CN113355410A - 一种原发性痛风诊断标志物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了hsa_circ_0069977基因可作为痛风诊断的分子标志物。本发明通过基因芯片技术筛选并首次分析了痛风患者和健康对照者外周血单个核细胞中差异表达的环状RNA谱，并通过实时荧光定量PCR验证了芯片结果，表明hsa_circ_0069977在痛风患者和健康人群之间存在显著差异，根据差异可以区分痛风患者和非痛风患者。本发明还公开了诊断痛风的相应试剂或试剂盒，该试剂盒通过检测外周血单个核细胞中hsa_circ_0069977基因的表达而进行痛风的诊断，其灵敏性高、特异性好、检测方便，具有广泛的应用前景。

Description

一种原发性痛风诊断标志物及应用

技术领域

本发明属于医学诊断领域，涉及分子标志物在原发性痛风诊断中的应用，具体所述分子标志物为hsa_circ_0069977。

背景技术

原发性痛风是人体嘌呤代谢障碍引起组织损伤的一组临床综合征，它的临床表现主要有：高尿酸血症、急性关节炎、痛风石形成、关节畸形、泌尿系结石及肾脏实质性病变等。流行病学研究显示，痛风患病率逐年上升，由于监测的方法不同，全球患病率估计为0.1-10％。目前痛风的具体发病机制尚不清楚，研究发现遗传、免疫、饮食以及创伤应激等因素均不同程度参与痛风的发生发展。血清尿酸水平升高被认为是GA发生的重要危险因素，但是，研究提示只有约10％的高尿酸血症患者实际患上了GA。在痛风发作期间，血清尿酸也可能会降至正常水平。关节症状的典型发作及关节腔的尿酸盐结晶的发现是原发性痛风诊断的重要指标，此时尿酸盐结晶已在关节腔沉积，甚至已导致关节畸形，这些都会严重影响患者生活质量。同时，痛风患者常并发糖尿病、高血压、高血脂、心脑血管等疾病，对人体健康造成严重威胁。此外，现阶段痛风的诊断大多依靠临床表现、血尿常规、血尿酸测定、关节超声和关节腔穿刺检查等，它们虽各有优势，但或为有创检查，或敏感性或特异性不足，或技术要求比较高，需要丰富的临床经验，不能满足临床需要。因此寻找敏感性、特异性高的标志物，为早期诊断及治疗痛风提供有力的证据变得尤为重要。

环状RNA(Circular RNA，circRNA)是一类新颖的非编码RNA分子，可以由外显子、内含子或者同时包含两种序列的片段组成，其主要的生物学功能是通过与微小RNA结合，作为竞争性内源RNA发挥作用。此外，它还可调节蛋白质结合、参与转录调控和编码蛋白多肽，参与多种疾病的发生。理想的生物标志物应具有以下特征：高特异性，高灵敏度，非侵入性，方便，便宜且可重现。CircRNA具有独特的结构，高稳定性和特定的表达方式，在已有的研究中发现circRNA在疾病和正常人群间存在差异表达，并且有成为生物标志物的潜能。发明人采用微阵列芯片技术首次筛选并分析了痛风患者及健康对照者外周血单个核细胞中circRNA的差异表达，通过生物信息学方法即GO功能分析和Pathway分析等对差异circRNA来源基因进行深度挖掘，并对参与调控痛风的关键分子进行了荧光定量PCR检测，以证实其在痛风患者外周血单个核细胞中表达的稳定性及作用。

