CN113368105A - 鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和线粒体呼吸的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和线粒体呼吸的药物中的应用。本发明发现鸦胆子苦醇可通过抑制糖代谢通路中的多个靶点来直接抑制口腔鳞癌细胞中的糖酵解代谢，也能够抑制口腔鳞癌细胞的葡萄糖摄取、减少其代谢产物乳酸的分泌；同时，鸦胆子苦醇也可抑制口腔鳞癌细胞的线粒体呼吸，从而使口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和线粒体呼吸受到双重抑制，进而抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移、克隆形成和侵袭能力，并阻滞细胞周期，同时促进细胞发生凋亡，最终发挥其显著的抗肿瘤作用，鸦胆子苦醇有望成为未来口腔癌治疗的潜在抗癌化疗制剂或辅助治疗制剂。

Description

鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和线 粒体呼吸的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和线粒体呼吸的药物中的应用。
背景技术
口腔癌是头颈部鳞状细胞癌中主要的恶性肿瘤之一，其发病率约占全身恶性肿瘤发病率的2％，死亡率约占1.8％。口腔癌中最常见的类型是口腔鳞状细胞癌，约占口腔癌的90％，包括舌癌、颊癌、牙龈癌、腭癌、唇癌、口底癌、口咽癌等。口腔癌的临床表现主要有：肿块或结节的出现，口腔中无明显原因的反复出血、麻木、灼热或干燥感，说话或吞咽时发生困难或不正常等；同时由于肿瘤体积增大可能压迫或侵犯张闭口肌肉和下颌关节，导致开闭口运动受限，从而影响进食和说话等，严重影响患者的生活质量。
目前临床上针对口腔癌的治疗仍是手术切除、放射线治疗、化学治疗和中医治疗相结合的方式。虽然治疗方案较过去已经取得了很大的进展，但口腔癌患者的5年生存率仍然只有50％左右。研究表明，在大多数快速生长的癌细胞中可观察到癌症代谢的改变，其特征是高糖酵解率，而口腔癌就是其中一种具有糖酵解依赖性的高缺氧癌症。
近年来，许多研究肿瘤的学者将目光从基因转向了代谢，从代谢组学方面来研究肿瘤发生的机制，甚至有学者认为肿瘤是一种代谢性疾病。而早在1931年，德国生物化学家奥托·沃伯格就提出了沃伯格效应(Warburg effect)，认为肿瘤细胞是依靠产能效率相对较低的糖酵解作用为自身供能，并认为肿瘤是一种代谢性疾病。人类和哺乳动物的正常细胞都遵循一定的代谢途径，包括葡萄糖、氨基酸、脂质和核酸代谢，进而维持细胞的生长；而恶性肿瘤细胞则存在以Warburg effect为主要生化代谢特征的一系列代谢改变，主要表现为糖酵解增强、葡萄糖摄取和消耗增加、脂类和蛋白质合成加强等。此外，肿瘤细胞产生能量的方式也极为特别，健康细胞依靠线粒体氧化糖类分子释放出有用的能量，而大多数肿瘤细胞则通过产能率相对较低的糖酵解作用为自身供能。因此，可从控制肿瘤细胞能量和物质来源途径入手，以代谢为靶点，来抑制或减弱糖酵解代谢，进而抑制或消灭肿瘤细胞。
天然产物中的有效成分一直是高效低毒抗癌药物的重要来源之一。研究发现，许多天然产物来源的有效成分在肿瘤治疗方面都表现出了显著的作用，但目前口腔癌治疗中涉及传统中药提取物的研究仍然是空白的。中药鸦胆子是苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实，又名老鸦胆、苦参子和鸦蛋子等，主要产于中国南方沿海热带和亚热带地区。作为传统中药，鸦胆子性苦寒，具有清热解毒、止痢疾、治鸡眼等功效。目前从鸦胆子中可以提取出153种化合物，主要包括苦木素类、三萜类、生物碱、木脂类、黄酮类、类固醇、脂肪酸等，其中苦木素类是其最主要的成分，鸦胆子苦醇即是苦木素类中常见的活性成分。
