CN113358763B

CN113358763B - 一种高效液相色谱测定十二烷基肌氨酸钠含量的方法

Info

Publication number: CN113358763B
Application number: CN202010151959.0A
Authority: CN
Inventors: 宇文镐; 杜佩云; 陈翔
Original assignee: Dexinwonder Medical Technology Co ltd
Current assignee: Xiamen Hongguan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2040-03-06
Also published as: CN113358763A

Abstract

本发明涉及一种高效液相色谱测定十二烷基肌氨酸钠含量的方法。色谱柱为C18‑ST色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，

)，流动相A为0.1％三氟乙酸‑水溶液，流动相B为0.085％三氟乙酸‑乙腈溶液，采用梯度洗脱。可以用外标法定量检测十二烷基肌氨酸钠尤其是蛋白样品中十二烷基肌氨酸钠的含量。将空白对照液WFI、十二烷基肌氨酸钠对照品溶液和含十二烷基肌氨酸钠的待测样品溶液，分别加入等体积的乙腈，混匀、离心后，取上清进行HPLC分析。十二烷基肌氨酸钠在质量浓度为0.05‑2.00mg/mL范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y＝80.298x+1.835，R²＝0.9989，相对标准偏差RSD＝0.83，回收率为90‑110％。本发明的HPLC方法测定十二烷基肌氨酸钠含量的方法，结果准确可靠。

Description

一种高效液相色谱测定十二烷基肌氨酸钠含量的方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种高效液相色谱测定十二烷基肌氨酸钠含量的方法。

背景技术

外源基因在大肠杆菌中高水平表达时，通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组蛋白，经分离、变性溶解后需要再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠，才能够得到生物活性蛋白。近年来，发展了许多策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。例如在蛋白质复性液中加入表面活性剂可以有效地抑制蛋白质分子间的疏水相互作用，降低蛋白质聚集体的生成，从而提高复性率。

Horowitz等发现非离子表面活性剂、两性表面活性剂、阳离子表面活性剂等均可以在适宜的浓度范围内辅助硫氰酸酶复性。

Gellman等则将表面活性剂与β-环糊精(β-CD)结合使用，首先采用表面活性剂与变性蛋白质形成复合物，再加入β-CD脱除表面活性剂并引发蛋白质折叠，这一方法被称为人工分子伴侣辅助复性。

Kim利用0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)溶解重组人生长激素和谷胱甘肽转移酶的融合蛋白(GH-GST)的包涵体，获得最大溶解量为5.4mg/ml。结果表明SDS溶解包涵体的效果优于常规使用的尿素或盐酸胍。SDS通过与蛋白质的疏水区相互作用，从而有效溶解蛋白质聚集体。除了溶解之外，SDS还在随后的复性中发挥了重要作用。在0.5％SDS的作用下，蛋白质浓度在0.5-1.0mg/ml时可获得相对高的复性效果。SDS在重组白介素2(rIL-2)的复性过程中同样有重要的作用。由于IL-2含有三个半胱氨酸残基，仅在Cys-58和Cys-105之间形成分子间二硫键才能有生物活性。在纯化的过程中，变性溶解包涵体后需要经过复性才能恢复其生物活性。常规使用方法是在盐酸胍溶液中加入适当比例的氧化型和还原型谷胱甘肽进行蛋白复性。但由于rIL-2分子含有大量的疏水性氨基酸，在较高的反应浓度时使用该复性方法容易产生多聚体。研究发现利用在SDS溶液中加入铜离子的方法进行复性，能够减少高浓度复性时rIL-2多聚体的形成，但该方法更适合大规模制备高纯度和高比活性的rIL-2。

