CN113355319B - 采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α-淀粉酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于菌株活性提高领域，涉及一种采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α‑淀粉酶活性的方法，包括将长满解淀粉芽孢杆菌的LB平板至于冷等离子体处理设备中，使菌株经冷等离子体环境中的真空紫外光子辐射后产生能级的跃迁；所述冷等离子体处理设备以氦气为冷等离子体气源，氦气经射频放电产生氦高能等离子体和真空紫外光子。本发明整个过程无加热，处于低温管线生产，对菌株分子不产生诱变，活性分子结构不产生影响，只针对分子的能级变化，且处理效果较高，可以在处理结束后直接进行接种发酵，摈弃了繁琐的筛菌过程，大大缩短生产周期，简化生产过程，能有效节省公司和企业的人力、物力和时间成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α-淀粉酶活性的方法，属于菌株活性提高领域。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种革兰氏染色为阳性且产芽孢的细菌。在显微镜下呈现为短杆状(0.7～3.0μm)，最适生长温度为28～30℃，最适生长的pH为6.5～7.0。固体培养基上的菌落主要为淡黄色，不透明，表面粗糙且边缘不规则。在发现的早期，它因能够发酵产生淀粉酶的能力而被命名为解淀粉芽孢杆菌。解淀粉芽孢杆菌普遍存在于食物、植物、土壤等各种环境中，具有极强的应用价值。在发酵过程中，解淀粉芽孢杆菌的代谢产物能够有效抑制真菌和细菌的生长，主要是代谢产物中含有抗菌肽、细胞壁降解酶和脂肽抗生素等活性物质。另外，解淀粉芽孢杆菌也能产生分解多糖和蛋白质等多种酶类，有效促进植物的生长，减少植物真菌病害。
目前，人们对冷等离子体技术的应用主要集中在常压室温等离子体(ARTP)。这种技术操作简易，条件温和，安全便捷，并容易实现连续化工作。然而，这种技术也存在一些问题，如它所产生的等离子体能量较低，无法在材料表面发生因光子碰撞引起的光化学反应，另外，该技术采用的是菌种诱变原理，存在对菌株的致死率较高，突变率低等问题，诱变后需要进行繁琐的筛菌过程，工作量大，实验周期长，会限制相关技术的发展。
发明内容
为了更高效的提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α-淀粉酶活性，本发明提供一种采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α-淀粉酶活性的方法，利用冷等离子体中的真空紫外光辐射菌株表面，使菌株吸收光子的能量，生长速率和产酶活性能够明显提高。真空紫外射频等离子体作用于解淀粉芽孢杆菌是等离子体的一种新应用，真空紫外射频等离子体的产生方法为：首先使用真空泵对工作腔体抽真空至本底(2Pa)；然后给定工作气体至设定气压；最后打开等离子体电源(13.56MHz)，使其辉光放电，最终产生高能量真空紫外等离子体。冷等离子体处理就是通过射频放电产生的真空紫外光子均匀照射在长有菌株的平板表面，使菌株吸收能量，进而产生能级的跃迁，生长速率和酶活力得到显著提高，达到预处理的效果。此种方法处理时间短、成本低廉和绿色环保，因此具有广阔的应用前景。
为了实现本发明目的，所采用的技术方案为：一种采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α-淀粉酶活性的方法，包括如下步骤：将长满解淀粉芽孢杆菌的LB平板至于冷等离子体处理设备中，使菌株经冷等离子体环境中的真空紫外光子辐射后产生能级的跃迁。所述冷等离子体处理设备以氦气为冷等离子体气源，氦气经射频放电产生氦高能等离子体和真空紫外光子。
进一步的，所述冷等离子体处理设备处理解淀粉芽孢杆菌的放电功率为60-200W(更进一步优选120W)。
进一步的，所述冷等离子体处理设备处理解淀粉芽孢杆菌的放电时间为5-30s(更进一步优选15s)。
进一步的，所述冷等离子体处理设备处理解淀粉芽孢杆菌的工作气压为60-200Pa(更进一步优选135Pa)。
在较短时间内均匀照射解淀粉芽孢杆菌的表面，使其分子吸收能量，最终产生能级的跃迁。
与现有技术相比本发明的优点在于：
1.本发明采用冷等离子体中的真空紫外光辐射解淀粉芽孢杆菌，整个过程无加热，处于低温管线生产，且大大缩短了处理时间，对菌株分子不产生诱变，活性分子结构不产生影响，只针对分子的能级变化，且处理效果较高，可以在处理结束后直接进行接种发酵，大大缩短生产周期，简化生产过程，能有效节省公司和企业的人力、物力和时间成本。
2.改变了传统的提高解淀粉芽孢杆菌生长速率和产酶活性的方法，摈弃了繁琐的筛菌过程，成本更加低廉且绿色环保。
附图说明
图1放电功率对菌株生长曲线的影响；
图2为放电功率对菌体分泌α-淀粉酶的影响(图中小写字母a、b、c表示处理间差异显著性(不同字母表示两者之间具有差异显著性，同一个字母表示两者之间没有差异显著性)，p<0.05(p为统计学T检验里的一个值，值的大小代表显著性差异，P>0.05表示两个样之间无显著性差异；P<0.05表示显著性差异))；
图3为放电时间对菌株生长曲线的影响(图中不同小写字母表示处理间差异显著性，p<0.05)；
图4为放电时间对菌体分泌α-淀粉酶的影响；
图5为工作气压对菌株生长曲线的影响；
图6为工作气压对菌体分泌α-淀粉酶的影响(图中不同小写字母表示处理间差异显著性，p<0.05)。
