CN113358727B - 一种检测microRNA的电化学发光传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
一种检测microRNA的电化学发光传感器及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113358727B CN113358727B CN202110552568.4A CN202110552568A CN113358727B CN 113358727 B CN113358727 B CN 113358727B CN 202110552568 A CN202110552568 A CN 202110552568A CN 113358727 B CN113358727 B CN 113358727B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- carbon electrode
- glassy carbon
- electrochemical luminescence
- ecl
- microrna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
- G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
- G01N21/763—Bioluminescence
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/38—Cleaning of electrodes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测microRNA的电化学发光传感器及其制备方法和应用,该电化学发光传感器包括玻碳电极、电化学发光剂、氧化石墨烯和核酸探针,所述玻碳电极表面依次修饰了电化学发光剂和氧化石墨烯,所述核酸探针通过与氧化石墨烯结合固定于玻碳电极表面。本发明将制备的电化学发光传感器与目标物溶液进行孵育,在若干次的催化发夹自组装循环反应后,DNA探针脱离电极表面,因此电极的电化学发光信号呈增长趋势,并以此测定目标的浓度,本发明的传感器应用于microRNA‑21的定量检测,具有特异性好、灵敏度高、线性范围宽,且具有成本低廉的优势。
Description
技术领域
本发明属于生物医学检测领域,具体涉及一种检测microRNA的电化学发光传感器及其制备方法和应用。
背景技术
microRNA是一类长度约19-23个核苷酸的内源性非编码单链RNA分子。作为关键基因调控因子,microRNA参与到生物体内多种生理过程,与人类特定疾病的发生、发展进程密切相关。因此对生物体内microRNA表达水平的定量检测在基础研究和疾病诊断领域具有非常重要的作用。但是人体内microRNA的一些本质特性,如:尺寸小、序列相似度高、浓度低且差异大等,为定量检测的实践操作带来了诸多困难与挑战。
电化学发光(ECL)是一种由电化学反应驱动的特定物质的化学发光过程,也是一种常见的传感检测平台。相比于化学发光,ECL能够通过电化学反应控制信号分子的发光过程,因此其具有更高的可控性,从而更易实现自动化检测。目前已有多款基于电化学发光平台设计的商业化定量分析仪器被开发,并投入使用到临床诊断领域中。因此ECL也是目前能够实现microRNA定量检测的最有潜力的平台之一。在microRNA定量检测方面,国内外众多科研人员进行了大量的实例文献报道,然而其传感性能依然无法达到临床应用的潜力。进一步改善传感器检测性能,许多研究者都尝试传感器设计中引入核酸信号放大策略,虽然这些方法能够在传感性能提升方面发挥一定的积极作用,但通常会使传感过程变得更加耗时且更具操作难度及复杂程度。
因此,开发一种简便、快捷且性能优异的microRNA定量检测的ECL传感系统,对未来microRNA相关的基础研究、临床诊断等领域具有极其重要的作用。
发明内容
发明目的:针对现有技术存在的繁琐耗时、灵敏度低、设备庞大、成本高等缺点,本发明提供了一种检测microRNA的电化学发光传感器,本发明的电化学传感器使用自主设计的新型核酸信号探针,通过与microRNA发生催化发卡自组装反应产生信号,本发明的电化学传感方法具有操作简便快捷,灵敏度高,成本低等优势,符合当前临床检测要求。
本发明的另一个目的是克服传统ECL检测系统中使用的试剂对于操作人员的毒性和对环境的污染等弊端,本发明通过反相微乳液法将毒性共反应剂试剂与发光剂共同包裹于二氧化硅基质中,一方面降低共反应试剂的毒性,另一方面通过ECL自增强作用增强ECL信号,从而降低共反应剂的使用量,两者共同实现减少ECL传感系统中共反应剂的毒性带来负面作用。
本发明的另一个目的是提供所述检测microRNA-21的电化学发光传感器的制备方法和应用。
