CN113368120B

CN113368120B - 一种柴胡皂苷在抗结肠癌中的应用

Info

Publication number: CN113368120B
Application number: CN202110863977.6A
Authority: CN
Inventors: 付雪艳; 刘乾松; 张义伟; 李婷婷; 张晓静; 刘珍珍; 董琳
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2021-07-29
Filing date: 2021-07-29
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2041-07-29
Also published as: CN113368120A

Abstract

本发明公开了一种柴胡皂苷在抗结肠癌中的应用，属于医药技术领域。本发明通过使用柴胡皂苷B4对抗结肠癌细胞，能够特异性可以上调结肠癌细胞的凋亡相关基因和蛋白的表达，下调抑凋亡基因和蛋白的表达，使结肠癌细胞死亡率升高，为结肠癌的治疗及研究做出贡献。

Description

一种柴胡皂苷在抗结肠癌中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种柴胡皂苷在抗结直肠癌中的应用。

背景技术

结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处，以40～50岁年龄组发病率最高，男女之比为2～3：1。发病率占胃肠道肿瘤的第3位。结肠癌主要为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。大体形态呈息肉状、溃疡型等。结肠癌可沿肠壁环行发展，沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润，除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外，还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。

结肠癌复杂的发病机制目前为止尚没有研究能够准确阐明，从而导致结肠癌的早期诊断和治疗非常困难，加之生活环境与个人不良生活习惯的影响，发病率高也是结肠癌的一大特点。目前公认的结肠癌发病机制是由多种因素、多个靶点、多种基因和多个信号通路相互作用的结果。治疗手段多以手术为主，多学科综合治疗。为了保证手术效果，通常还会进行化疗、免疫治疗、放疗、靶向治疗、等。但手术治疗术后并发症多、高龄患者较难接受。放射治疗周期长、费用高、毒副反应严重。结肠癌现有的化疗药物有氟尿嘧啶、奥沙利铂等，化疗效果虽然明显但是不良反应多且严重，部分药物之间存在配伍禁忌、化疗细胞容易产生耐药性等问题增大了患者治疗的难。

因此，如何提供一种柴胡皂苷对抗结肠癌是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种柴胡皂苷在抗结肠癌中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种对抗结肠癌的药物，包括：柴胡皂苷B4，分子式如下：

优选的，所述结肠癌为SW480和SW620结肠癌细胞；

优选的，所述柴胡皂苷B4有效浓度为12.5-200μg/mL；

柴胡皂苷B4在制备抗结肠癌药物中的应用；

优选的，其特征在于，所述结肠癌为SW480和SW620结肠癌细胞；

优选的，所述柴胡皂苷B4有效浓度为12.5-200μg/mL；

柴胡皂苷B4能够使SW480和SW620结肠癌细胞失去正常形态或使细胞质浓缩；

柴胡皂苷B4促进Bax、Caspase3和Caspase9基因的表达；

所述Bax、Caspase3和Caspase9基因为凋亡蛋白基因；

柴胡皂苷B4促进Bax、Caspase3、Caspase9、Cleaved Caspase3和CleavedCaspase9的蛋白表达；

所述Bax、Caspase3、Caspase9、Cleaved Caspase3和Cleaved Caspase9基因编码的蛋白为凋亡蛋白；

柴胡皂苷B4下调Bcl2蛋白的表达水平；

所述Bcl2基因编码的蛋白为抑凋亡蛋白；

柴胡皂苷B4下调PI3K、Akt和mTOR蛋白的表达水平；

柴胡皂苷B4下调p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表达水平；

柴胡皂苷B4下调PI3K、Akt、mTOR基因的转录水平；

所述PI3K、Akt、mTOR基因编码的蛋白为磷酸化蛋白。

综上所述，本发明公开了一种柴胡皂苷在抗结肠癌中的应用。通过使用柴胡皂苷B4对抗结肠癌细胞，能够特异性可以上调结肠癌细胞的凋亡相关基因和蛋白的表达，下调抑凋亡基因和蛋白的表达，使结肠癌细胞死亡率升高，为结肠癌的治疗及研究做出贡献。