具体实施方式
本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明下面结合实施例作进一步详述：
以下实施例采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及
产α-淀粉酶活性的方法，包括如下步骤：将长满解淀粉芽孢杆菌的LB平板至于冷等离子体处理设备中，使菌株经冷等离子体环境中的真空紫外光子辐射后产生能级的跃迁。各实施例的放电功率、处理时间及工作气压取值见表1至表3。
以下实施例中生长速率测定方法，包括如下步骤：
(1)LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，
pH7.0，搅拌混匀，高温(121℃)灭菌20min。固体培养基加1.5％(质量分数)琼脂。
(2)发酵培养基(g/L)：KH2PO4 1.7，K2HPO4·3H2O 5.7，(NH4)2SO4 2.6，可溶性淀粉10，MgSO4·7H2O 0.195，MnSO4·H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.05，CaCl2·2H2O 0.003。
(3)用接种环从真空紫外射频等离子体处理过的解淀粉芽孢杆菌中挑取单菌落至30mL步骤(1)中的LB液体培养基中。活化12h后，按10％的接种量接种至100mL步骤(2)的发酵培养基中，30℃，180r/min条件发酵培养48h。每4h取2mL菌液，稀释一定的倍数，通过多功能酶标仪测定其OD600值。每组5个平行样。以未经处理的解淀粉芽孢杆菌作为对照。
以下实施例采用碘液法测定解淀粉芽孢杆菌产α-淀粉酶活性
1.原理：
α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4-葡萄糖苷键随机切断，使淀粉分子成为长短不一的短链糊精以及少量麦芽糖和葡萄糖，因此酶反应过程中淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失。在特定的时间内，通过测定反应前后的溶液在波长660nm下的光密度值，以颜色消失的速度计算酶活力。
2.操作方法如下
(1)配制质量百分含量为1％的可溶性淀粉溶液：称取1g可溶性淀粉，先加50mL蒸馏水煮沸溶解，然后定容至100mL，现配现用。
(2)配制原碘液：称取碘1.1g，碘化钾2.2g，加水搅拌溶解，定容至50mL，放置于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。
(3)配制稀碘液：称取40g碘化钾于烧杯中，加入4mL原碘液加水溶解，定容至1000mL，放置于棕色瓶中，4℃冰箱保存备用。
(4)配制磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠11.3075g，柠檬酸2.0175g，加水溶解，定容至250mL，调节pH至6.0。
(5)配制0.5mol/L乙酸溶液：称取乙酸溶液30g，加水定容至1000mL。
(6)取1％可溶性淀粉溶液2mL，加入磷酸缓冲液(pH 6.0)1mL，40℃预热5min。
(7)加入稀释10倍的α-淀粉酶酶液，40℃反应30min，然后加入0.5mol/L的乙酸溶液10mL终止反应。
(8)吸取反应液1mL，加入10mL工作碘液显色，利用紫外-可见分光光度计测量其在660nm波长下的吸光度值，以1mL水代替1mL酶液为对照，以1mL乙酸加10mL工作碘液为空白。
下面将结合表1—表3具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
表1放电功率的单因素优化
表2放电时间的单因素优化
表3工作气压的单因素优化
实施例1：
如表1试验号1(即平板编号，下同)和图1、图2所示：当冷等离子体的放电功率为80W，放电时间为15s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为3.076，淀粉酶活为331U/mL。
实施例2：
如表1试验号2和图1、图2所示：当冷等离子体的放电功率为100W，放电时间为15s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为2.987，淀粉酶活为372U/mL。
实施例3：
如表1试验号3和图1、图2所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为15s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为3.349，淀粉酶活为379U/mL。
实施例4：
如表1试验号4和图1、图2所示：当冷等离子体的放电功率为140W，放电时间为15s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为3.086，淀粉酶活为346U/mL。
实施例5：
如表1试验号5和图1、图2所示：当冷等离子体的放电功率为160W，放电时间为15s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为3.044，淀粉酶活为348U/mL。
实施例6：
如表2试验号1和图3、图4所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为10s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为2.921，淀粉酶活为351U/mL。