鸦胆子苦醇英文名为Brusatol，分子式：C26H32O11，分子量：520.54，为白色针状晶体，其化学结构式如式(I)所示。
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鸦胆子在临床肿瘤治疗方面应用的研究始于上世纪七十年代末期。近年来，鸦胆子苦醇对于部分肿瘤的显著抗肿瘤活性受到了越来越多的关注。目前，鸦胆子苦醇的抗肿瘤机制主要表现在以下方面：①鸦胆子苦醇可使磷酸化的p38和JNK表达增加，使磷酸化的ERK表达降低，导致MAPK途径的活化，从而抑制前列腺癌DU145细胞的增殖；②鸦胆子苦醇通过抑制细胞内过表达的Nrf2蛋白，增加细胞DNA损伤和细胞内活性氧(ROS)的累积，增强非小细胞肺癌A549细胞的辐射敏感性；③鸦胆子苦醇可以通过改变肝癌模型中上皮间充质转化相关蛋白的表达来干扰STAT3诱导的癌症转移；④鸦胆子苦醇还可以通过PI3K/AKT/mTOR途径来有效抑制肝癌细胞的增殖并促进自噬诱导的细胞凋亡，同时抑制体内和体外的肿瘤转移与侵袭。但是，目前关于鸦胆子苦醇对口腔癌的作用还未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供鸦胆子苦醇在口腔癌治疗、抑制口腔鳞癌细胞的增殖等恶性生物学行为、抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和线粒体呼吸等方面的用途。
本发明以口腔癌为研究对象，以口腔鳞癌细胞的代谢作为靶点开发能够有效抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢的中药成分。本发明在研发过程中发现，虽然一些中药提取物对于其它肿瘤具有很好的抑制活性，但是，其对于口腔癌的作用效果有限，也有一些中药提取物能够抑制口腔鳞癌细胞的增殖，但是，其对于口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢水平没有显著的影响。本发明经不断研究发现，鸦胆子苦醇能够有效抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解水平，而且还能够显著抑制其线粒体呼吸，其对于口腔鳞癌细胞的增殖、迁移等恶性生物学行为具有明显的抑制作用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供鸦胆子苦醇在制备用于治疗口腔癌的药物中的应用。
优选地，本发明所述的口腔癌为口腔鳞癌。
第二方面，本发明提供鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌的微血管形成的药物中的应用。
第三方面，本发明提供鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭或克隆形成的药物中的应用。
第四方面，本发明提供鸦胆子苦醇在制备用于阻滞口腔鳞癌细胞的细胞周期或促进口腔鳞癌细胞凋亡的药物中的应用。
第五方面，本发明提供鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和/或线粒体呼吸的药物中的应用。
鸦胆子苦醇能够同时抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和线粒体呼吸，通过这种双重抑制代谢的作用发挥对口腔鳞癌细胞的杀伤作用。
第六方面，本发明提供鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的葡萄糖吸收的药物中的应用。