附图说明

图1为SSB4检测SW480(c)、SW620(d)细胞存活率折线图；

图2为SSB4作用于SW480、SW620细胞形态图；a、d分别为SW480、SW620正常细胞，b、e分别为25μg/mL SSB4处理后SW480、SW620细胞形态；

图3流式细胞术检测结果；a、d为SW480、SW620正常细胞检测结果，b、e为25μg/mLSSB4处理后SW480、SW620细胞检测结果；

图4为SW480、SW620细胞凋亡率；

图5为SB4对SW480、SW620细胞核形态凋亡性影响(×200)；a、d为SW480、SW620正常细胞检测结果，b、e为25μg/mL SSB4处理后SW480、SW620细胞检测结果；

图6为蛋白标准曲线图；

图7为经SSB4处理后，SW480、SW620细胞Bax、Caspase3、Caspase9及Cle avedCaspase3、Cleaved Caspase9蛋白的表达图，β-action为内参；

图8为经SSB4处理后，SW480、SW620细胞Bax、Caspase3、Caspase9及Cle avedCaspase3、Cleaved Caspase9蛋白相对表达量柱形图；

图9为经SSB4处理后，SW480、SW620细胞Bax、Bcl2、Caspase3和Caspase9mRNA的相对表达量；

图10为经SSB4处理后，SW480、SW620细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-Mt or/mTOR蛋白表达图，β-action为内参，；

图11为经SSB4处理后，SW480、SW620细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-Mt or/mTOR蛋白相对表达量柱形图；

图12为经SSB4处理后，SW480、SW620细胞，pI3K、AKT、mTOR mRNA相对表达量柱形图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

细胞株：

人结肠癌细胞SW480、SW620(购自上海沪宇生物科技有限公司)。

主要仪器：

主要试剂：

L-15完全培养基：

取50mL ep管，加5mL(10％)胎牛血清(FBS)、500μL(1％)青链霉素混合液，加L-15培养基至50mL即得L-15完全培养基，4℃保存备用。

药物溶液的配制：

柴胡皂苷B4溶液：取柴胡皂苷B4冻干粉适量，以DMSO为溶剂配制成100mg/mL的母液，再以L-15完全培养基逐级稀释为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL的药物溶液。

细胞培养:

细胞复苏：将冻存细胞37℃快速复温，加9mL的L-15完全培养基，混匀、离心、弃上清。适量L-15完全培养基重悬，并于37℃5％CO2条件下恒温培养。

细胞传代：无菌PBS将贴壁细胞洗涤两遍，EDTA-胰酶消化，收集细胞悬液，离心，L-15完全培养基重悬，转入2～3个细胞培养瓶，37℃5％CO2条件下恒温培养。

细胞冻存：按细胞传代方法处理细胞，离心，加入1mL无血清细胞冻存液，放入程序降温盒中，24h后转入液氮冻存。

后续细胞实验均选取对数生长期细胞铺板。

CCK-8法检测细胞增殖

按照1×10^4/孔的浓度将细胞接种于96孔板，培养24h后，换培养基为25μg/mL柴胡皂苷B4溶液，5％CO₂37℃条件下分别持续培养24h、48h、72h。培养结束后，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续在37℃条件下孵育4h后，在酶标仪450nm条件下测定各孔的吸光度值(OD值)。按如下公式计算可得到SSB4作用后结肠癌细胞SW480、SW620的细胞存活率。

细胞增殖的存活率(％)＝(药物处理组-空白对照组)/(正常对照组-空白对照组)×100。

细胞形态学观察

按照2×10⁵/孔的浓度将细胞接种于6孔板，培养24h后，换培养基为25μg/mL柴胡皂苷B4溶液，并设置正常对照组，5％CO₂37℃条件下持续培养24h，在显微镜下观察细胞形态。