实施例7：
如表2试验号2和图3、图4所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为15s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为3.065，淀粉酶活为383U/mL。
实施例8：
如表2试验号3和图3、图4所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为20s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为2.9，淀粉酶活为376U/mL。
实施例9：
如表2试验号4和图3、图4所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为25s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为2.882，淀粉酶活为372U/mL。
实施例10：
如表2试验号5和图3、图4所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为30s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为2.854，淀粉酶活为353U/mL。
实施例11：
如表3试验号1和图5、图6所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为15s，工作气压为120Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为3.003，淀粉酶活为378U/mL。
实施例12：
如表3试验号2和图5、图6所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为15s，工作气压为135Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为3.211，淀粉酶活为404U/mL。
实施例13：
如表3试验号3和图5、图6所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为15s，工作气压为150Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为2.816，淀粉酶活为361U/mL。
实施例14：
如表3试验号4和图5、图6所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为15s，工作气压为165Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为2.683，淀粉酶活为356U/mL。
实施例15：
如表3试验号5和图5、图6所示：当冷等离子体的放电功率为120W，放电时间为15s，工作气压为180Pa，此时处理之后的解淀粉芽孢杆菌发酵48h后的OD600为2.671，淀粉酶活为346U/mL。
实施例16：
对未经冷等离子体处理的解淀粉芽孢杆菌进行生长速率测定和酶活测定，其最终OD600最高为2.72，酶活最高为341U/mL。
最终结果显示，未经处理的解淀粉芽孢杆菌，其最终OD600最高为2.72，酶活最高为341U/mL；而在最佳条件下采用冷等离子体技术处理后的解淀粉芽孢杆菌，其最终OD600最高为3.35，提高23.16％，酶活最高为404U/mL，提高18.48％。
如图1生长曲线所示：延长发酵时间至60h，未经冷等离子体处理的解淀粉芽孢杆菌的生长进入衰亡期，而经过冷等离子体处理的菌株生长在相同时间内处于稳定期。
需要说明的是，本发明附图中CK是指代未经冷等离子体处理的解淀粉芽孢杆菌。
上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (4)
1.一种采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α-淀粉酶活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：将长满解淀粉芽孢杆菌的LB平板至于冷等离子体处理设备中，使菌株经冷等离子体环境中的真空紫外光子辐射后产生能级的跃迁；所述冷等离子体处理设备以氦气为冷等离子体气源，氦气经射频放电产生氦高能等离子体和真空紫外光子；
所述冷等离子体处理设备处理解淀粉芽孢杆菌的放电功率为100-120W，所述冷等离子体处理设备处理解淀粉芽孢杆菌的放电时间为15-25s，所述冷等离子体处理设备处理解淀粉芽孢杆菌的工作气压为120-135Pa。
2.根据权利要求1所述的采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α-淀粉酶活性的方法，其特征在于：所述冷等离子体处理设备处理解淀粉芽孢杆菌的放电功率为120W。
3.根据权利要求1所述的采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α-淀粉酶活性的方法，其特征在于：所述冷等离子体处理设备处理解淀粉芽孢杆菌的放电时间为15s。
4.根据权利要求1所述的采用真空紫外射频等离子体提高解淀粉芽孢杆菌代谢能力及产α-淀粉酶活性的方法，其特征在于：所述冷等离子体处理设备处理解淀粉芽孢杆菌的工作气压为135Pa。
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