技术方案:为了实现上述目的,本发明提供一种检测microRNA的电化学发光传感器,其特征在于,所述电化学发光传感器包括玻碳电极、电化学发光剂、氧化石墨烯和核酸探针,所述氧化石墨烯修饰于涂覆了发光剂的玻碳电极的表面,所述核酸探针与氧化石墨烯结合固定在玻碳电极的表面。
其中,氧化石墨烯的修饰是通过静电吸附作用结合,DNA探针通过与氧化石墨烯结合固定于玻碳电极表面。
其中,所述核酸探针包括探针H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc,其具体序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示;其中H1-Fc为Ferrocene-TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGTAACCCGGTTAGCTTATCAGACTGA;H2-Fc为Ferrocene-CTGATAAGCTAACCGGGTTACACTGATGTTGAGTAACCCGGTTAGCT;H3-Fc为Ferrocene-ACCGGGTTACTCAACATCAGTTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGTAAC。
本发明基于核酸碱基互补配对原则,完全自主设计能够与microRNA-21发生催化发卡自组装反应的探针。
作为优选,所述探针H1-Fc、H2-Fc和H3-Fc的使用量为等摩尔比。
其中,所述电化学发光剂为ECL自增强发光剂,在Igepal CO-520和环己烷混合液中加入Ru(bpy)3Cl2水溶液和氨水混匀后,依次加入DEAMTES、TEOS反应得到。该反应在油包水微乳液体系中进行反应,由DEAMTES和TEOS共同水解得到二氧化硅基质,并在水解过程中通过静电吸附作用吸引并包裹Ru(bpy)3Cl2分子,从而得到DEAMTES@RuSiO2发光剂即为ECL自增强发光剂。
作为优选,所述的自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2的制备方法,包括以下步骤:
(1)向Igepal CO-520和环己烷混合液中,加入Ru(bpy)3Cl2水溶液及氨水,充分混匀;
(2)向上述溶液中加入DEAMTES溶液,搅拌一段时间;
(3)向上述溶液中加入TEOS溶液,搅拌一段时间;
(4)向上述溶液中加入丙酮溶液,混匀后离心收集沉淀,用乙醇清洗后得到自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2。
本发明所述的电化学发光传感器的制备方法,包括如下步骤:
(1)将玻碳电极进行抛光后进行超声清洗;
(2)将电化学发光剂滴涂于玻碳电极表面后清洗并干燥;
(3)将氧化石墨烯滴涂于步骤(2)得到玻碳电极表面,清洗并干燥;
(4)将核酸探针滴于步骤(3)得到玻碳电极表面,进行孵育,清洗后得到检测microRNA的电化学发光传感器。
其中,步骤(2)中将1~20μL电化学发光剂滴涂于玻碳电极表面,4~60℃下干燥,用水或者PBS清洗。
其中,步骤(3)中将1~20μL氧化石墨烯滴涂于步骤(1)中得到的玻碳电极表面,静置于4~60℃下干燥,用水或者PBS清洗;
其中,步骤(4)中按等体积等摩尔比将1~20μL的核酸探针:H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc共同滴于步骤(3)中得到的玻碳电极表面,4~60℃温度下进行孵育0.5-8h,用水或者PBS清洗后。
作为优选,所述的电化学发光传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)将5μL自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2滴涂于玻碳电极表面,25℃下干燥,用水清洗;
(2)将5μL氧化石墨烯滴涂于步骤(1)中得到的玻碳电极,静置于25℃下干燥,用水清洗;
(3)将5μL设计的DNA探针:H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc共同滴于步骤(2)中所述的玻碳电极表面,37℃温度下进行孵育0.5~5h,优选37℃孵育2h,用PBS清洗后得到所述microRNA定量检测ECL传感器。
本发明所述的电化学发光传感器在无标记法定量检测microRNA-21中的应用。
其中,所述应用为将目标物在电化学发光传感器的玻碳电极表面进行孵育反应,通过测试反应前后玻碳电极的电化学发光信号差异而达到定量检测目的。
作为优选,本发明所述的电化学发光传感器的使用方法,包括以下步骤:
(1)将所述目标物microRNA-21滴于所述电化学发光传感器表面,孵育,清洗。
(2)将步骤(1)中反应后的电化学发光传感器连接至ECL仪器,进行ECL信号强度的采集。
优选地,所述的电化学发光传感器的使用方法,包括以下步骤:
(1)将1~20μL所述目标物microRNA-21滴于所述电化学发光传感器表面,4~60℃下孵育,用水或者PBS清洗。
(2)将步骤(1)中反应后的电化学发光传感器连接至ECL仪器,以pH 3~10的PBS溶液为电解质,进行ECL信号强度的采集。
更优选地,所述的电化学发光传感器的使用方法,包括以下步骤:
(1)将10μL所述目标物microRNA-21滴于所述电化学发光传感器表面,37℃下孵育,用PBS清洗。
(2)将步骤(1)中反应后的电化学发光传感器连接至ECL仪器,以pH 7.4的PBS溶液为电解质,进行ECL信号强度的采集。
本发明传感器通过采用新设计合成的ECL发光剂DEAMTES@RuSiO2作为基底膜层修饰玻碳电极,在修饰氧化石墨烯后,将新设计合成的DNA探针固定于其表面,由此得到所述ECL传感器。本发明中首先自主合成一种具有自增强发光效应的ECL发光剂,该发光剂可以避免在传统ECL检测系统使用高浓度毒性共反应剂,因此具有绿色安全的优势;同时,该发光剂通过缩短共反应剂和发光剂之间的空间距离,加速ECL反应过程中的电子传递的速率和效率,因此可以实现较传统发光剂更加高效的ECL发光。本发明其次自主设计核酸信号探针以实现信号放大目的,这种策略具有操作简便且快速的优势;并引入氧化石墨烯用于负载核酸探针,这样的设计可以避免在ECL传感器制备过程中操作复杂且耗时的共价修饰步骤,可以实现对目标物的无标记检测。本发明将制备好的ECL传感器与目标物溶液进行孵育,在经历目标物引发的催化发卡自组装反应后,具有ECL猝灭作用的核酸探针脱离电极表面,因此电极的ECL信号呈增长趋势,并可依据此信号变化实现对目标物定量检测的目的。本发明采用一种新型的核酸信号放大策略,避免传统方法的耗时和操作复杂等缺陷。本发明通过合成使用本发明传感器应用于microRNA-21的定量检测,具有特异性好、灵敏度高、线性范围宽,且具有成本低廉的优势,尤其是进行人血清中microRNA-21的定量检测。本发明中的ECL发光试剂,其中图3证明了其发光性能;此外反应体系中较不需要加毒性共反应剂,检测仅需一步。
有益效果:与现有技术相比,本发明具有如下优点:
(1)本发明中首先自主合成一种具有自增强发光效应的ECL发光剂,该发光剂可以避免在传统ECL检测系统使用高浓度毒性共反应剂,因此具有绿色安全的优势;同时,该发光剂通过缩短共反应剂和发光剂之间的空间距离,加速ECL反应过程中的电子传递的速率和效率,因此可以实现较传统发光剂更加高效的ECL发光。
(2)本发明自主设计核酸信号探针以实现信号放大目的,这种核酸信号放大策略及目标物识别方式具有操作简便且反应快速的优势;同时引入氧化石墨烯用于负载核酸探针,这样的设计可以避免在ECL传感器制备过程中操作复杂且耗时的共价修饰步骤,可以实现对目标物的无标记检测,大大简化了操作复杂程度及技术难度,具有更强的产业化前景。
(3)本发明针对目标分析物microRNA-21的特殊性设计了一种基于无标记电化学发光传感器系统,并且制备简单、构建快,本发明传感器系统成功地实现了人血清中microRNA-21的定量检测,并且特异性好、灵敏度高、线性范围宽,且具有成本低廉,使用方便等优势,检测不需要多余的修饰步骤,检测也仅需一步。
附图说明
图1为本发明ECL传感器的设计及制备流程图;
图2为本发明ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2的性能测试图;
图3为本发明ECL发光试剂和传统发光剂的发光性能比较图;
图4为本发明ECL传感器的ECL强度与抗原浓度的对数之间的线性关系图;
图5为本发明ECL传感器的特异性测试图;
图6为本发明ECL传感器存储稳定性测试图。
具体实施方式
根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明中技术术语的缩写如下:
(二乙氨基甲基)三乙氧基硅烷:DEAMTES;DEAMTES/三联吡啶氯化钌共掺杂的二氧化硅微球:DEAMTES@RuSiO2;Si(OC2H5)4:TEOS;电化学发光:ECL;二茂铁:Ferrocene;磷酸盐缓冲液:PBS
本发明中涉及的microRNA-21标准品、H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc等核酸序列由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明中的其他原料试剂都是市售可得。TEOS、Igepal CO-520购自于美国Sigma公司,其余化学试剂均为国产分析纯,购自于上海国药集团化学试剂有限公司。
氨水(质量分数为28-30%)、DEAMTES(质量分数为98%)、TEOS(质量分数99.999%)
氧化石墨烯通过市售或者是按照已报道参考文献方法自行合成(Journal ofMaterials Chemistry 2012,22,6575-6580.)