流式细胞术检测凋亡

按照2×10⁵个细胞/孔的密度将细胞接种于6孔板，培养24h后将培养基换为25μg/mL柴胡皂苷B4溶液，并设置正常对照组，5％CO₂37℃条件下持续培养24h。而后按照试剂盒说明书处理细胞并加入1×AnexinⅤ结合液和PI染色液，立即进流式细胞仪检测。

Hoechst 33258染色观察细胞核形态

按照2×10⁵/孔的浓度将细胞接种于6孔板，培养细胞爬片，培养24h后将培养基换为25μg/mL柴胡皂苷B4溶液，并设置正常对照组，5％CO₂37℃条件下持续培养24h。而后按照试剂盒说明书固定细胞并染色。在荧光显微镜下观察并采集图像，紫外光340nm波长激发，发射波长460nm。

Western Blot检测

主要试剂配制

①10×电泳液：

②10×转膜液：

转膜时按照10×转膜液：甲醇：去离子水＝10：15:75的比例配制得到1×转膜液。

③10×TBST：

洗膜时取100mL的10×TBST加去离子水至1000mL，再加2mL吐温20即得1×TBST。

④蛋白裂解液：

配置好后冰上保存备用。

⑥BCA工作液：试剂盒中A、B工作液体积比50:1，现用现配。

⑦10％过硫酸铵:1.0g过硫酸铵粉末，加适量去离子水至10mL，分装并保存至-20℃冰箱备用。

全蛋白提取

按照4×105个/孔的浓度将细胞接种于6孔板，5％CO₂37℃条件下培养24h后，将培养基换为25μg/mL柴胡皂苷B4溶液，继续相同条件培养24h，并设置正常对照组。24h后收集所有细胞，按照全蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白。

蛋白浓度检测

取一块酶标板，按照下表加入试剂盒中的试剂，然后根据样品数量配制BC A工作液，每孔加200μL。上述提取好的蛋白提取液每孔加4μL，加去离子水16μL(即稀释5倍)，并设置三个复孔，每孔也加入BCA工作液200μL。

表1蛋白标准曲线表

Table 1 Protein standard curve table

将酶标板放入预热好的酶标仪中，选择震荡模式，设置震荡时间为30s，震荡完后37℃孵育30min。孵育完成后检测其OD值，用Office 2019软件绘制标准曲线，根据蛋白提取液样品的OD值即可求得相应蛋白浓度。

蛋白变性

检测完浓度后将蛋白提取液与上样Buffer(5：1)混合均匀，干式恒温器100℃加热10min使蛋白变性后分装，放在-80℃冰箱保存备用。

Western Blot

SDS-PAGE凝胶的制备：取干燥洁净的玻璃板，组装好制胶架，按照下表加入各种成分配制下层分离胶：

表2配制不同体积分离胶成分

Table 2 preparation of separate gel composition tables of differentvolumes

等待30min，分离胶完全凝固后，按照下表配制上层浓缩胶：

表3配制不同体积浓缩胶成分

Table 3 preparation of concentrated gum composition tables ofdifferent volumes

加入对应成分后，迅速插入10孔梳子(不能产生气泡)，等待上层浓缩胶凝固后即可进行下一步。

②电泳：按照计算好的上样体积在上样孔中加入蛋白质样品和Marker,蛋白上样量为40μg。加样完成后，上层浓缩胶以80V、下层分离胶以120V室温条件下电泳。

③转膜：电泳结束后，将电泳结束的凝胶取出，根据Marker显示的不同分子量的蛋白标识，在各个目的蛋白相对应的位置将凝胶切成条状，放置于用1×转膜液浸湿的滤纸上，以甲醇活化好的PVDF膜完全覆盖凝胶，并排出凝胶与PVDF膜之间的气泡，200mA恒流转膜。