鸦胆子苦醇能够显著降低口腔鳞癌细胞的葡萄糖吸收效率，从源头上抑制其糖酵解代谢。
第七方面，本发明提供鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的乳酸分泌的药物中的应用。
口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢显著增强，导致其代谢产物乳酸分泌增加，鸦胆子苦醇则能够明显减少口腔鳞癌细胞的乳酸分泌。
第八方面，本发明提供鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的己糖激酶、丙酮酸激酶的活性的药物中的应用。
第九方面，本发明提供鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞糖酵解代谢相关基因RNA表达的药物中的应用。
优选地，所述糖酵解代谢相关基因包括：糖酵解代谢调节基因HIF-1α、c-Myc、PTEN，糖酵解代谢酶HK、PKM2、LDHA的编码基因以及葡萄糖转运体GLUT1、GLUT4的编码基因中的至少一种。
第十方面，本发明提供一种用于口腔癌治疗或辅助治疗的药物，其包含治疗有效剂量的鸦胆子苦醇。
本发明的有益效果在于：本发明首次公开了从天然植物鸦胆子中提取的活性成分——鸦胆子苦醇(Brusatol)，可通过抑制糖代谢通路中的多个靶点来直接抑制口腔鳞癌细胞中的糖酵解代谢，包括抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解水平、糖酵解最大值、糖酵解储备值；同时，鸦胆子苦醇也能抑制口腔鳞癌细胞葡萄糖的摄取、减少其代谢产物乳酸的分泌；鸦胆子苦醇也可以抑制糖酵解通路中关键激酶：己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)的活性；还可以抑制该通路中葡萄糖转运体GLUT1和GLUT4的表达以及抑制调节糖酵解相关基因c-Myc、HIF-1α等基因的RNA表达。
另外，本发明还发现鸦胆子苦醇也可以抑制口腔鳞癌细胞中线粒体的基础呼吸量、ATP生成量、最大呼吸和备用呼吸量，从而使口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和线粒体呼吸受到双重抑制，进而抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移、克隆形成和侵袭能力，并阻滞细胞周期，同时促进细胞发生凋亡，最终发挥其显著的抗肿瘤作用。本发明提供的动物实验也进一步证实了鸦胆子苦醇可抑制口腔鳞癌细胞在裸鼠体内的生长，并抑制糖酵解通路中相关基因的表达。因此，鸦胆子苦醇可以通过靶向糖酵解代谢发挥抑制肿瘤生长的作用，有望成为未来口腔癌治疗的潜在抗癌化疗制剂或辅助治疗制剂。
附图说明
图1为本发明实施例1中鸦胆子苦醇对人口腔鳞癌细胞增殖和细胞周期的影响，其中，A为对CAL-27细胞增殖的影响，B为对SCC-15细胞增殖的影响，C为对CAL-27细胞周期的影响，D为对SCC-15细胞周期的影响。
图2为本发明实施例1中鸦胆子苦醇对人口腔鳞癌细胞单克隆形成能力的影响，其中，A为对CAL-27单克隆形成能力的影响，B为对SCC-15单克隆形成能力的影响。
图3为本发明实施例1中鸦胆子苦醇对人口腔鳞癌细胞CAL-27细胞迁移能力的影响。
图4为本发明实施例1中鸦胆子苦醇对人口腔鳞癌细胞SCC-15细胞迁移能力的影响。
图5为本发明实施例1中鸦胆子苦醇对CAL-27和SCC-15细胞侵袭能力的影响，其中，A为对CAL-27细胞侵袭能力的影响，B为对SCC-15细胞侵袭能力的影响。
图6为本发明实施例1中鸦胆子苦醇对CAL-27细胞凋亡的影响。
