CN113373075B - 一种提高筑波链霉菌产孢量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种提高筑波链霉菌产孢量的方法。本发明通过N,N‑二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺或N,N‑二乙基甲酰胺的加入，能够显著诱导筑波链霉菌稳定产生孢子，孢子产量提高36倍以上，解决了筑波链霉菌在常见培养基上不产孢、产孢量少或产孢不稳定的难点，为筑波链霉菌的工业化扩培提供了稳定可靠的方法，保证了他克莫司生产的批间稳定性。该方法操作简便易行，适合工业大生产，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种提高筑波链霉菌产孢量的方法。
背景技术
他克莫司((Tacrolimus，又名FK506)FK506，是从链霉菌属(streptomyces)中分离出的发酵产物，其化学结构属23元大环内酯类抗生素。具有免疫抑制作用强，肝肾移植受体的急、慢性排斥反应小，对细菌和病毒的抵抗力强等优点。
目前他克莫司的获得主要通过细菌微生物(或放线菌发酵)发酵获得。筑波链霉菌是他克莫司的生产菌种，作为优良的工业菌种，除了具有优良的代谢能力以外，还必须易于扩大培养、具有良好的保藏稳定性。由于孢子比菌丝体具有更强的抗逆性和存活能力，从而更适于长期保存和扩大培养，因此培养出大量孢子是发酵生产稳定的前提。如果筛选获得了具有优良性状的菌株，但因产孢量低而满足不了工业化生产使用需求，该菌株也是难以被产业化应用的。因此，孢子的形成情况对菌种保藏稳定性、批次间稳定性及产品质量起着非常重要的作用。然而，在实验中发现，筑波链霉菌产孢数量并不理想，尤其在长期多代培育之后，产孢量少甚至不产孢。
中国专利CN201510664099.X提供一种基因工程菌株筑波链霉菌L21，通过基因工程提高他克莫司生物合成途径中的特异性调控基因的拷贝数，作为基因改造他克莫司生物合成途径中的限速酶以提高他克莫司的产量，以降低工业化生产过程的成本。
中国专利CN200510013322.0通过对制备他克莫司的原始模式菌进行激光诱变来提高他克莫司的产量。
以上两篇专利，通过基因改造或物理诱变的方法获得了新的高产菌株，但是未提及新菌株的产孢能力及提高孢子产量的方法。
中国专利CN201810085143.5通过向FK506发酵过程中外源添加化学触发剂提升FK506产量。该专利也未提及菌株的产孢能力及提高孢子产量的方法。中国专利CN201410058407.X提供一种链霉菌孢子的生产方法，该方法仅适用于跟链霉菌有关的农用微生物，经验证筑波链霉菌在该固体培养基上不产孢。
菌种选育主要指通过诱变、融合等技术手段、结合大量的筛选工作，来获得高产菌株，而获得的高产菌株往往由于产孢量的不足导致高产菌株不稳定以至难以被产业化应用。现有技术往往仅关注菌种选育，均未提及增加筑波链霉菌产孢量的方式、方法。为了易于保藏、扩大培养，改良产孢方法增加产孢量是筑波链霉菌工业化生产他克莫司的一个难题。
发明内容
鉴于现有技术存在的诸多缺陷，本发明提供了一种提高筑波链霉菌在固体培养基产孢量的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种提高筑波链霉菌产孢量的固体培养基，所述固体培养基包含调节剂。
优选地，所述调节剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺中的一种或多种。
优选地，所述调节剂的添加量为0.1％-3％。
更优选地，所述调节剂的添加量为0.5％-2％。
进一步优选地，所述调节剂的添加量为1.0％。
一种提高筑波链霉菌在固体培养基产孢量的方法，其步骤为：
a、取产孢少或不产孢的筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)菌种接种于斜面培养基，进行活化。
b、挑取活化的菌体或孢子，转接至固体培养基平板，置于恒温培养箱培养。
本发明中，步骤a中所述斜面培养基含有调节剂或所述斜面培养基不含有调节剂。
本发明不限定斜面培养基组分，任何现有的用于菌体培养的斜面培养基均可用于本发明。
本发明中，步骤b中所述固体培养基含有调节剂。
本发明不限定固体培养基组分，任何现有的用于菌体培养的固体培养基中加入调节剂均可用于本发明。
本发明中，步骤a中所述斜面培养基与步骤b中所述固体培养基组分相同或不同。
一种提高筑波链霉菌在固体培养基产孢量的方法，其具体步骤为：
a、取产孢少或不产孢的筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)菌种接种于斜面培养基培养7-12天，进行活化。
b、挑取活化的菌体或孢子，转接至含有调节剂的固体培养基平板，置于恒温培养箱培养10天。
本发明中，步骤a中所述的筑波链霉菌可以是现有的各种产他克莫司的筑波链霉菌，在一优选实施方案中，所述筑波链霉菌为筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)No.9993。
优选地，步骤b中所述调节剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺中的一种或多种。
优选地，所述调节剂的添加量为0.1％-3％。
更优选地，所述调节剂的添加量为0.5％-2％。
进一步优选地，所述调节剂的添加量为1.0％。
任何现有技术中可用于菌体培养的固体培养基中加入调节剂均可实现本发明。本发明不限定固体培养基组分，任何现有的用于筑波链霉菌菌体培养的固体培养基均可用于本发明。在一个实施方式中，步骤b所述的固体培养基还包含可溶性淀粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、氯化锰、琼脂、调节剂、蒸馏水。
在另一个实施方式中，步骤b所述的固体培养基还包含麦芽浸出汁、酵母浸粉、葡萄糖、琼脂、调节剂、蒸馏水。
在另一个实施方式中，步骤b所述的固体培养基还包含蔗糖、燕麦粉、琼脂、调节剂、蒸馏水。
进一步地，在一个实施方式中，步骤b所述的固体培养基包含可溶性淀粉10.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，FeSO4.7H2O 0.001g，MnCl2.7H2O 0.001g，琼脂20.0g，调节剂1～30g，蒸馏水1000ml。
在另一个实施方式中，步骤b所述的固体培养基包含麦芽浸出汁10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，琼脂20.0g，调节剂1～30g，蒸馏水1000ml。
在另一个实施方式中，步骤b所述的固体培养基包含蔗糖1.0g，燕麦粉2.0g，琼脂1.7g，调节剂1～30g，蒸馏水1000ml。
以下内容进一步详述一种提高筑波链霉菌在固体培养基斜面产孢量的方法，包括如下步骤：