载脂蛋白J(ApoJ)是人类血浆高密度脂蛋白(HDL)中的一种多功能糖基化蛋白，广泛存在于人体多种组织及体液中。ApoJ的相对分子质量为75～80KDa,由两个亚单位ApoJα和ApoJβ组成，通过5个二硫键连接成杂二聚体。ApoJα及ApoJβ分别含疏水氨基酸残基32％及35％。同样含有大量的疏水性氨基酸，在大肠杆菌表达的rApoJ包涵体的复性优化过程中，我们发现使用十二烷基肌氨酸钠(SKL)在较高的浓度的复性过程中能够显著提高rApoJ的复性效率，且SKL帮助rApoJ复性效果更优于SDS。

使用一定量的表面活性剂是促进重组生物制品溶解、复性及稳定的有效手段。该方法在越来越多的重组生物制品的生产过程中使用，但过量的表面活性剂会对人体产生副作用，因此应将表面活性剂的用量控制在明确的安全范围内。现有测定水体中表面活性剂定量的方法有：分光光度法、色谱法、电化学法等。例如采用吖啶橙-分光光度法检测rIL-2制品中SDS含量。将被测样品与吖啶橙混合后，加入甲苯进行萃取，然后用紫外分光光度计测A₄₉₉吸收峰。结果表明在0-0.01％SDS浓度范围内，SDS浓度与A₄₉₉呈线性关系，从而可以确定样品的SDS含量。

但是在测定生物制品中表面活性剂的含量时，受蛋白和表面活性剂结合的影响而导致测定结果不准确。本发明旨在通过优化高效液相色谱条件及样品预处理方法，来检测十二烷基肌氨酸钠的含量，对准确测定蛋白样品中的十二烷基肌氨酸钠的含量，将其用量控制在安全范围内，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效液相色谱(HPLC)测定十二烷基肌氨酸钠含量的方法，包括如下步骤：

A1.十二烷基肌氨酸钠对照品溶液的制备：精密称取十二烷基肌氨酸钠对照品，溶于超纯水中，使用容量瓶定容后，得到对照品溶液；

A2.含十二烷基肌氨酸钠的待测样品溶液的制备：精密称取含十二烷基肌氨酸钠的待测样品，溶于超纯水中，稀释摇匀，得到待测样品溶液；

A3.将空白对照液WFI、十二烷基肌氨酸钠对照品溶液和含十二烷基肌氨酸钠的待测样品溶液，进行高效液相色谱法分析，采用C18-ST色谱柱；

步骤A3中所用的高效液相色谱方法的色谱条件为：

流动相A为三氟乙酸-水溶液，流动相B为三氟乙酸-乙腈溶液，采用梯度洗脱；进样量为45-52μL；流速为0.8-1.2mL/min；所用紫外检测器的检测波长为210-218nm；色谱柱为C18-ST色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，填料粒度为5μm，孔径

优选的，流动相A为0.1％三氟乙酸-水溶液；流动相B为0.085％三氟乙酸-乙腈溶液。

优选的，所述梯度洗脱的程序为：

优选的，所述进样量为50μL；所述流速为1.0mL/min；所述紫外检测器的检测波长为215nm。

优选的，步骤A3中，空白对照液WFI、十二烷基肌氨酸钠对照品溶液和含十二烷基肌氨酸钠的待测样品溶液在进样前，分别加入等体积的乙腈，混匀、离心后，取上清进行高效液相色谱分析。

优选的，所述十二烷基肌氨酸钠对照品溶液的质量浓度为0.05-2.00mg/mL。

优选的，所述含十二烷基肌氨酸钠的待测样品为含十二烷基肌氨酸钠的蛋白样品。

本发明高效液相色谱测定十二烷基肌氨酸钠含量的方法具体步骤如下：

B1.取十二烷基肌氨酸钠对照品溶液，配制成不同浓度梯度的对照品溶液；

B2.将所述浓度梯度的对照品溶液与乙腈混匀后，离心，取上清分别上样高效液相色谱，得到各份标准品溶液对应的色谱图，以所述各份标准品溶液的浓度为横坐标，以对应色谱图中十二烷基肌氨酸钠的峰面积为纵坐标作图，得到线性回归方程；