图7为本发明实施例1中鸦胆子苦醇对SCC-15细胞凋亡的影响。
图8为本发明实施例2中鸦胆子苦醇对人口腔鳞癌细胞的葡萄糖吸收和乳酸分泌的影响，其中，A为CAL-27细胞的葡萄糖吸收，B为SCC-15细胞的葡萄糖吸收，C为CAL-27细胞的乳酸分泌，D为SCC-15细胞的乳酸分泌。
图9为本发明实施例2中鸦胆子苦醇对人口腔鳞癌细胞的HK和PK活性的抑制作用，其中，A为CAL-27细胞的PK活性，B为SCC-15细胞的PK活性，C为CAL-27细胞的HK活性，D为SCC-15细胞的HK活性。
图10为本发明实施例2中鸦胆子苦醇抑制人口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢，其中，A为CAL-27细胞，B为SCC-15细胞。
图11为本发明实施例2中鸦胆子苦醇抑制人口腔鳞癌细胞糖酵解代谢相关基因的RNA表达，其中，A、B为CAL-27细胞，C、D为SCC-15细胞。
图12为本发明实施例2中鸦胆子苦醇抑制人口腔鳞癌细胞的线粒体呼吸，其中，A为CAL-27细胞，B为SCC-15细胞。
图13为本发明实施例3中鸦胆子苦醇能显著抑制人口腔鳞癌细胞CAL-27和SCC-15在裸鼠体内的生长，其中，A为CAL-27细胞移植瘤裸鼠的肿瘤体积变化曲线，B和C为体外测量CAL-27细胞移植瘤裸鼠肿瘤体积，D为SCC-15细胞移植瘤裸鼠的肿瘤体积变化曲线，E和F为体外测量SCC-15细胞移植瘤裸鼠肿瘤体积。
图14为本发明实施例3中通过HE染色观察CAL-27细胞和SCC-15细胞形成的裸鼠移植瘤，其中，A为CAL-27细胞裸鼠移植瘤HE染色，B为SCC-15细胞裸鼠移植瘤HE染色。
图15为本发明实施例3中免疫组织化学染色观察裸鼠移植瘤标本中的Ki67(A-B)、Cleaved-caspase 3(C-D)的表达情况，其中，A、C为CAL-27细胞，B、D为SCC-15细胞。
图16为本发明实施例3中免疫组织化学染色观察裸鼠移植瘤标本中的八因子相关抗原因子(vWF)的表达情况，其中，A为CAL-27细胞，B为SCC-15细胞。
图17为本发明实施例3中鸦胆子苦醇抑制糖酵解相关基因CLUT1(A、B)、HIF-1α(C、D)在CAL-27和SCC-15细胞移植瘤中的表达，其中，A、C为CAL-27细胞，B、D为SCC-15细胞。
图18为本发明实施例3中鸦胆子苦醇抑制糖酵解相关基因c-Myc在CAL-27和SCC-15细胞移植瘤中的表达，其中，A为CAL-27细胞，B为SCC-15细胞。
以上各图中，与阴性对照组相比，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1鸦胆子苦醇对人口腔鳞癌细胞生物学行为的影响
为了分析鸦胆子苦醇对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响，选择人口腔鳞癌细胞CAL-27和SCC-15两种细胞系作为研究对象，对两种细胞系进行鸦胆子苦醇药物处理，并通过MTT实验、克隆形成实验、细胞周期实验、细胞凋亡实验、划痕实验以及Transwell实验来检测鸦胆子苦醇药物处理后细胞生物学行为的变化，具体如下：
采用MTT法检测不同浓度的鸦胆子苦醇分别处理CAL-27和SCC-15细胞后，细胞增殖活性的变化，结果发现，随着鸦胆子苦醇药物浓度增高及处理时间的延长，其对细胞的抑制作用逐渐增强，呈一定浓度和时间依赖关系(图1的A和B)。
通过流式细胞术检测不同剂量的鸦胆子苦醇对CAL-27和SCC-15细胞周期的影响，结果发现，低、高剂量的鸦胆子苦醇将CAL-27的细胞周期阻滞在S期。在SCC-15细胞中，低剂量的鸦胆子苦醇将细胞阻滞在G1期，而高剂量的鸦胆子苦醇将细胞阻滞在S期(图1的C和D)。