a、取产孢少或不产孢的筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)菌种划线或涂布接种于斜面培养基(可溶性淀粉10.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，FeSO4.7H2O 0.001g，MnCl2.7H2O 0.001g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml中，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔。
b、挑取活化平板上的菌体或孢子，转接至固体培养基(可溶性淀粉10.0g，K2HPO4
1.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，FeSO4.7H2O0.001g，MnCl2.7H2O 0.001g，琼脂20.0g，0.1％-3％调节剂，蒸馏水1000ml，平板，置于28℃恒温培养箱培养10天。在培养过程观察菌落形态，并于10天后采用稀释涂布法对产生的孢子量进行计数。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和积极效果：
通过调节剂的加入，能够显著诱导筑波链霉菌稳定产生孢子，孢子产量可提高36倍以上，解决了筑波链霉菌在常见培养基上不产孢、产孢量少或产孢不稳定的难点，为筑波链霉菌的工业化扩培提供了稳定可靠的方法，保证了他克莫司生产的批间稳定性。该方法操作简便易行，适合工业大生产，具有很好的应用前景。
具体实施方式
虽然本发明己以较佳实施例公开如下，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的推演与替换。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，同比例放大或缩小试验也在本发明的保护范围之内。
发酵过程中所需试剂无特殊说明均可来自商业途径(市售可得)。
实施例1
1)取筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)No.9993菌种划线接种于斜面培养基ISP4(可溶性淀粉10.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，FeSO4.7H2O 0.001g，MnCl2.7H2O 0.001g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml中，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔。
2)挑取活化平板上的菌体或孢子，划线转接至含有0.0％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％二甲基亚砜的ISP4固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱培养10天。在培养过程观察菌落形态，并于10天后采用稀释涂布法对产生的孢子量进行计数。
实施例2
1)取筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)No.9993菌种划线接种于斜面培养基ISP4(可溶性淀粉10.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，FeSO4.7H2O 0.001g，MnCl2.7H2O 0.001g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml中，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔。
2)挑取活化平板上的菌体或孢子，划线转接至含有0.0％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％N,N-二甲基甲酰胺的ISP4固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱培养10天。在培养过程观察菌落形态，并于10天后采用稀释涂布法对产生的孢子量进行计数。
实施例3
1)取筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)No.9993菌种划线接种于斜面培养基ISP4(可溶性淀粉10.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，FeSO4.7H2O 0.001g，MnCl2.7H2O 0.001g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml中，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔。
2)挑取活化平板上的菌体或孢子，划线转接至含有0.0％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％二甲基乙酰胺的ISP4固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱培养10天。在培养过程观察菌落形态，并于10天后采用稀释涂布法对产生的孢子量进行计数。
实施例4
1)取筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)No.9993菌种划线接种于斜面培养基ISP4(可溶性淀粉10.0g，K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O 1.0g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g，FeSO4.7H2O 0.001g，MnCl2.7H2O 0.001g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml中，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔。
2)挑取活化平板上的菌体或孢子，划线转接至含有0.0％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％N,N-二乙基甲酰胺的ISP4固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱培养10天。在培养过程观察菌落形态，并于10天后采用稀释涂布法对产生的孢子量进行计数。
实施例5
1)取筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)No.9993菌种划线接种于斜面培养基ISP2((麦芽浸出汁10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml中，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔。