实施例1
自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2的制备方法,包括以下步骤:
(1)向1.92g Igepal CO-520和5mL环己烷混合液中,加入340μL 40mM Ru(bpy)3Cl2水溶液及30μL氨水,充分混匀;
(2)向上述溶液中加入10μL DEAMTES溶液,搅拌15min;
(3)向上述溶液中加入82μL TEOS溶液,搅拌30min;
(4)向上述溶液中加入5mL丙酮溶液,混匀后离心收集沉淀,用乙醇清洗沉淀后3次后得到自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2。
(5)将DEAMTES@RuSiO2以0.1mg/mL的浓度分散于PBS(pH 7.4)溶液,测试ECL发光试剂的性能:CV测试,电位范围0~1.3V,速率0.1V/s,同步记录ECL发光信号,光电倍增高压(PMT)为800V,结果如图2所示。结果显示,DEAMTES@RuSiO2在电化学作用下,能够产生很强的ECL信号,达到预期设计目标。
(6)与传统ECL发光剂性能的比较:将DEAMTES@RuSiO2和不含DEAMTES的发光剂RuSiO2(采用实施例1的制备方法,其中不执行步骤(2))修饰至电极表面,其中DEAMTES@RuSiO2以0.1mg/mL的浓度在PBS(pH 7.4)溶液中进行ECL测试;RuSiO2组以0.1mg/mL的浓度在含有2mM TPA、2mM DEAMTES的PBS(pH 7.4),及PBS(pH 7.4)溶液中分别进行ECL测试。ECL测试条件:CV测试,电位范围0~1.3V,速率0.1V/s,同步记录ECL发光信号,光电倍增高压(PMT)为600V,结果如图3所示。结果显示,本发明合成的ECL发光剂相比于传统ECL发光体系具有更强的发光性能,更有利于后期检测。
实施例2
无标记法检测microRNA-21的电化学发光传感器的制备:
详细构建流程图如图1所示,包括以下具体步骤:
步骤(1):将3mm圆形玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后,依次用水、乙醇、水进行超声清洗4min;
步骤(2):将5μL 2mg/mL自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2水溶液滴涂于玻碳电极表面,25℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(3):将5μL 0.1mg/mL氧化石墨烯水溶液滴涂于步骤(2)中得到的玻碳电极,静置于25℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(4):将5μL 2μM的三种DNA探针:H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc滴于步骤(3)中所述的玻碳电极表面,37℃温度下进行孵育2h,用PBS(pH 7.4)清洗后得到所述microRNA-21定量检测ECL传感器。
实施例3
无标记法检测microRNA-21电化学发光传感器的制备:
步骤(1):将3mm圆形玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后,依次用水、乙醇、水进行超声清洗4min;
步骤(2):将5μL 0.5mg/mL自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2水溶液滴涂于玻碳电极表面,25℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(3):将5μL 0.5mg/mL氧化石墨烯水溶液滴涂于步骤(2)中得到的玻碳电极,静置于25℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(4):将5μL 10μM的三种DNA探针:H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc以等体积等摩尔比,滴于步骤(3)中所述的玻碳电极表面,37℃温度下进行孵育2h,用PBS(pH 7.4)清洗后得到所述microRNA-21定量检测ECL传感器。
实施例4
无标记法检测microRNA-21电化学发光传感器的制备:
步骤(1):将3mm圆形玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后,依次用水、乙醇、水进行超声清洗4min;
步骤(2):将5μL 5mg/mL自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2水溶液滴涂于玻碳电极表面,25℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(3):将5μL 1mg/mL氧化石墨烯水溶液滴涂于步骤(2)中得到的玻碳电极,静置于25℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(4):将5μL 0.5μM的三种DNA探针:H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc以等体积等摩尔比,滴于步骤(3)中所述的玻碳电极表面,37℃温度下进行孵育,用PBS(pH 7.4)清洗后得到所述microRNA-21定量检测ECL传感器。
实施例5
无标记法检测microRNA-21电化学发光传感器的使用方法,包括以下步骤:
(1)将10μL的microRNA-21滴于实施例2制备电化学发光传感器表面,37℃下孵育2h,用PBS(pH 7.4)清洗。
(2)将步骤(1)中反应后的电化学发光传感器连接至ECL仪器,以pH 7.4的PBS(PH7.4)溶液为电解质,进行ECL信号强度的采集。
实施例6
电化学发光传感器检测microRNA-21标准曲线的制备,包括以下步骤:
(1)将10μL不同浓度的microRNA-21(0.01pM,0.1pM,1pM,10pM,100pM,1000pM)滴于所述实施例2制备电化学发光传感器表面,每个浓度设置3个平行实验组,37℃下孵育2h,用PBS(pH 7.4)清洗。
(2)将步骤(1)中反应后的电化学发光传感器连接至ECL仪器,以pH 7.4的PBS(pH7.4)溶液为电解质,测试传感器的ECL发光信号:CV测试,电位范围0~1.3V,速率0.1V/s,同步记录ECL发光信号,光电倍增高压(PMT)为600V,计算ECL信号的衰减值,根据标准曲线计算对应的microRNA-21的浓度,结果如图4所示。结果显示,随目标物增加,工作电极的ECL强度呈现线性增长的趋势,其相应线性方程为I=1016.53lg CmiRNA-21+3147.81,线性相关性良好(R2=0.994)。综上所述,该方法能够用于对microRNA-21的定量检测,其最低检测限LOD为8.19fM,且线性检测范围为0.01pM至1000pM,特异性好、灵敏度高、线性范围宽。
实施例7
(1)将10μL 100pM的microRNA-16,microRNA-141,microRNA-155,microRNA-21及10μL终浓度均为100pM的microRNA-16,microRNA-141,microRNA-155,microRNA-21混合物分别滴于所述实施例2制备电化学发光传感器表面,每个样品设置3个平行实验组,37℃下孵育2h,用PBS(pH 7.4)清洗。
(2)将步骤(1)中反应后的电化学发光传感器连接至ECL仪器,以pH 7.4的PBS(pH7.4)溶液为电解质,测试传感器的ECL发光信号:CV测试,电位范围0~1.3V,速率0.1V/s,同步记录ECL发光信号,光电倍增高压(PMT)为600V,记录每组电极的ECL信号,结果如图5所示,该传感器对microRNA-16,microRNA-141,microRNA-155无明显响应,此外对含有microRNA-21的混合溶液有信号强度,且强度和microRNA-21组相当,表明该传感器对microRNA-21的定量检测具有较优的特异性。
实施例8
(1)按实施例2所述的方法制备电化学发光传感器,并将传感器放置于4℃冰箱,并储存1、3、7、10、14天后取出进行microRNA-21目标物的浓度测试。
(2)将10μL 100pM的microRNA-21滴于步骤(1)所述的电化学发光传感器表面,每组设置3个平行实验组,37℃下孵育2h,用PBS(pH 7.4)清洗。
(3)将步骤(2)中反应后的电化学发光传感器连接至ECL仪器,以pH 7.4的PBS(pH7.4)溶液为电解质,测试传感器的ECL发光信号:CV测试,电位范围0~1.3V,速率0.1V/s,同步记录ECL发光信号,光电倍增高压(PMT)为600V。结果如图6所示,该传感器在保存时间高达14天的情况下,依然能够有效对目标物microRNA-21产生信号响应,表明该传感器的长期储存稳定性良好。
实施例9
ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2的制备方法,包括以下步骤:
(1)向1.92g Igepal CO-520和5mL环己烷混合液中,加入340μL 5mM Ru(bpy)3Cl2水溶液及30μL氨水,充分混匀;
(2)向上述溶液中加入1μL DEAMTES溶液,搅拌15min;
(3)向上述溶液中加入82μL TEOS溶液,搅拌30min;
(4)向上述溶液中加入加入5mL丙酮溶液,混匀后离心收集沉淀,用乙醇清洗3次后得到自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2。
实施例10
ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2的制备方法,包括以下步骤:
(1)向1.92g Igepal CO-520和5mL环己烷混合液中,加入340μL 100mM Ru(bpy)3Cl2水溶液及30μL氨水,充分混匀;
(2)向上述溶液中加入80μL DEAMTES溶液,搅拌15min;
(3)向上述溶液中加入82μL TEOS溶液,搅拌30min;
(4)向上述溶液中加入5mL丙酮溶液,混匀后离心收集沉淀,用乙醇清洗3次后得到自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2。
实施例11
步骤(1):将3mm圆形玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后,依次用水、乙醇、水进行超声清洗4min;
步骤(2):将1μL 2mg/mL自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2水溶液滴涂于玻碳电极表面,4℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(3):将1μL 0.1mg/mL氧化石墨烯水溶液滴涂于步骤(2)中得到的玻碳电极,静置于4℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(4):将1μL 2μM的三种DNA探针:H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc以等体积等摩尔比,滴于步骤(3)中所述的玻碳电极表面,4℃温度下进行孵育8h,用PBS(pH 7.4)清洗后得到所述microRNA-21定量检测ECL传感器。