通过克隆形成实验检测不同剂量的鸦胆子苦醇对CAL-27和SCC-15细胞单克隆形成能力的影响，结果发现，随着鸦胆子苦醇药物浓度的增高，CAL-27和SCC-15细胞的单克隆形成数逐渐减少，细胞集落也减小，且呈剂量依赖性(图2)。
通过划痕实验检测不同剂量的鸦胆子苦醇对CAL-27和SCC-15细胞迁移能力的影响，结果发现，随着鸦胆子苦醇药物浓度的增高和处理时间的延长，CAL-27和SCC-15细胞向另一侧迁移的距离逐渐缩小，呈一定的浓度和时间依赖性(图3和图4)。
通过Transwell侵袭实验检测不同剂量的鸦胆子苦醇对CAL-27和SCC-15细胞侵袭能力的影响，结果发现，鸦胆子苦醇药物显著抑制CAL-27和SCC-15细胞在每个视野中穿过的细胞数，在高剂量药物作用时，视野内穿过的细胞数显著减少(图5)。
通过流式细胞术检测不同剂量的鸦胆子苦醇对CAL-27和SCC-15细胞凋亡的影响，结果发现，鸦胆子苦醇可使CAL-27细胞的早、晚期凋亡均有所增加，且早期凋亡增加更为显著；而低剂量的鸦胆子苦醇使SCC-15细胞发生早期凋亡，高剂量使SCC-15细胞发生晚期凋亡。(图6和图7)。
以上体外实验结果表明，鸦胆子苦醇能够抑制人口腔鳞癌细胞CAL-27和SCC-15的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，并呈一定的时间和剂量依赖性，还能够阻滞细胞周期，促进细胞的凋亡。
实施例2鸦胆子苦醇对人口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和线粒体呼吸的影响
本实施例从葡萄糖摄取量和乳酸分泌量、糖酵解相关酶代谢活性、葡萄糖转运体和糖酵解相关基因的表达以及细胞糖酵解压力和线粒体压力等几个方面全方位地分析鸦胆子苦醇对口腔鳞癌细胞糖酵解代谢和线粒体呼吸的作用。
1、肿瘤细胞在糖酵解代谢过程中，葡萄糖的吸收量及其产物乳酸的分泌量会增加，而利用相应的试剂盒可以检测细胞培养液中葡萄糖和乳酸含量的变化。本实施例采用葡萄糖测定试剂盒和乳酸测定试剂盒分别检测了不同剂量的鸦胆子苦醇处理CAL-27和SCC-15细胞后，细胞培养液中葡萄糖和乳酸含量的变化。
通过使用葡萄糖测定试剂盒来检测不同剂量的鸦胆子苦醇分别处理CAL-27和SCC-15细胞后，细胞培养液中葡萄糖含量的变化，结果显示，鸦胆子苦醇使CAL-27和SCC-15细胞的葡萄糖吸收量均减少，且高剂量的药物作用时的效果最为明显(图8的A和B)。通过使用乳酸测定试剂盒来检测不同剂量的鸦胆子苦醇分别处理CAL-27和SCC-15细胞后，细胞培养液中乳酸分泌量的变化，结果显示，鸦胆子苦醇使CAL-27和SCC-15细胞的乳酸分泌量均明显减少，且高剂量的药物作用时的效果最为显著(图8的C和D)。
2、在肿瘤细胞的糖酵解代谢过程中，糖酵解相关代谢酶的活性会增强，而利用相应的试剂盒可以检测糖酵解相关代谢酶的活性。因此，本实施例采用己糖激酶试剂盒和丙酮酸激酶试剂盒检测了鸦胆子苦醇处理CAL-27和SCC-15细胞后，细胞内丙酮酸激酶和己糖激酶活性的变化。
通过使用丙酮酸激酶试剂盒来检测鸦胆子苦醇分别处理CAL-27和SCC-15细胞后，细胞内己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活性的变化，结果发现，鸦胆子苦醇表现出对CAL-27细胞HK活性和PK活性的抑制作用；但在SCC-15细胞中，鸦胆子苦醇能够抑制细胞的PK活性，但鸦胆子苦醇对细胞的HK活性未见明显抑制作用(图9)。以上结果说明，鸦胆子苦醇表现出对人口腔鳞癌细胞的HK活性和PK活性的抑制作用。