④封闭：5％脱脂奶粉中封闭1h。

⑤一抗孵育：按照说明书稀释一抗，4℃孵育过夜。

⑥二抗孵育：回收一抗，洗膜，而后加入稀释好的二抗，室温孵育1h。

⑦显影：按照说明书配置显影液，将PVDF膜蛋白面朝上放置，放入显影仪曝光，并保存结果。

RT-PCR检测凋亡相关因子mRNA水平

按照上述细胞培养的方法培养细胞，按照说明书提取RNA并制备cDNA，而后进行RT-PCR：

引物序列

表4引物序列表

Table 4 primer sequence table

RT-PCR检测PI3K/Akt/mTOR通路相关因子mRNA水平

mRNA提取方法，cDNA制备方法及Real-time PCR反应体系同实列一，检测PI3K、Akt、mTOR的mRNA水平，引物如下：

反应体系

表5反应体系成分表

Table 5 composition table of reaction system

按照以下程序进行扩增反应：5℃-30s进行预变性，而后95℃-10s，60℃-30s循环反应，设置循环数为40，反应完成后保存结果，以各组Ct值进行计算。

统计学处理

采用SPSS20.0统计软件进行数据分析。所有计量资料以均数±标准差

表示，多组间比较用方差分析法，组内比较用t检验，与对照组相比P＜0.05为有统计学差异。

实施例1 CCK-8法检测细胞增殖

将上述获得200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL的柴胡皂苷B4溶液处理SW480和SW620细胞，以2μL/mL的DMSO为对照；处理SW480细胞24h后，如图1所示，25～200μg/mL浓度范围内，细胞存活率显著降低，与正常对照组相比差异显著(P＜0.01)，处理48h、72h后，12.5～200μg/mL浓度范围内，与正常对照组相比细胞存活率显著降低(P＜0.01)，具体数值见表6；柴胡皂苷B4处理SW620细胞24h、48h、72h后，12.5～200μg/mL浓度范围内，与正常对照组相比细胞存活率显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，具体数值见表7。

根据CCK8实验结果，通过SPSS 20.0软件进行IC50拟合计算，得到柴胡皂苷B4对SW480细胞的IC50为24.46μg/mL，对SW620细胞的IC50为29.49μg/mL，所以后续实验研究中，柴胡皂苷B4选用25μg/mL，作用时间为24h作为后续实验的药物浓度。

表6 SSB4处理后SW480细胞存活率(

n＝6)

Table 6 Survival rate of SW480 cells treated with SSB4(

n＝6)

注：与对照组(Con)相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

表7 SSB4处理后SW620细胞存活率(

n＝6)

Table 7 Survival rate of SW620 cells treated with SSB4(

n＝6)

注：与对照组(Con)相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

实施例2细胞形态学观察

观察25μg/mL柴胡皂苷B4(SSB4)处理SW480、SW620细胞24h后细胞形态变化。如图2-a，正常的SW480细胞呈不规则的多边形，与6孔板底部紧密贴合，晃动6孔板时细胞不随培养基晃动，细胞轮廓清晰，胞质清透，细胞核清晰可见。SSB4(图2-b)处理之后的SW480细胞失去多边形的形态，呈圆形或椭圆形，胞质浓缩颜色变深，不再透亮，细胞会从贴壁状态转为半贴壁或漂浮状态，晃动6孔板时悬浮细胞会随培养基晃动。

如图2-d，正常的SW620细胞呈规则的梭形，胞体中间粗，两端窄而细长，也呈贴壁状态。SSB4(图2-e)处理后的SW620细胞与药物处理后的SW480细胞类似，细胞呈半贴壁或漂浮状态，胞质浓缩变深，细胞核形态模糊，细胞形态由梭形变为圆形或椭圆形。

实施例3流式细胞术检测细胞凋亡

采用流式细胞术检测处理24h，48h，和72h后，25μg/mL柴胡皂苷B4(SSB4)对SW480、SW620两种细胞凋亡的影响，如图3-a，SW480细胞正常对照组细胞凋亡率为(93.97±1.01)％，SSB4处理后(图3-b)，SW480细胞凋亡率为(40.27±1.64)％，与SW480细胞正常对照组细胞凋亡率相比较具有显著差异(P＜0.01)。

如图3-d，SW620细胞正常对照组细胞凋亡率为(92.17±1.21)％，SSB4处理后(图3-e)测得SW620细胞凋亡率为(66.33±1.25)％，与SW620正常对照组细胞凋亡率比较具有显著差异(P＜0.01)。实验结果表明SSB4能诱导SW480、SW620细胞发生凋亡。数据统计图如图4所述。

实施例4 Hoechst 33258染色观察细胞核形态变化

SW480、SW620经过25μg/mL柴胡皂苷B4处理24h后，经过Hoechst 33 258荧光染料染色之后，在荧光显微镜下观察，结果如图5所示，正常对照组细胞呈现均匀微弱的淡蓝色荧光，细胞核结构完整。而柴胡皂苷B4(SSB4)药物处理组，在两种细胞中均有亮蓝色荧光出现，部分细胞核裂解破碎，结构不完整，并且有凋亡小体产生，进一步证实柴胡皂苷B4能诱导SW480、SW620产生细胞凋亡。

实施例5药物处理SW480、SSW620后凋亡相关蛋白Western Blot结果

建立蛋白标准曲线，如图6，根据吸光度值(OD值)，绘制标准曲线得到回归方程y＝0.048x+0.153，R2＝0.9994，表明蛋白浓度在0～12μg/mL范围内线性关系良好。将各个蛋白样品测得的OD值代入回归方程，得到各个样品的蛋白浓度，见表8。

表8 SSB4作用于SW480、SW620细胞蛋白浓度(

n＝3)

Table 8 Effect of SSB4 on protein concentration of SW480 and SW620cells(

n＝3)

柴胡皂苷B4结果

以β-action作为内参，Western Blot实验结果表明，25μg/mL SSB4作用于SW480细胞24h后，抑凋亡蛋白Bcl2的表达水平由0.8±0.05下调为0.56±0.09(P＜0.05)，促凋亡相关蛋白Bax，Caspase3、Caspase9、及Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9蛋白的表达水平分别由0.84±0.07、0.37±0.04、0.58±0.09、0.34±0.07、0.24±0.05上调为1.42±0.09、0.6±0.03、1.41±0.06、0.67±0.06、0.56±0.04(P＜0.01)。SSB4处理SW620细胞后，抑凋亡蛋白Bcl2的表达水平由0.94±0.04下调至0.41±0.05(P＜0.01)。促凋亡相关蛋白Bax，Caspase3、Caspase9、及Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9蛋白的表达水平分别由0.68±0.03、0.47±0.06、0.6±0.04、0.33±0.02、0.33±0.03上调至1.06±0.04、0.75±0.07、1.26±0.08、0.8±0.06、0.8±0.05(P＜0.01)。蛋白图及蛋白相对表达柱形图结果如图7、8所示。各个蛋白的相对表达量见表9。

表9 SSB4处理SW480、SW620细胞后蛋白相对表达量(

n＝3)

Table 9 Relative expression of proteins in SW480 and SW620 cellstreated with SSB4(

n＝3)