实施例12
步骤(1):将3mm圆形玻碳电极依次用0.3μm、0.05μm Al2O3粉末进行抛光后,依次用水、乙醇、水进行超声清洗4min;
步骤(2):将20μL 2mg/mL自增强ECL发光试剂DEAMTES@RuSiO2水溶液滴涂于玻碳电极表面,60℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(3):将20μL 0.1mg/mL氧化石墨烯水溶液滴涂于步骤(2)中得到的玻碳电极,静置于60℃下干燥,用水清洗后晾干;
步骤(4):将20μL 2μM的三种DNA探针:H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc以等体积等摩尔比,滴于步骤(3)中所述的玻碳电极表面,60℃温度下进行孵育0.5h,用PBS(pH 7.4)清洗后得到所述microRNA-21定量检测ECL传感器。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种检测microRNA的电化学发光传感器及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcaacatcag tctgataagc tagtaacccg gttagcttat cagactga 48
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgataagct aaccgggtta cactgatgtt gagtaacccg gttagct 47
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accgggttac tcaacatcag ttagcttatc agactgatgt tgagtaac 48
Claims (7)
1.一种检测microRNA的电化学发光传感器,其特征在于,所述电化学发光传感器包括玻碳电极、电化学发光剂、氧化石墨烯和核酸探针,所述玻碳电极表面依次修饰了电化学发光剂和氧化石墨烯,所述核酸探针通过与氧化石墨烯结合固定于玻碳电极表面;
所述核酸探针包括探针H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc,其中 H1-Fc为Ferrocene-TCAACATCAGTCTGATAAGCTAGTAACCCGGTTAGCTTATCAGACTGA;H2-Fc为Ferrocene-CTGATAAGCTAACCGGGTTACACTGATGTTGAGTA
ACCCGGTTAGCT;H3-Fc为Ferrocene-ACCGGGTTACTCAACATCAGTTAGCTTATCAGACTGATGTTGAGTAAC;所述探针H1-Fc、H2-Fc和H3-Fc的使用量为等摩尔比;所述电化学发光剂为ECL自增强发光剂,由Ru(bpy)3Cl2水溶液和氨水混匀后依次加入DEAMTES、TEOS反应得到。
2.一种权利要求1所述的电化学发光传感器的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将玻碳电极进行抛光后进行超声清洗;
(2)将电化学发光剂滴涂于玻碳电极表面后清洗并干燥;
(3)将氧化石墨烯滴涂于步骤(2)得到玻碳电极表面,清洗并干燥;
(4)将核酸探针滴于步骤(3)得到玻碳电极表面,进行孵育,清洗后得到检测microRNA的电化学发光传感器。
3.根据权利要求2所述的电化学发光传感器的制备方法,其特征在于,步骤(2)中将1~20 μL电化学发光剂滴涂于玻碳电极表面,4~60℃下干燥,用水或者PBS清洗。
4.根据权利要求2所述的电化学发光传感器的制备方法,其特征在于,步骤(3)中将1~20 μL氧化石墨烯滴涂于步骤(1)中得到的玻碳电极表面,静置于4~60℃下干燥,用水或者PBS清洗。
5.根据权利要求2所述的电化学发光传感器的制备方法,其特征在于,步骤(4)中按等体积等摩尔比将1~20 μL的核酸探针:H1-Fc、H2-Fc及H3-Fc共同滴于步骤(3)中得到的玻碳电极表面,4~60℃温度下进行孵育0.5-8h,用水或者PBS清洗后。
6.一种权利要求1所述的电化学发光传感器在无标记法定量检测microRNA-21中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述应用为将目标物在电化学发光传感器的玻碳电极表面进行孵育反应,通过测试反应前后玻碳电极的电化学发光信号差异而达到定量检测目的。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110552568.4A CN113358727B (zh) | 2021-05-20 | 2021-05-20 | 一种检测microRNA的电化学发光传感器及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110552568.4A CN113358727B (zh) | 2021-05-20 | 2021-05-20 | 一种检测microRNA的电化学发光传感器及其制备方法和应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113358727A CN113358727A (zh) | 2021-09-07 |
