输出/输入电流基本稳定,整体的电流波动≤5%。在第20min时,分别向各BES添加不同浓度的毒性污染物以模拟急性毒性冲击。从图1-2中可以看到,当向BES1-4中加入低至0.05mg/L Cd2+或苯酚时,两组BES的电流信号均出现了明显的下降,这表明模式产电菌Shewanella oneidensis MR-1可以有效地对毒性污染物快速响应。
进一步,当各组BES均经历30min毒性冲击后,两组BES的电流下降幅度则出现了明显的不同。具体而言,当采用反向胞外电子传递的BES检测0.05mg/LCd2+时,电流偏离系数为13.2%,当Cd2+浓度增加至0.1mg/L,电流偏离系数为19.8%,当Cd2+浓度增加至0.2mg/L,电流偏离系数为24.7%,当Cd2+浓度增加至0.5mg/L,电流偏离系数为35.4%。然而采用正向胞外电子传递的BES检测0.05mg/L Cd2+时,电流偏离系数仅为5.8%,尽管电流偏离系数也随着Cd2+浓度的增加而增加,分别达到了10.7%(0.1mg/L Cd2+),18.6%(0.2mg/L Cd2+),28.7%(0.5mg/L Cd2+),但采用正向胞外电子传递的BES检测每个浓度Cd2+的电流偏离系数均小于采用反向的BES,表明通过反转产电菌的胞外电子传递方向提高了电化学微生物检测重金属污染物的灵敏度。
相似地,当采用反向胞外电子传递的BES检测0.05mg/L苯酚时,电流偏离系数为16.7%,当苯酚浓度增加至0.1mg/L,电流偏离系数为22%,当苯酚浓度增加至0.2mg/L,电流偏离系数为27.5%,当苯酚浓度增加至0.5mg/L,电流偏离系数为39%。然而采用正向胞外电子传递的BES检测0.05mg/L苯酚时,电流偏离系数仅为6.2%,尽管电流偏离系数也随着苯酚浓度的增加而增加,分别达到了13.1%(0.1mg/L苯酚),18.4%(0.2mg/L苯酚),28.3%(0.5mg/L苯酚),但采用正向胞外电子传递的BES检测每个浓度苯酚的电流偏离系数均小于采用反向的BES,表明通过反转产电菌的胞外电子传递方向提高了电化学微生物检测有机污染物的灵敏度。
通过上述实验结果充分说明了本发明建立的方法能够明显地提升电化学污染物对重金属污染和有机物污染的灵敏度,该技术可以有效灵敏地评价水质毒性,适合应用于水体污染物的早期预警。
Claims (2)
1.一种通过反转产电菌的胞外电子传递方向强化其检测水质毒性的方法,其特征在于:该方法基于以具有双向胞外电子传递能力的产电菌为核心的微生物电化学水质毒性传感器,通过改变电极电势和添加电子受体反转产电菌的胞外电子传递方向,以产电菌利用反向胞外电子传递生长代谢时的输入电流作为检测水质毒性的电信号,提高产电菌检测水质毒性的灵敏度;所述产电菌为Shewanella oneidensis MR-1或Shewanella loihica PV-4;
所述方法具体步骤包括:
(1)构建含有工作电极、对电极、参比电极和电解池的三电极电化学系统;其中,所述的工作电极为边长1cm的正方形碳布,对电极为直径为0.5mm的铂丝,参比电极为Ag/AgCl电极,电解池的体积为10mL;
(2)利用LB培养基纯培养具有双向胞外电子传递能力的产电菌,将一定浓度的菌悬液加入到电化学系统中;其中,所述菌悬液的OD600为1.0到2.0;
(3)静置一定时间,使产电菌吸附到工作电极上,之后倒掉菌悬液;
(4)无毒水样除氧和配液;其中,除氧是持续通入氮气不少于15min;配液是向水样中额外添加10mM的富马酸或氧化三甲胺作为电子受体,额外添加1g NaHCO3、0.13g KCl、0.027gCaCl2·2H2O、0.2g MgCl2·6H2O、5.85g NaCl和7.2g HEPES;
(5)将经过步骤(4)处理后的无毒水样加入至电化学系统中,通过施加特定电势使产电菌利用反向胞外电子传递维持能量代谢,监测并记录电化学系统输入电流;
(6)待测水样除氧和配液;
(7)将除氧后的待测水样加入至电化学系统中,通过施加特定电势使产电菌利用反向胞外电子传递维持能量代谢,监测并记录电化学系统输入电流;
(8)比较步骤(5)和步骤(7)的系统输入电流,判断待测水样水质有无毒性及毒性程度;
其中,步骤(5)和(7)所述电势范围为-0.4V到-0.6V,相对于Ag/AgCl参比电极,监测电化学系统输入电流时间为20-30min。
2.如权利要求1所述方法,其特征在于,步骤(8)根据公式(1)计算电流偏离系数DRi,以评价水质毒性:
DRi=100×(Ib-Ia)/Ib (1)
其中Ib为步骤(5)监测并记录电化学系统输入电流的平均值,Ia为步骤(7)监测并记录电化学系统输入电流的平均值,当10>DRi≥0时,则判断水样水质无毒;当20>DRi≥10时,则判断水样轻微有毒;当DRi≥20时,则判断水样严重有毒。
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