2)挑取活化平板上的菌体或孢子，划线转接至含0.0％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％N,N-二乙基甲酰胺的ISP2固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱培养10天。在培养过程观察菌落形态，并于10天后采用稀释涂布法对产生的孢子量进行计数。
实施例6
1)取筑波链霉菌(Streptomyces tsukubaensis)No.9993菌种划线接种于燕麦琼脂固体培养基(蔗糖1.0g/L，燕麦粉2.0g/L，琼脂1.7g/L，蒸馏水，pH＝7.0)中，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔。
2)挑取活化平板上的菌体或孢子，划线转接至含有0.0％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％二甲基亚砜的燕麦琼脂固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱培养10天。在培养过程观察菌落形态，并于10天后采用稀释涂布法对产生的孢子量进行计数。
验证实施例1
孢子量测定结果见表1。
表1不同培养条件测试结果
孢子量测定结果见表1。
表1不同培养条件测试结果
添加调节剂的平板第4-6天开始菌苔变成白色，第7-8天开始产生大量灰色孢子，未添加调节剂的平板直至培养至10天，仅产生少量白色孢子；孢子量计数结果显示，添加调的平板普遍要比同等条件下未添加调节剂的平板产生的孢子量多，添加调节剂的平板产生的孢子数最高为2.6×1011个/皿，其未添加调节剂的平板产生的孢子数为7.1×109个/皿，孢子量提高了36倍以上。
验证实施例2
1、孢子稳定性
待实施例1-6中添加0.0％调节剂的固体培养基平板和添加1.0％调节剂的固体培
养基平板培养的孢子成熟后，刮取平板内的孢子至20ml灭过菌的20％甘油水溶液(甘油含量20％)中。用移液枪吹打均匀后，将甘油孢子液均分至20只PE冻存管中，于-80℃保存。分别于第0天、6个月、12个月各取三支冻存管，进行孢子复苏，计算冻存管中的孢子存活量及存活率，结果见表2。
表2筑波链霉菌孢子存活率测定
Claims (3)
1.一种提高筑波链霉菌（Streptomyces tsukubaensis）No.9993产孢量的方法，其特征在于，步骤如下：
a、取筑波链霉菌的菌种接种于斜面培养基，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔；
b、挑取活化的菌体或孢子，转接至固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱持续培养10天；
所述斜面培养基由可溶性淀粉，K2HPO4，MgSO4.7H2O，NaCl，(NH4)2SO4，CaCO3，FeSO4.7H2O，MnCl2.7H2O，琼脂，蒸馏水组成；所述固体培养基由可溶性淀粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙、硫酸亚铁、氯化锰、琼脂、调节剂、蒸馏水组成；所述调节剂选自N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、N,N-二乙基甲酰胺中的一种；所述调节剂的添加量为0.5~1%。
2.一种提高筑波链霉菌（Streptomyces tsukubaensis）No.9993产孢量的方法，其特征在于，步骤如下：
a、取筑波链霉菌的菌种接种于斜面培养基，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔；
b、挑取活化的菌体或孢子，转接至固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱持续培养10天；
所述斜面培养基由麦芽浸出汁、酵母浸粉、葡萄糖、琼脂、蒸馏水组成；所述固体培养基由麦芽浸出汁、酵母浸粉、葡萄糖、琼脂、调节剂、蒸馏水组成；所述调节剂为N,N-二乙基甲酰胺；所述N,N-二乙基甲酰胺的添加量为0.5~1%。
3.一种提高筑波链霉菌（Streptomyces tsukubaensis）No.9993产孢量的方法，其特征在于，步骤如下：
a、取筑波链霉菌的菌种接种于斜面培养基，置于28℃恒温培养箱培养7-12天进行活化，至平板生长满白色或灰色菌苔；
b、挑取活化的菌体或孢子，转接至固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱持续培养10天；
所述斜面培养基由蔗糖、燕麦粉、琼脂、蒸馏水组成；所述固体培养基由蔗糖、燕麦粉、琼脂、调节剂、蒸馏水组成；所述调节剂为二甲基亚砜；所述二甲基亚砜的添加量为0.5~1%。
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| CN103060248A (zh) * | 2011-10-19 | 2013-04-24 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 一种构建基因工程fk506高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株 |
| CN105176904A (zh) * | 2015-10-15 | 2015-12-23 | 浙江大学 | 基因工程菌株筑波链霉菌l21及其应用 |
-
2020
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012026665A1 (en) * | 2010-08-24 | 2012-03-01 | Ewha University - Industry Collaboration Foundation | Novel tacrolimus derivatives, a neuroprotective composition comprising the same, an immunosuppressive composition comprising the same, a method for preparing the same, and a mutant for producing the same |
| CN103060248A (zh) * | 2011-10-19 | 2013-04-24 | 中国科学院上海有机化学研究所 | 一种构建基因工程fk506高产菌株的方法和筑波链霉菌高产菌株 |
| CN105176904A (zh) * | 2015-10-15 | 2015-12-23 | 浙江大学 | 基因工程菌株筑波链霉菌l21及其应用 |
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