发明内容

用于原发性痛风诊断的circRNA标志物在制备原发性痛风诊断试剂盒中的应用。

所述的circRNA标志物为SEQ ID NO：1所示的hsa_circ_0069977。

采用荧光定量PCR技术检测样本中hsa_circ_0069977的表达水平。

所述hsa_circ_0069977在原发性痛风患者的外周血单个核细胞中表达量升高。

所述的circRNA标志物的引物对为针对hsa_circ_0069977的特异性引物。

所述的针对hsa_circ_0069977的特异性引物，包括如SEQ ID NO：2所示的上游引物，如SEQ ID NO：3所示的下游引物。

所述试剂盒还包括反转录和PCR反应所需的酶和/或试剂。

所述试剂还包括逆转录酶、缓冲液、dNTP、MgCl₂、去核酸酶水、荧光染料、内参引物、探针和/或Taq酶。

样本为外周血。

本发明首次利用微阵列芯片技术检测外周血单个核细胞中差异表达的circRNA，并在大规模人群研究中证实hsa_circ_0069977在原发性痛风患者和正常人中存在差异表达且hsa_circ_0069977与糖脂代谢指标存在相关性，可用作潜在的痛风诊断标志物及评估痛风患者糖脂代谢情况，为circRNA在原发性痛风中的深入研究奠定了基础。通过对血液生物标志物和诊断试剂盒的研制与应用，仅需要病人的血液而不需要任何其他组织，通过扩增外周血hsa_circ_0069977的表达水平，提高检测的灵敏度，可使得痛风的诊断和治疗更加方便易行，为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果的评价奠定基础。

附图说明

图1为差异表达的circRNA的火山图分析。

图2为差异表达的circRNA的层级聚类图分析。

图3为qRT-PCR检测hsa_circ_0069977在痛风患者外周血中表达上调。

图4为外周血中hsa_circ_0069977单独诊断效能。

图5为hsa_circ_0069977与痛风患者空腹血糖水平相关性示意图，以hsa_circ_0069977基因相对表达量为横坐标，以病人空腹血糖为纵坐标做相关性分析，可见r＝0.419，P＜0.0001。

图6为hsa_circ_0069977与痛风患者血清甘油三脂水平(a)及高密度脂蛋白水平(b)相关性示意图，以hsa_circ_0069977基因相对表达量为横坐标，以病人血清甘油三脂水平或高密度脂蛋白水平为纵坐标做相关性分析，其结果分别为r＝0.263，P＝0.013；r＝0.210，P＝0.048。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1 微阵列芯片技术分析原发性痛风患者与正常人间差异表达的circRNA

1.材料

收集2018年4月到2021年2月川北医学院附属医院风湿免疫科门诊及住院部就诊的痛风患者共90例作为实验组(Gout)。所有患者均符合1977年ACR或2015年ACR/EULAR制定的痛风诊断标准，排除药物、肿瘤、肾脏原发疾病等所致继发性痛风者。收集同期在川北医学院附属医院体检中心进行健康体检正常且无痛风及关节病史者60例，将其设为健康对照(healthy controls，HC)组。并收集所有研究对象的详细信息，包括年龄性别等基本信息和本次就诊时所行血常规、血沉、C反应蛋白、尿常规、血尿酸、脂代谢指标、糖代谢指标等检查检验数据。纳入研究的正常对照组及痛风患者组之间在年龄和性别构成上差异均无统计学意义。

2.实验方法

2.1总RNA提取与质量检测

使用肝素抗凝管采集所有研究对象清晨空腹外周血4ml，采用Ficoll密度梯度离心法分离PMBCs，根据Trizol试剂盒(Invitrogen公司，美国)说明书提取PMBCs中总RNA。通过标准变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA的完整性，使用NanoDrop ND-1000分光光度计(Agilent公司，美国)测试RNA的浓度及纯度。样品合格后分装保存于-80℃冰箱。

2.2微阵列芯片技术分析

选取RNA质量鉴定合格且年龄匹配的痛风患者5例，健康对照者3例进行基因芯片分析。该芯片使用了Arraystar Human circRNA Array v2(8x15K)(Arraystar，Rockville，MD，美国)，它包含了13617个人circRNA探针。根据Arraystar的标准方案进行样品制备和微阵列杂交：即用Rnase R(Epicentre公司，美国)消化总RNA，以去除线性RNA并富集环状RNA，根据Arraystar Super RNA标记试剂盒(Arraystar公司，美国)操作步骤将富集的环状RNA扩增并转录为荧光cRNA。然后通过RNeasy Mini Kit纯化标记的cRNA。通过添加5μL10×封闭剂和1μL25×片段化缓冲液，将1μg每种标记的cRNA片段化，然后将混合物在60℃加热30分钟。最后，加入25μL2×GE杂交缓冲液稀释标记的cRNA。将体积为50μL的杂交溶液分配到垫片玻片中，然后组装到circRNA表达微阵列玻片上。将载玻片在安捷伦杂交炉中于65℃孵育17小时。将杂交的阵列洗涤，固定并使用Agilent DNA Microarray Scanner(部件号G2505C)扫描。扫描所得图像由Agilent特征提取软件(版本11.0.1.1)分析，使用R语言limma软件包执行分位数归一化和后续数据处理，以倍数变化(Fold change，FC)＞1.5且P＜0.05的标准来筛选差异表达的circRNA。分析结果显示，与HC组相比，Gout组分别有238和41个上调表达的circRNA，采用火山图(图1)、层次聚类图(图2)表达上述差异情况。