3、肿瘤细胞在糖酵解代谢过程中会释放出大量氢离子，而利用Seahorse能量代谢分析仪可以实时监测细胞培养环境中氢离子的浓度变化，从而了解细胞糖酵解水平的变化。因此，本实施例利用Seahorse能量代谢分析仪实时监测采用鸦胆子苦醇处理CAL-27和SCC-15细胞后，细胞培养环境中氢离子的浓度变化。结果显示(图10)，高、低剂量的鸦胆子苦醇作用于CAL-27和SCC-15细胞后，均能显著地抑制细胞的糖酵解水平，降低糖酵解最大值和糖酵解储备值，对两种细胞糖酵解的抑制作用都十分显著，其中，对CAL-27的糖酵解水平、糖酵解最大值、糖酵解储备值的抑制百分比分别为60.0％、53.3％、43.1％，对SCC-15的糖酵解水平、糖酵解最大值、糖酵解储备值的抑制百分比分别为53.2％、43.0％、25.2％。
4、肿瘤细胞的糖酵解代谢由一系列信号通路和关键基因调节，如PI3K/Akt/mTOR信号通路，代谢关键酶HK(己糖激酶)、PKM2(丙酮酸激酶M2)和LDHA(乳酸脱氢酶A)等，代谢相关基因HIF-1α、c-Myc、Nrf2、PTEN等以及调节葡萄糖通过细胞膜的葡萄糖转运体GLUT1和GLUT4，而相关调控基因的表达变化是导致代谢改变背后的重要原因之一。为了进一步证实鸦胆子苦醇对人口腔鳞癌细胞糖酵解代谢的抑制作用，采用RT-PCR技术，检测了鸦胆子苦醇对口腔鳞癌细胞中糖酵解代谢相关调节基因RNA表达水平的影响。结果显示，鸦胆子苦醇能够明显抑制Akt和mTOR的RNA表达，可能阻断了细胞的PI3K/Akt/mTOR通路，同时降低糖酵解代谢调节基因HIF-1α、c-Myc、Nrf2和PTEN的RNA表达水平。其次，鸦胆子苦醇也抑制了糖酵解代谢酶HK、PKM2和LDHA以及葡萄糖转运体GLUT1和GLUT4的RNA表达水平(图11)。
5、利用肿瘤细胞在线粒体呼吸中消耗氧的特点，在不同剂量的鸦胆子苦醇分别处理CAL-27和SCC-15细胞后，通过联合使用线粒体压力试剂盒和Seahorse能量代谢分析仪，对细胞培养微环境中的氧含量进行实时监测，以分析鸦胆子苦醇对细胞线粒体呼吸(即氧化磷酸化)的影响。结果显示(图12)，鸦胆子苦醇对CAL-27和SCC-15两种细胞的线粒体功能抑制作用十分显著，能够降低细胞的基础呼吸量、ATP生成量、最大呼吸及备用呼吸量，其中，对CAL-27的基础呼吸量、ATP生成量、最大呼吸、备用呼吸量的抑制百分比分别为68.6％、75.4％、73.6％、54.1％，对SCC-15的基础呼吸量、ATP生成量、最大呼吸、备用呼吸量的抑制百分比分别为84.1％、93.7％、90.7％、100％。
以上结果提示鸦胆子苦醇不仅抑制了人口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢，同时也限制了细胞的线粒体呼吸。
结合以上体外实验结果可知，鸦胆子苦醇不仅能抑制人口腔鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成等恶性生物学行为能力，同时阻滞细胞周期，促进细胞发生凋亡，还能双重抑制细胞的糖酵解代谢和线粒体呼吸。
实施例3鸦胆子苦醇在体内的抗肿瘤作用分析
为了分析鸦胆子苦醇在体内的抗肿瘤作用及其在体内对人口腔鳞癌细胞中糖酵解代谢途径的影响，将体外培养的处于对数生长期的细胞接种于裸鼠皮下，待其形成肿瘤后，将肿瘤取出并移植于裸鼠皮下以构建裸鼠移植瘤模型，并进行相应的鸦胆子苦醇药物处理。
具体地，将肿瘤组织块接种至裸鼠皮下，每3天测量1次肿瘤长、短、高径，观察肿瘤体积的变化，绘制肿瘤生长曲线，待裸鼠处死后，取肿瘤组织体外测量肿瘤体积。结果显示，鸦胆子苦醇能够显著抑制人口腔鳞癌细胞CAL-27和SCC-15在裸鼠体内的生长(图13)。
通过HE染色观察CAL-27细胞和SCC-15细胞形成的裸鼠移植瘤，可见肿瘤组织表现出不规则排列及浸润性生长，局部形成条索状、岛状或团块状结构，其中间质成分较少；肿瘤细胞核仁较大，胞浆较少，核浆比例失调，可见核分裂像，SCC-15细胞较CAL-27细胞体积大，与体外镜下观察相一致，以上观察符合口腔鳞癌组织病理学特征表现(图14)。
通过免疫组织化学染色观察裸鼠移植瘤标本中的Ki67(图15的A、B)、Cleaved-caspase 3(图15的C、D)和八因子相关抗原因子(vWF)(图16)的表达情况，结果显示，鸦胆子苦醇能够减少Ki67和vWF在CAL-27和SCC-15细胞移植瘤中的表达，增加Cleaved-caspase 3的表达，提示鸦胆子苦醇能抑制体内肿瘤细胞的增殖，减少局部微血管形成和促进细胞凋亡。
综上，通过对上述裸鼠移植瘤模型的肉眼观察和裸鼠移植瘤标本的HE及免疫组织化学染色实验发现，鸦胆子苦醇能显著抑制人口腔鳞癌细胞在裸鼠体内的生长，并能抑制CAL-27和SCC-15细胞的增殖和微血管的形成，以及促进细胞的凋亡。同时，鸦胆子苦醇以剂量依赖性的方式降低了CAL-27和SCC-15移植瘤中糖酵解相关基因如GLUT1、c-Myc和HIF-1α等的表达。该结果与体外实验结果一致。因此，鸦胆子苦醇在体内通过抑制人口腔鳞癌细胞的增殖和血管生成、促进细胞凋亡和抑制糖酵解途径来发挥抗肿瘤活性。
通过免疫组织化学染色观察裸鼠移植瘤标本中糖酵解相关基因的表达情况，结果显示，鸦胆子苦醇能抑制糖酵解相关基因CLUT1(图17的A、B)、HIF-1α(图17的C、D)和c-Myc(图18)在CAL-27和SCC-15细胞移植瘤中的表达，提示鸦胆子苦醇能在体内抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢。
以上体外和体内的实验结果表明，鸦胆子苦醇不仅能抑制人口腔鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成等恶性生物学行为能力，同时阻滞细胞周期，促进细胞发生凋亡，还能通过对糖酵解代谢和线粒体呼吸(有氧呼吸)的双重抑制作用来发挥对肿瘤细胞的杀伤作用，因此有希望成为口腔癌治疗中一种有效的抗癌化疗制剂。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.鸦胆子苦醇在制备用于治疗口腔癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述口腔癌为口腔鳞癌。
3.鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌的微血管形成的药物中的应用。
4.鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭或克隆形成的药物中的应用。
5.鸦胆子苦醇在制备用于阻滞口腔鳞癌细胞的细胞周期或促进口腔鳞癌细胞凋亡的药物中的应用。
6.鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢和/或线粒体呼吸的药物中的应用。
7.鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的葡萄糖吸收和/或乳酸分泌的药物中的应用。
8.鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的己糖激酶、丙酮酸激酶的活性的药物中的应用。
9.鸦胆子苦醇在制备用于抑制口腔鳞癌细胞的糖酵解代谢相关基因RNA表达的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述糖酵解代谢相关基因包括：糖酵解代谢调节基因HIF-1α、c-Myc、PTEN，糖酵解代谢酶HK、PKM2、LDHA的编码基因以及葡萄糖转运体GLUT1、GLUT4的编码基因中的至少一种。
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