CN113358727B true CN113358727B (zh) | 2023-07-21 |
Family
ID=77527004
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110552568.4A Active CN113358727B (zh) | 2021-05-20 | 2021-05-20 | 一种检测microRNA的电化学发光传感器及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113358727B (zh) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106093171A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-11-09 | 天津工业大学 | 一种检测大肠杆菌的电化学生物传感器的制备方法 |
CN106872447A (zh) * | 2017-01-14 | 2017-06-20 | 北京工业大学 | 增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法 |
CN108690870A (zh) * | 2018-05-15 | 2018-10-23 | 北京工业大学 | 三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法 |
-
2021
- 2021-05-20 CN CN202110552568.4A patent/CN113358727B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106093171A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-11-09 | 天津工业大学 | 一种检测大肠杆菌的电化学生物传感器的制备方法 |
CN106872447A (zh) * | 2017-01-14 | 2017-06-20 | 北京工业大学 | 增强鲁米诺体系的电化学发光生物传感器的制备方法 |
CN108690870A (zh) * | 2018-05-15 | 2018-10-23 | 北京工业大学 | 三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法 |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
A dual amplification strategy for ultrasensitive detection of microRNA;Liping Lu 等;《Applied Surface Science》;第426卷;597–604 * |
A Graphene-enhancedimagingofmicroRNAwithenzyme-freesignal amplification ofcatalyzedhairpinassemblyinlivingcells;Haiyun Liu 等;《Biosensors andBioelectronics》;第85卷;909–914 * |
An enzyme free electrochemical biosensor for sensitive detection of miRNA with a high discrimination factor by coupling the strand displacement reaction and catalytic hairpin assembly recycling;Juan Yao 等;《Analyst》;第142卷;4116-4123 * |
Enhanced electrochemiluminescence based on Ru(bpy)3 2+-doped silica nanoparticles and graphene composite for analysis of melamine in milk;Limin Zhou 等;《Analytica Chimica Acta》;第824卷;57–63 * |
Enzyme-free and label-free miRNA detection based ontarget-triggered catalytic hairpin assembly and fluorescenceenhancement of DNA-silver nanoclusters;Hansol Kim 等;《Sensors and Actuators B: Chemical》;第260卷;140–145 * |
Graphene Fluorescence Switch-Based Cooperative Amplification: A Sensitive and Accurate Method to Detection MicroRNA;Haiyun Liu 等;《Anal. Chem.》;第86卷;5487−5493 * |
Label-freeandenzyme-freecolorimetricdetectionofmicroRNAby catalyzedhairpinassemblycoupledwithhybridizationchainreaction;Hao Wu 等;《Biosensors andBioelectronics》;第81卷;303–308 * |