实施例2 qRT-PCR验证痛风患者外周血单个核细胞中hsa_circ_0069977相对表达量

1.引物设计

hsa_circ_0069977引物：

上游引物：5’-ATGGACCCAAGAGTCAGCGG-3’

下游引物：5’-TGCTTGGCCATTTCGGTTCC-3’

目标基因扩增长度：88bp。

2.反转录

将90例痛风患者与60例健康对照者的总RNA标本进行反转录。按照PimeScript^TMRT reagent Kit(Perfect Real Time)RR047A(Takara)说明书配置反转录反应体系，取2μl的总RNA用于逆转录合成cDNA。首先将各试剂进行瞬离，使用移液器依次添加至去RNA酶的EP管中，充分混匀，置于循环器内孵育将RNA反转为cDNA，其中第一步骤反转录条件为42℃2min，第二步骤反转录条件为42℃ 15min，最后冰上放置，可立即进行后续荧光定量PCR。

3.qRT-PCR验证hsa_circ_0069977表达量

使用SYBR Premix Ex Taq(TakaRa)实时荧光定量试剂盒在

PCR仪上进行荧光定量PCR检测，反应体系为：TB Green Premix Ex Taq II：5μl，上下游引物各0.15μl，cDNA：1.0μl，ddH2O：3.8μl。反应条件为：95℃30s，95℃ 5s，60℃34s，共40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃ 15s共1个循环。每份标本均设复孔，反应结束后作溶解曲线，以β-actin作为内参基因，2^-ΔΔC(t)计算circRNA的相对表达量。

4.统计学处理

采用IBM SPSS Statistics 23.0以及GraphPad Prism 8统计软件进行分析，近似正态分布的定量资料以均数±标准差描述，非正态分布资料以中位数(四分位数间距)[M(IQR)]描述，组间比较采用t检验或Mann-Whitney U检验进行人口统计学，临床和实验室指标的统计分析。受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价分子标志物的诊断效能，变量间的相关关系采用Spearman相关分析，。所有统计检验均选择双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

5.验证结果

结果显示：RT-PCR扩增曲线整体平行性好，说明各反应管的扩增效率相近，扩增曲线拐点清楚，极限平且无上扬现象，曲线指数期斜率大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线为单峰，说明扩增产物单一，是特异性扩增。hsa_circ_0069977在痛风患者外周血单个核细胞中表达量明显高于健康对照组，差异具有统计学意义(P＜0.001)(图3)。ROC曲线分析显示hsa_circ_0069977的表达水平在痛风患者组和HC组之间差异具有统计学意义(p＜0.001)(图4)，其中AUC(95％IC)为0.801(0.730-0.871)，敏感性为68.9％，特异性为83.3％显示hsa_circ_0069977对痛风具有很好的诊断价值。此外，hsa_circ_0069977与空腹血糖、血清甘油三脂以及血清高密度脂蛋白水平存在显著相关性(p＜0.05)，可以用于辅助评估痛风患者糖脂代谢水平。

Claims (9)

1.用于诊断痛风的circRNA标志物在制备痛风诊断试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，样本为外周血。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的circRNA标志物为SEQ ID NO：1所示的hsa_circ_0069977。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，采用荧光定量PCR技术检测样本中hsa_circ_0069977的表达水平。

5.根据权利要求1所述诊断痛风的标志物，其特征在于，所述hsa_circ_0069977在痛风患者的外周血单个核细胞中表达量升高。

6.根据权利要求3或4或5中所述的标志物，其特征在于，所述的circRNA标志物的引物为针对hsa_circ_0069977的特异性引物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的针对hsa_circ_0069977的特异性引物，包括如SEQ ID NO：2所示的上游引物，如SEQ ID NO：3所示的下游引物。

8.根据权利要求1所述的检测试剂盒，所述试剂盒还包括反转录和PCR反应所需的酶和/或试剂。

9.根据权利要求8所述的血液检测试剂盒，其特征在于，所述试剂还包括逆转录酶、缓冲液、dNTP、MgCl₂、去核酸酶水、荧光染料、内参引物、探针和/或Taq酶。

Images