B3.将含十二烷基肌氨酸钠的待测样品稀释至质量浓度在0.05-2.00mg/mL，与乙腈混匀后，离心，取上清进样于高效液相色谱，得到待测样品的色谱图，将待测样品的十二烷基肌氨酸钠的峰面积待入步骤B2所述的线性回归方程中，求得待测样品中十二烷基肌氨酸钠的含量。

本发明的高效液相色谱法，可用于测定蛋白样品中十二烷基肌氨酸钠的含量和/或蛋白样品的复性效果控制。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.强疏水性蛋白易和十二烷基肌氨酸钠结合，影响测定结果，采用本发明的乙腈处理含十二烷基肌氨酸钠的蛋白，可以使其从蛋白样品中分离，结果准确可靠。

2.本发明的高效液相色谱方法，不仅适用范围广，且检测结果准确可靠，特别是用于蛋白样品中十二烷基肌氨酸钠的含量测定，为蛋白的复性提供重要的参考依据。

3.本发明操作简单，分离快速，R²＝0.9989，有良好的线性关系。

4.本发明稳定性和重复性好。

附图说明

图1是实施例3中空白对照液的HPLC图谱，

图2是实施例3中0.05mg/mL的对照品溶液的HPLC图谱，

图3是实施例3中0.10mg/mL的对照品溶液的HPLC图谱，

图4是实施例3中0.25mg/mL的对照品溶液的HPLC图谱，

图5是实施例3中0.50mg/mL的对照品溶液的HPLC图谱，

图6是实施例3中1.00mg/mL的对照品溶液的HPLC图谱，

图7是实施例3中1.50mg/mL的对照品溶液的HPLC图谱，

图8是实施例3中2.00mg/mL的对照品溶液的HPLC图谱，

图9是实施例3中质控品的HPLC图谱，

图10是实施例3中某批次含十二烷基肌氨酸钠的待测ApoJ样品1的HPLC图谱，

图11是实施例3中另一批次含十二烷基肌氨酸钠的待测ApoJ样品2的HPLC图谱，

图12是标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明，应当理解的是，这些实施例仅仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。所以在本发明的方法前提下对发明的简单改进均属于本发明要求保护的范围。

在本发明中，所用设备型号和试剂如下：高效液相色谱仪(Waters/e2695-2489)，旋涡混匀器(IKA/MS3 Digital)，离心机(Eppendorf/5810R)，色谱柱为C18-ST色谱柱(TechMate)，规格为4.6mm×250mm，填料粒度为5μm，孔径

三氟乙酸(色谱纯，Sigma)，乙腈(色谱纯，Honywell)，十二烷基肌氨酸钠(Sigma)。

实施例1

1.溶液的制备

精密称量十二烷基肌氨酸钠对照品1.00g，溶于超纯水中，并用容量瓶定容至100mL，得到10mg/mL的十二烷基肌氨酸钠对照品溶液；精密称量含十二烷基肌氨酸氨的牛血清白蛋白样品5.00g，根据预估的十二烷基肌氨酸钠的含量，用超纯水稀释至十二烷基肌氨酸钠含量在0.05-2.00mg/mL之间，得到含十二烷基肌氨酸钠的待测样品溶液；注射用水(WFI)作为空白对照。

2.色谱条件

量取适量超纯水，加入1mL三氟乙酸，补加超纯水至1000mL，用0.22μm的滤膜过滤，得到0.1％三氟乙酸-水溶液为流动相A；量取适量乙腈，加入0.85mL的三氟乙酸，补加乙腈至1000mL，用0.22μm的滤膜过滤，得到0.085％三氟乙酸-乙腈溶液为流动相B。将制备得到的流动相A和流动相B置于10-30℃保存备用，有效期为3天。

色谱柱为C18-ST柱(4.6mm×250mm，5μm，

)；进样量为42μL；流速为0.8mL/min；检测波长为210nm。

将WFI、十二烷基肌氨酸钠对照品溶液和含十二烷基肌氨酸钠的待测样品溶液分别加入等体积的乙腈，混匀后，12000rpm离心10min，取上清进行HPLC分析。梯度洗脱的程序如表1所示。