Ru(bpy)3 Covalently Doped Silica Nanoparticles as Multicenter Tunable Structures for Electrochemiluminescence Amplification;Simone Zanarini 等;《J. AM. CHEM. SOC. 》;第131卷(第6期);2260–2267 * |
Simple Tripedal DNA Walker Prepared by Target-Triggered Catalytic Hairpin Assembly for Ultrasensitive Electrochemiluminescence Detection of MicroRNA;Li Wang 等;《ACS Sens》;第5卷;3584−3590 * |
UltrasensitiveelectrochemicalsensingplatformformicroRNAbasedon tungstenoxide-graphenecompositescouplingwithcatalyzedhairpin assemblytargetrecyclingandenzymesignalamplification;Hong-Lei Shuai 等;《Biosensors andBioelectronics》;第86卷;337–345 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113358727A (zh) | 2021-09-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zhang et al. | A ratiometric electrochemical biosensor for the exosomal microRNAs detection based on bipedal DNA walkers propelled by locked nucleic acid modified toehold mediate strand displacement reaction | |
US20210247349A1 (en) | METHOD FOR PREPARING RATIOMETRIC ELECTROCHEMICAL miR3123 APTASENSOR BASED ON METAL-ORGANIC FRAMEWORK COMPOSITE | |
WO2022095373A1 (zh) | 一种检测miRNA的自产生共反应剂信号放大电化学发光体系 | |
CN110849867B (zh) | 基于双发夹结构的电致发光传感器及其构建方法、用途 | |
CN101245387A (zh) | 一种用于dna检测的纳米金信号探针及其制备方法和dna检测的方法 | |
CN109295168B (zh) | 二氧化锰纳米片介导的比率荧光生物传感器用于细胞内microRNA的检测与成像 | |
CN111440851B (zh) | 一种检测miRNA的电化学生物传感器及其制备方法与应用 | |
CN110218818B (zh) | 一种登革病毒基因片段sers检测试剂盒及其制备方法 | |
CN106957908A (zh) | miRNA和/或具有核酸适配体的靶标分子的检测方法及检测探针 | |
CN110106232A (zh) | 基于靶标催化的无酶无标记双尾杂交生物传感器及制备方法 | |
CN108690870A (zh) | 三联吡啶钌电化学发光淬灭生物传感器的制备方法 | |
CN112501257B (zh) | 一种基于核酸自组装无酶催化的circRNA活细胞内成像的可视化传感器 | |
CN112903786B (zh) | 基于无酶级联循环信号放大的血清中循环miRNA的电化学检测方法 | |
Liu et al. | MicroRNA detection by an amplification-free biosensor based on controllable solid-state electrochemiluminescence quenched by charge transfer | |
CN111020006B (zh) | 一种测定三磷酸腺苷的电化学发光传感器系统及其制备方法和应用 | |
CN113340863A (zh) | 一种无酶循环放大核酸适配体传感器及其制备方法和应用 | |
CN109580731A (zh) | Dna微囊及金电极-dna树枝状大分子传感器的制备方法以及在检测多氯联苯中的应用 | |
CN113358727B (zh) | 一种检测microRNA的电化学发光传感器及其制备方法和应用 | |
CN109001164B (zh) | 一种基于锰卟啉淬灭CdSe量子点的光电生物传感器及其制法和应用 | |
CN116004769A (zh) | 一种基于磁珠和氧化石墨烯的辅助作用检测miRNA Let-7a的试剂盒及其应用 | |
CN113549692B (zh) | 一种基于杂交链反应检测鼻咽癌抗放疗生物标志物的方法 | |
CN105176990B (zh) | 一种用于端粒酶检测的探针、方法及试剂盒 | |
CN106957267B (zh) | 一种新型检测钯的可逆比色比率菲并咪唑类荧光分子探针 | |
CN115032258B (zh) | miRNA类肿瘤标志物检测试剂盒 | |
CN113075272B (zh) | 基于碳三氮五构建新型光致电化学生物传感器 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |