CN111175356B - 一种基于电化学活性微生物同步检测bod和硝态氮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于双向电子传递电化学活性微生物同步检测水体中生化需氧量和硝态氮含量的方法，主要针对现有水体水质生化需氧量和硝态氮检测过程中存在的检测迟滞、操作复杂、成本高昂以及无法同步检测的问题。本方法通过构建以具有双向电子传递能力的电化学活性微生物为核心的生物电化学系统，设置阶跃电势分别测量系统的产电能力和亲电能力，利用系统产电时的输出电流信号、亲电时的输入电流信号以及生化需氧量和硝态氮的标曲模型，即可实现对水体中生化需氧量和硝态氮的快速实时检测。
Description
技术领域
本发明涉及水质检测领域，具体涉及通过电化学活性微生物进行水体水质检测。
背景技术
随着我国工业化和城市化快速发展，人民生活水平有了极大的改善，但作为工业化和城市化的副产物，工业废水和城市污水的排放量也急剧上升，对水体的污染也日趋广泛和严重。根据2018年环境公报显示，我国地表水水质状况仍不容乐观，作为重要的地表水水源地，7大流域中5大流域出现了不同程度的污染，黄河流域、松花江流域和淮河流域呈现轻度污染，而海河流域和辽河流域已中度污染并均出现了生化需氧量(biochemicaloxygen demand,BOD)明显超标。水体中BOD直接反映了可生化有机物的含量，BOD超标会促进水体中微生物的大量生长并降低水体溶解氧，造成水质腐败和恶臭。另一方面，作为渔业等生产生活资料的近海海域、湖泊和水库则由于氮肥的过量使用也出现了不同程度的水质恶化，无机氮含量在四大近海海域均明显超标，且已成为湖泊和水库水体污染的主要污染物。水体中无机氮包括硝态氮、亚硝态氮和氨氮三个形态，其中硝态氮是浮游藻类等水生生物利用氮素生长的主要形态，水体中较高的硝态氮会刺激藻类生长并导致水体的富营养化。因此，监测水体中生化需氧量和硝态氮含量是防治水体污染和保护生态环境的重要环节。
根据《中华人民共和国环境保护行业标准》，BOD检测主要有稀释与接种法和微生物传感器快速测定法。传统的稀释与接种法往往需要较长的检测周期(通常为5天)，检测结果明显滞后于实时水况；尽管微生物传感器快速测定法可以弥补这一不足，实现BOD的快速检测，但需要消耗特制的固定化微生物电极，提高了检测成本。另一方面，硝态氮作为一项理化指标，主要采用酚二磺酸分光光度法、紫外分光光度法、离子色谱法等理化方法，这些方法不仅需要借助复杂的检测设备和繁琐的操作流程，还可能造成二次污染。更重要的是，目前尚没有同步检测水体BOD和硝态氮的检测设备，现有的BOD和硝态氮检测技术分别基于生物学方法和理化方法，增加了水质检测的经济成本和技术门槛。因此，针对现有BOD和硝态氮检测中存在的问题，建立一种检测迅速、操作简便和环境友好的可实时在线检测技术，实现对水体中BOD和硝态氮同步检测具有重要意义。
基于电化学活性微生物的水质检测技术有望实现这一功能。电化学活性微生物是一种具有胞外电子传递能力，可实现化学能和电能双向转换的特殊环境微生物。早期大量研究发现部分电化学活性微生物可以利用不溶性固体例如电极作为电子受体，将呼吸链代谢产生的电子跨膜传递至胞外，这称为产电过程。已有研究发现电化学活性微生物的产电能力与水体中可生化有机物含量在一定范围内具有良好的线性关系，基于这一特性可在1h内实现对水体中BOD的实时在线检测。另一方面，自然界中部分电化学活性微生物还具有亲电功能，即直接利用胞外电子还原可溶性电子受体并维持自身的生长代谢。硝酸根是一种常见的可溶性电子受体，通过将电极上的电子转移到胞内，某些电化学活性微生物能够以硝酸根作为电子受体完成呼吸链电子传递并维持自身代谢。这表明，水体中可溶性硝酸根浓度可直接影响这一电子跨膜进入胞内的进程，基于其电子输入速率可能可以实现对水体中硝酸根浓度的检测。然而目前，关于电化学活性微生物亲电过程和亲电机制的研究还比较少，利用电化学活性微生物检测水体硝态氮的方法和技术也还尚未见报道，而整合电化学微生物独特的产电功能和亲电功能，则有望实现水体中可生化有机物与硝态氮的同步检测，其可行性也有待进一步研究。
发明内容
本发明涉及一种基于双向电子传递电化学活性微生物同步检测水体中生化需氧量和硝态氮含量的方法，其原理是：基于具有双向电子传递能力的电化学活性微生物Shewanella loihica PV-4，当水体中存在可生化有机物时，S.loihica PV-4可以分解有机物并将呼吸链代谢产生的电子传递给固态电极，电子持续流入固态电极形成正向电流，正向电流大小与可生化有机物浓度在一定范围内存在相关性；当水体中存在硝态氮时，S.loihica PV-4也可以直接吸收利用固态电极上的电子还原硝酸盐，电子持续流出固态电极形成负向电流，负向电流大小与硝态氮浓度在一定范围内也存在相关性，通过阶跃检测S.loihica PV-4的正向电流与负向电流即可实现对水体可生化有机物与硝态氮的快速同步检测。
具体的，该基于双向电子传递电化学活性微生物同步检测水体中生化需氧量和硝态氮含量的方法，通过构建以具有双向电子传递能力的电化学活性微生物为核心的生物电化学系统，以待测水样配制电解液并设置阶跃电势分别检测系统的产电性能和亲电性能，利用生物电化学系统产电时的输出电流、亲电时的输入电流以及生化需氧量和硝态氮的标曲模型，实现对水体水样中可生化有机物和硝态氮的快速实时检测。
所述方法的具体步骤如下：
1)以对数生长期的Shewanella loihica PV-4作为种源构建纯培养三电极生物电化学系统，系统内部有效体积为50mL，接种量为15mL光密度为1.0的S.loihica PV-4菌悬液，以10mM乳酸钠为碳源、0.5g/L酵母提取物为氮源，工作电极施加0V(vs.Ag/AgCl电极)恒电势启动并运行生物电化学系统；
2)将生物电化学系统内电解液替换为100mM磷酸盐缓冲液，在工作电极电势为0V的条件下，分别检测电解液中添加1mM和10mM乳酸钠时最大输出电流，设置为i1和i2，在工作电极电势为-0.5V条件下，分别检测电解液中添加0.05mM和0.5mM硝酸钠时最大输入电流，设置为i3和i4，i1-4单位均为微安；
3)将除菌除氧后的待测水体水样作为生物电化学系统的电解液，设置0V和-0.5V阶跃电势，每个电势持续30min，初始电势为0V，检测系统0V时30min输出电流ia以及系统-0.5V时30min输入电流ib，ia-b单位均为微安；
4)根据公式I计算检测水体的生化需氧量C1，其中k1为含有单位mM乳酸钠水体的生化需氧量43.5mg/L，C1单位为mg/L；
5)根据公式II计算水体中以氮计硝态氮含量C2，其中k2为含有单位mM硝酸钠水体中以氮计硝酸盐含量14mg/L，C2单位为mg/L。
如上所述方法中，实验室环境条件下生化需氧量标准模型为：
其中x1为生物电化学系统输出电流信号，方向为正，单位为微安，y1为生化需氧量，单位为mg/L。
如上所述方法中，实验室环境条件下以氮计硝态氮标准模型为：
其中x2为生物电化学系统输入电流信号，方向为负，单位为微安，y2为以氮计硝态氮浓度，单位为mg/L。
本发明的优点如下：与现有检测技术相比，本发明所述方法不需要严苛的检测条件和有害环境的检测介质，同时不需要比色、离子色谱、气相色谱等复杂装置，且本发明利用的生物电化学系统中活性微生物可自我更替，不需繁琐更换电极元件，经简单操作即可对水体中可生化有机物与硝态氮快速和低成本检测。
附图说明
图1为本发明基于双向电子传递电化学活性微生物同步检测水体中生化需氧量和硝态氮含量的流程图；
图2为本发明实施例1中构建的生物电化学系统示意图和实物图；
图3为本发明实施例1中S.loihica PV-4生物电化学系统启动曲线；
图4为本发明实施例1中S.loihica PV-4生物电化学系统产电和亲电过程对底物和电势的依赖曲线；
图5为本发明实施例1中S.loihica PV-4生物电化学系统输出电流与生化需氧量关系曲线及拟合模型和系统输入电流与以氮计硝态氮关系曲线及拟合模型；
图6为本发明实施例1中S.loihica PV-4生物电化学系统同步检测模拟不同C/N比水样输出/输入电流；
具体实施方式
实施例1
首先构建三电极生物电化学系统，包括三电极(工作电极、对电极和参比电极)和电解池。工作电极采用一块2.5cm×2.5cm的碳布(HCP330，上海河森电气有限公司，中国)，碳布使用前经丙酮过夜浸泡、烘干后高温氨化处理。工作电极通过电极夹(J110，天津艾达恒晟科技有限公司，中国)固定，有效面积为5.8cm2。对电极和参比电极分别采用铂片电极(Pt210，天津艾达恒晟科技有限公司，中国)和Ag/AgCl参比电极(R0303，天津艾达恒晟科技有限公司，中国；0.205V vs.标准氢电极)。电解池有效体积为50mL，并通过四氟盖子密封，盖子设置5个孔，其中3个孔分别插入工作电极、对电极和参比电极，另外两个孔为进水口和出水口。所有配件除参比电极外均经过高温高压灭菌，参比电极在75％酒精中过夜浸泡并用紫外辐射灭菌，电化学系统的组装在洁净台内完成。
生物电化学系统组装完成后在洁净工作台内接种。利用Luria-Bertani培养基预先活化Shewanella loihica PV-4，将处于对数生长期的S.loihica PV-4离心并用100mM磷酸盐缓冲液重悬至光密度约为1.0，利用一次性无菌注射器将15mL重悬后菌液和25mL DM培养基加入生物电化学系统，其中DM培养基中含有10mM乳酸钠作为微生物生长的碳源、0.5g/L酵母提取物作为微生物生长的氮源。接种完成后，电解液通过蠕动泵以3mL/min在电解池内自循环，即电解池内水力停留时间约13.3min；利用恒电位仪将工作电极电势设置为0V(vs.参比电极)，记录并监测生物电化学系统的输出电流，待输出电流下降至小于30μA时，将全部电解液更换为新鲜DM培养基。当2个换液周期内最大电流差异小于15％时，即可认为该生物电化学系统启动完成。
图2为实施例中构建的生物电化学系统示意图和实物图，图3为其产电曲线。当生物电化学系统接种S.loihica PV-4后即出现了约25μA的输出电流，此后随着换液周期生物电化学系统最大输出电流能力逐渐升高，当系统经历第7次换液后，系统最大输出电流达到了515μA，且与上一周期内最大电流差异不足15％，表明系统已启动完成。
当系统启动完成后，通过组合特定的电势和底物以测试S.loihica PV-4生物电化学系统产电和亲电能力，以及两者对电势的依赖。如图4可以看到，将电极电势设置为0V，当电解液中含有高浓度可生化有机物(10mM乳酸钠)时，系统有明显的输出电流(约600μA)，而保持电极电势不变，去除溶液中的可生化有机物后输出电流迅速降低在0μA(图4a)，表明了S.loihica PV-4具有良好的分解有机物同步产电能力。相似地，对比电解液中有无硝酸根可以发现S.loihicaPV-4还具有良好的还原硝酸根同步亲电能力(图4c)。进一步观察还可以发现，S.loihica PV-4菌种的产电能力和亲电能力具有电势依赖性，从图4b中可以看出S.loihica PV-4在电势为0V时具有较好的以乳酸钠为底物的正向产电能力，而电势为-0.5V时产电能力则完全消失；与之相反，S.loihica PV-4在-0.5V具有较好的以硝酸根为底物的亲电能力，而0V时亲电能力则完全消失(图4d)。以上结果表明，S.loihica PV-4既具有分解有机物产电能力，也具有还原硝酸根亲电能力，其产电和亲电能力表达需要特定的电势。
图5a展示了S.loihica PV-4生物电化学系统内添加不同浓度乳酸钠后的电流变化趋势(电极电势为0V)；基于Michaelis-Menten方程建立电解液中BOD浓度与最大输出电流的标准曲线(图5b)，拟合结果如方程IV所示：
其中x1为生物电化学系统输出电流信号，方向为正，单位为微安，y1为生化需氧量，单位为mg/L。将电极电势设置为-0.5V，采用相似的方法建立电解液中硝酸根浓度与最大输入电流的标准曲线(图5d)，拟合结果如方程V所示：
其中x2为生物电化学系统输入电流信号，方向为负，单位为微安，y2为以氮计硝酸盐浓度，单位为mg/L。
检测同时含有可生化有机物和硝酸根的水样。分别配置高C/N比电解液及低C/N比电解液，其中高C/N含有3.0mM乳酸钠(生化需氧量130.5mg/L)和0.25mM硝酸根(以氮计硝态氮含量3.5mg/L)，低C/N比含有0.5mM乳酸钠(生化需氧量21.8mg/L)和0.5mM硝酸根(以氮计硝态氮含量7.0mg/L)。图6分别展示了系统在检测不同C/N比水样时输出电流与输入电流随电势变化趋势，可以看到系统在0V时表现出良好的产电性能，而在-0.5V时可迅速切换为良好的亲电性能。分别测量系统在电势恒定30min时的输出/输入电流，利用方程IV和V预测水样中BOD浓度和硝酸根浓度。表1为本发明实施例1中S.loihica PV-4生物电化学系统同步检测水样生化需氧量和以氮计硝态氮的预测和真实结果，结果准确度均超过80％，表明基于双向电子传递S.loihica PV-4可实现高精度的同步检测水体中生化需氧量和硝酸盐含量。
表1
Claims (4)
1.一种基于双向电子传递电化学活性微生物同步检测水体中生化需氧量和硝态氮含量的方法，其特征在于：该方法通过构建以具有双向电子传递能力的电化学活性微生物为核心的生物电化学系统，通过设置阶跃电势分别检测生物电化学系统的产电性能和亲电性能，利用生物电化学系统产电时的输出电流、亲电时的输入电流以及生化需氧量和硝态氮的标曲模型，实现对水体中可生化有机物和硝态氮的快速实时检测；所述具有双向电子传递能力的电化学活性微生物具体为Shewanella loihica PV-4；所述方法的原理具体为：基于具有双向电子传递能力的电化学活性微生物Shewanella loihica PV-4，当水体中存在可生化有机物时，Shewanella loihica PV-4能够分解有机物并将呼吸链代谢产生的电子传递给固态电极，电子持续流入固态电极形成正向电流，正向电流大小与可生化有机物浓度在一定范围内存在相关性；当水体中存在硝态氮时，Shewanella loihica PV-4能够直接吸收利用固态电极上的电子还原硝酸盐，电子持续流出固态电极形成负向电流，负向电流大小与硝态氮浓度在一定范围内也存在相关性，通过阶跃检测Shewanella loihica PV-4的正向电流与负向电流即可实现对水体可生化有机物与硝态氮的快速同步检测；所述生化需氧量的检测采用以下公式I，硝态氮检测采用以下公式II；
其中，C1为水体的生化需氧量，C2为水体中以氮计硝态氮含量，其中k1为含有单位mM乳酸钠水体的生化需氧量43.5mg/L，k2为含有单位mM硝酸钠水体中以氮计硝酸盐含量14mg/L，C2单位为mg/L，C1单位为mg/L，i1和i2为将生物电化学系统内电解液替换为100mM磷酸盐缓冲液、在工作电极电势为0V的条件下、分别检测电解液中添加1mM和10mM乳酸钠时的最大输出电流，i3和i4为在工作电极电势为-0.5V条件下、分别检测电解液中添加0.05mM和0.5mM硝酸钠时的最大输入电流，将除菌除氧后的待测水体水样作为生物电化学系统的电解液、设置0V和-0.5V阶跃电势、每个电势持续30min、初始电势为0V、检测系统0V时30min输出电流为ia以及系统-0.5V时30min输入电流为ib；i1、i2、i3、i4、ia、ib的单位均为微安。
2.如权利要求1所述方法，具体步骤如下：
1)以对数生长期的Shewanella loihica PV-4作为种源构建纯培养三电极生物电化学系统，系统内部有效体积为50mL，接种量为15mL光密度为1.0的Shewanella loihica PV-4菌悬液，以10mM乳酸钠为碳源、0.5g/L酵母提取物为氮源，工作电极施加相对于Ag/AgCl电极的0V恒电势启动并运行生物电化学系统；
2)将生物电化学系统内电解液替换为100mM磷酸盐缓冲液，在工作电极电势为0V的条件下，分别检测电解液中添加1mM和10mM乳酸钠时最大输出电流，设置为i1和i2，在工作电极电势为-0.5V条件下，分别检测电解液中添加0.05mM和0.5mM硝酸钠时最大输入电流，设置为i3和i4，i1-4单位均为微安；
3)将除菌除氧后的待测水体水样作为生物电化学系统的电解液，设置0V和-0.5V阶跃电势，每个电势持续30min，初始电势为0V，检测系统0V时30min输出电流ia以及系统-0.5V时30min输入电流ib，ia-b单位均为微安；
4)根据公式I计算检测水体的生化需氧量C1，其中k1为含有单位mM乳酸钠水体的生化需氧量43.5mg/L，C1单位为mg/L；
5)根据公式II计算水体中以氮计硝态氮含量C2，其中k2为含有单位mM硝酸钠水体中以氮计硝酸盐含量14mg/L，C2单位为mg/L，
3.如权利要求1所述方法，实验室环境条件下生化需氧量标准模型为：
其中x1为生物电化学系统输出电流信号，方向为正，单位为微安，y1为生化需氧量，单位为mg/L。
4.如权利要求1所述方法，实验室环境条件下以氮计硝态氮标准模型为：
其中x2为生物电化学系统输入电流信号，方向为负，单位为微安，y2为以氮计硝态氮浓度，单位为mg/L。
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