表1

时间(min)	流动相A(V/V)％	流动相B(V/V)％
			0	100	0
5	100	0
			15	20	80
20	0	100
			25	0	100
30	100	0
			40	100	0

在对照品溶液和待测样品溶液的色谱图相应位置上，有相同保留时间的色谱峰，而空白对照WFI在十二烷基肌氨酸钠的出峰时间区域内没有干扰峰，对十二烷基肌氨酸钠的测定没有干扰作用。且待测样品中不同组分可以在最短的时间内分离，分离度好，灵敏度高。

实施例2

溶液的制备、流动相A、流动相B、梯度洗脱程序和色谱柱同实施例1。进样量为52μL，流速为1.2mL/min，检测波长为218nm。在对照品溶液和待测样品溶液的色谱图相应位置上，有相同保留时间的色谱峰。

实施例3

3.1溶液的制备和色谱条件

精密称取十二烷基肌氨酸钠1.00g，溶于超纯水中，容量瓶定容至100mL，得到10.00mg/mL的对照品溶液，进样时，将质量浓度为10.00mg/mL的对照品溶液分别进样5μL、10μL、25μL、50μL、100μL、150μL和200μL，即分别得到0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL、1.50mg/mL和2.00mg/mL的对照品溶液，标记为STD-0.05、STD-0.10、STD-0.25、STD-0.50、STD-1.00、STD-1.50和STD-2.00。

根据待测样品某批次ApoJ样品(记为待测样品1)和另一批次ApoJ样品(记为待测样品2)预估的十二烷基肌氨酸钠的含量，用超纯水稀释至十二烷基肌氨酸钠含量在0.05-2.00mg/mL之间。

质控品是已知浓度为1.00mg/mL的十二烷基肌氨酸钠水溶液。空白对照为WFI。以上所有样品均加入等体积的乙腈，混匀后离心，取上清进行HPLC分析。梯度洗脱程序如表1所示。进样量为50μL，流速为1.0mL/min，紫外检测波长为215nm。进样之前先用流动相平衡至基线平稳，再依次进样空白对照液、0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL、1.50mg/mL和2.00mg/mL的对照品溶液、质控品、待测样品1和待测样品2。

3.2系统适用性试验

图1是空白对照液的HPLC图谱，图2-8分别是0.05mg/mL、0.10mg/mL、0.25mg/mL、0.50mg/mL、1.00mg/mL、1.50mg/mL和2.00mg/mL的对照品溶液的HPLC图谱，图9是质控品的HPLC图谱，图10是含十二烷基肌氨酸钠的待测样品1的HPLC图谱，图11是含十二烷基肌氨酸钠的待测样品2的HPLC图谱。由图1-11可知，对照品溶液、质控品溶液和待测样品溶液的图谱，在相同的保留时间即19.30min左右处有色谱峰，而空白对照溶液在该出峰时间并没有干扰峰出现。

3.3精密度试验

精密量取十二烷基肌氨酸钠对照品溶液5μL，保持其他试验条件不变的情况下，重复进样6次。结果表明十二烷基肌氨酸钠的保留时间和出峰面积基本不变化，标准偏差RSD值为1.7％。证明了仪器性能良好。

3.4线性关系的考察

采用外标法对十二烷基肌氨酸钠含量进行定量分析，结果如表2所示。

表2

以十二烷基肌氨酸钠对照品溶液进样量(mg/mL)为横坐标x，以测定的十二烷基肌氨酸钠峰面积为纵坐标y，绘制标准曲线如图12所示。回归方程为y＝80.298x+1.835，R²＝0.9989。可见，十二烷基肌氨酸钠在0.05-2.00mg/mL的质量浓度范围内线性关系良好。