实施例6 RT-PCR检测凋亡相关因子mRNA水平

柴胡皂苷B4处理SW480、SW620细胞凋亡相关因子mRNA水平

以β-action作为内参，使用表4的引物，表5的反应体系和条件对，结果如图9，RT-PCR结果显示，25μg/mL SSB4处理SW480细胞24h后，促凋亡因子Bax、Caspase3、Caspase9基因水平分别由1±0.05、1.01±0.12、1±0.1上调至1.41±0.28(P＜0.05)、1.7±0.16、1.91±0.16(P＜0.01)。抑凋亡因子Bcl2表达水平由1.01±0.15下调为0.29±0.04(P＜0.01)。25μg/mL SSB4处理SW620细胞24h后，SW620细胞中，Bax、Caspase3、Caspase9基因水平分别由1.01±0.15、0.79±0.05、0.77±0.14上调至1.47±0.15(P＜0.05)、1.37±0.1、2.15±0.18(P＜0.01)，Bcl2表达水平由1.01±0.18下调至0.36±0.05(P＜0.05)。mRNA相对表达量见表10。

表10 SSB4处理SW480、SW620细胞后mRNA相对表达量(

n＝3)

Table 10 Relative expression of mRNA in SW480、SW620 treated with SSB4(

n＝3)

注：与对照组(Con)相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

实施例7 Western Blot检测SW480、SW620细胞PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白

柴胡皂苷B4处理SW480、SSW620后Western Blot结果

Western Blot实验结果表明，以β-action为内参，DMSO组为对照，经25μg/mL柴胡皂苷B4(SSB4)处理24h后的SW480、SW620细胞中，PI3K、Akt、mTOR三种蛋白及其磷酸化蛋白p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量均有所下降，而且SW480细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-Mtor/mTOR的相对表达水平分别由0.92±0.01、0.82±0.03、0.82±0.01下调至0.77±0.07(P＜0.05)、0.52±0.04、0.5±0.08(P＜0.01)。SW620细胞中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的相对表达水平分别由0.87±0.05、0.97±0.03、0.87±0.01下调至0.66±0.03、0.64±0.03、0.49±0.03(P＜0.01)。结果如图10、11，蛋白相对表达水平见下表11。

表11 SSB4处理SW480、SW620细胞后蛋白相对表达量(

n＝3)

Table 11 Relative expression of protein in SW480、SW620 treated withSSB4(

n＝3)

注：与对照组(Con)相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

实施例8 RT-PCR检测PI3K/Akt/mTOR通路相关因子mRNA水平

柴胡皂苷B4处理SW480、SW620细胞通路相关因子mRNA水平

以β-action作为内参，通过表的引物，表5的反应体系，反应条件，以DMSO为对照，对柴胡皂苷B4(SSB4)处理组进行RT-PCR，结果如图12好表12所示，经25μg/mL柴胡皂苷B4(SSB4)处理过24h后，检测到SW480细胞中mRNA PI3K、Akt、mTOR的相对表达水平分别由1.01±0.14、1.02±0.21、1.00±0.12下调至0.35±0.02、0.58±0.09、0.57±0.05(P＜0.01)。检测到SW620细胞中mRNA PI3K、Akt、mTOR的相对表达水平分别由1.00±0.08、1.01±0.13、1.01±0.19下调至0.49±0.02、0.5±0.02、0.27±0.03(P＜0.01)。

表12 SSB4处理SW480、SW620细胞后mRNA相对表达量(

n＝3)

Table 12 Relative expression of mRNA in SW480 and SW620 cells treatedwith SSB4(

n＝3)

注：与对照组(Con)相比较，*P＜0.05，**P＜0.01

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.柴胡皂苷B4在制备抗结肠癌药物中的应用，其特征在于，柴胡皂苷B4，分子式如下：

。

2.如权利要求1所述柴胡皂苷B4在制备抗结肠癌药物中的应用，其特征在于，所述结肠癌为SW480和SW620结肠癌细胞。

3.如权利要求2所述柴胡皂苷B4在制备抗结肠癌药物中的应用，其特征在于，所述柴胡皂苷B4有效浓度为12 .5-200μg/mL。

4.如权利要求3所述柴胡皂苷B4在制备抗结肠癌药物中的应用，其特征在于，所述柴胡皂苷B4有效浓度为25μg/mL。