3.5样品含量的测定

可以按照外标法计算待测样品1和2中十二烷基肌氨酸钠的含量。由图10-11可知，待测样品1的保留时间为19.308min，峰面积是151.09，待测样品2的保留时间是19.303min，峰面积是65.49。根据回归方程y＝80.298x+1.835可以得知，待测样品1中十二烷基肌氨酸钠的质量浓度为1.86mg/mL，待测样品2中十二烷基肌氨酸钠的质量浓度为0.79mg/mL，从而可以得知十二烷基肌氨酸钠的含量。由于十二烷基肌氨酸钠在较高的浓度复性过程中可以提高蛋白的复性效率，但是过量的使用会对人体产生副作用。因此采用本申请的HPLC方法，可以准确测定蛋白样品中十二烷基肌氨酸钠的含量，并将用量控制在安全范围内。在保证其用量在安全范围内的情况下，尽可能提高复性效率。

3.6重复性试验

取同一批次待测样品2共6份，按照3.1中溶液的制备方法：加超纯水稀释、同乙腈混匀后离心获得上清，制备成供试液。平行测定6次后，相对标准偏差RSD＝0.83(n＝6)，表明采用本发明的HPLC检测方法重现性良好。

3.7质控品回收率试验

取已知质量浓度1.00mg/mL的质控品21份，分别加入十二烷基肌氨酸钠对照品，按照3.1中溶液的制备方法，制备供试品溶液。在十二烷基肌氨酸钠的线性范围内，分别制成不同浓度的溶液，每一个浓度3份。然后分别进样，测得回收率为90-110％。

由于受蛋白和表面活性剂十二烷基肌氨酸钠结合的影响，现有技术中采用分光光度法、电化学法等在测定十二烷基肌氨酸钠含量时，结果通常是不准确的。本发明的HPLC检测方法，操作简单，可以定量检测其含量，结果准确，重现性良好，将蛋白样品中十二烷基肌氨酸钠的含量控制在安全范围内。

Claims

1.一种高效液相色谱测定十二烷基肌氨酸钠含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

A3.将注射用水空白对照液、十二烷基肌氨酸钠对照品溶液和含十二烷基肌氨酸钠的待测样品溶液，进行高效液相色谱法分析，采用C18-ST色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，填料粒度为5μm，孔径120Å；

步骤A3中高效液相色谱方法的色谱条件为：

流动相A为0.1%三氟乙酸-水溶液；流动相B为0.085%三氟乙酸-乙腈溶液，采用梯度洗脱；所述梯度洗脱的程序为：

时间/min 流动相A/%，V/V 流动相B/%，V/V

0 100 0

5 100 0

15 20 80

20 0 100

25 0 100

30 100 0

40 100 0 ；

进样量为45-52μL；

流速为0.8-1.2mL/min；

所用紫外检测器的检测波长为210-218nm；

步骤A3中，注射用水空白对照液、十二烷基肌氨酸钠对照品溶液和含十二烷基肌氨酸钠的待测样品溶液在进样前，分别加入等体积的乙腈，混匀、离心后，取上清进行高效液相色谱分析，所述含十二烷基肌氨酸钠的待测样品为含十二烷基肌氨酸钠的蛋白样品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述进样量为50μL；所述流速为1.0mL/min；所述紫外检测器的检测波长为215nm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述十二烷基肌氨酸钠对照品溶液的质量浓度为0.05-2.00mg/mL。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

B2.将所述浓度梯度的对照品溶液与等体积的乙腈混匀后，离心，取上清分别上样高效液相色谱，得到各份标准品溶液对应的色谱图，以所述各份标准品溶液的浓度为横坐标，以对应色谱图中十二烷基肌氨酸钠的峰面积为纵坐标作图，得到线性回归方程；

B3.将含十二烷基肌氨酸钠的待测样品稀释至质量浓度在0.05-2.00mg/mL，与等体积的乙腈混匀后，离心，取上清进样于高效液相色谱，得到待测样品的色谱图，将待测样品的十二烷基肌氨酸钠的峰面积待入步骤B2所述的线性回归方程中，求得待测样品中十二烷基肌氨酸钠的含量。