CN113350516A - 一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子及其制备和应用 - Google Patents

一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子及其制备和应用。该制备方法包括：Dex‑PEG‑COOH溶液的制备，树状大分子G5.NH2‑(PEG‑Dex)的制备，Au‑DexDENPs的制备，同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子纳米颗粒的制备。该方法简单，实验条件温和，易操作；制备得到的功能化树状大分子包裹金纳米颗粒，具有良好的水溶性和生物相容性，对炎症巨噬细胞具有抑制性，在炎症基因治疗和化疗等生物医学方面具有良好的应用潜力。

Description

一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子及其 制备和应用
技术领域
本发明属于多功能高分子纳米载体及其制备和应用领域，特别涉及一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子及其制备方法和应用。
背景技术
急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是临床上常见的危重病症，其标志性病理特征为肺部炎症和肺组织结构破坏。ALI的发病机制并不明确，目前已知氧化应激及炎症反应是其发生发展的重要机制。在炎症反应过程中，巨噬细胞通过其胞膜表面表达的TOLL样受体4(TLR4)识别LPS等病原损伤的相关分子模式，进而激活下游信号通路，包括NF-κB、MAPKs、JAK1-STAT1等。随后，活化的炎症相关信号诱导一系列促炎因子的转录翻译，包括诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、环氧合酶2(COX-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)等，从而参与炎症性疾病的发生与发展。因此，通过抑制巨噬细胞的炎症反应，可能是治疗急性肺损伤有效的策略。
地塞米松(Dex)是一种具有强抗炎作用的合成类糖皮质激素，广泛用于治疗炎症性疾病。研究发现，Dex通过与其受体的作用来发挥其生物活性，与机体的应激和炎症反应密切相关。但是，由于Dex自身特性(水溶性差及毒副作用大等)限制了其在炎症治疗中的应用。已有学者利用地塞米松磷酸钠(DP)、叶酸(FA)与聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)共聚物形成的纳米复合物(FA-DPNPs)用于靶向巨噬细胞的炎症反应治疗，在激活的巨噬细胞中，纳米复合物被高度摄取，炎症因子COX-2的表达明显下降(Cao et al.Macromol.Res.,Vol.23,No.5,2015)。
基因治疗是指利用一定的载体或手段将功能性外源基因导入细胞中，通过外源基因的表达产物或外源基因抑制靶基因的转录或翻译，从而介入疾病的治疗。miRNAs是一类22nt的内源性高度保守性非编码RNA，普遍存在于真核生物中，起着调控基因表达的重要作用。研究发现miRNAs参与调节多种细胞分化，并与多种疾病相关。在已被证实的数百种miRNAs中，miR-155与炎症反应密切相关，研究发现在骨髓来源巨噬细胞模型中，LPS刺激可显著提高miR-155的表达水平，而miR-155i则逆转了这一结果。通过抑制巨噬细胞向M1型极化，上调靶向蛋白细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)的表达，可以显著减少炎症因子的释放(J.Hu,et al.European Journal of Pharmacology 851(2019)122–132)。
目前基因治疗主要的障碍就是缺乏一种安全高效的载体。在基因载体系统中，主要包含病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染效率高，但是生物安全性较差。非病毒载体，由于其低细胞毒性、无免疫原性、高基因上载量等优点，备受研究者关注。非病毒载体中，聚酰胺-胺树状大分子(PAMAM)是目前研究最深入的树状大分子之一，高度支化的三维立体结构和丰富的表面氨基令其被广泛应用于基因传递。研究表明，PAMAM的基因传递效率和细胞毒性随着其代数的增加而增加，而第五代PAMAM虽然具有一定的毒性，但可以通过内部包裹金纳米颗粒(Shan et al.,Biomaterials,2012,33(10),3025-3035)或进行表面功能化基团修饰(Li et al.,Small 2020,16,2005661)等手段降低其细胞毒性，提高其基因转染效率。
检索国内外相关文献和专利结果表明：以聚乙二醇化的Dex修饰PAMAM为模板包裹金纳米颗粒作为载体，同时负载microRNAinhibitor用于急性肺损伤的化疗和基因治疗联合治疗，尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子及其制备方法和应用，以填补现有技术的空白。
本发明提供一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子纳米颗粒，以第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2为纳米平台，表面修饰聚乙二醇化的Dex、内部包裹金纳米颗粒，然后负载miR-155i获得。
本发明还提供一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将Dex溶于溶剂中，得到Dex溶液。HOOC-PEG-COOH溶液经EDC和DMAP活化后，与Dex溶液混合，搅拌反应，得到Dex-PEG-COOH溶液，其中Dex、HOOC-PEG-COOH、EDC和DMAP的摩尔比为0.98-1.1:0.98-1.1:2-4:5-7；
(2)将步骤(1)中Dex-PEG-COOH溶液经EDC和NHS活化，加入到第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液中，搅拌反应，得到树状大分子G5.NH2-(PEG-Dex)，其中G5.NH2、Dex-PEG-COOH、EDC和NHS的摩尔比为1:9-11:90-110:90-110；
(3)将氯金酸水溶液逐滴加入到步骤(2)中G5.NH2-(PEG-Dex)的溶液中混合，加入硼氢化钠溶液，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到Au-Dex DENPs，其中G5.NH2-(PEG-Dex)与氯金酸、硼氢化钠的摩尔比为1:25-27:70-80；
(4)将步骤(3)中Au-Dex DENPs溶于无菌水中，得到Au-Dex DENPs溶液，然后与miR-155i(microRNA-155inhibitor)溶液混合，孵育，得到Dex修饰的树状大分子包裹的金纳米颗粒/基因复合物，即同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子纳米颗粒。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中溶剂为无水DMSO；Dex溶液浓度为3～5mg/mL。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中HOOC-PEG-COOH溶液浓度为8～15mg/mL，溶剂为无水DMSO。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中活化时间为2-5h。
优选地，上述方法中，所述步骤(1)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为72～78小时。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中G5.NH2溶液浓度为8～12mg/mL，溶剂为超纯水。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中活化时间为2-5h。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为72～78小时。
优选地，上述方法中，所述步骤(2)中透析选取截留分子量为5000的透析袋。
优选地，上述方法中，所述步骤(3)中将氯金酸水溶液逐滴加入到步骤(2)中G5.NH2-(PEG-Dex)溶液中混合是在冰浴搅拌条件下混合。
优选地，上述方法中，所述步骤(3)中搅拌反应时间为3～4h。
优选地，上述方法中，所述步骤(4)中miR-155i溶液的溶剂为DEPC水。
优选地，上述方法中，所述步骤(4)中孵育温度为35～37℃，孵育时间为20～30分钟。
本发明还提供一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子纳米颗粒在制备急性肺损伤治疗药物中的应用，例如用于制备急性肺损伤化疗和基因治疗联合治疗药物。
本发明以树状大分子作为纳米平台，表面修饰聚乙二醇化的Dex、内部包裹金纳米颗粒，形成具有高转染效率的纳米载体。本发明利用树状大分子表面丰富的氨基，首先将聚乙二醇化的Dex连接到G5.NH2的外围，进一步包裹金纳米颗粒。聚乙二醇的修饰不仅可以降低G5.NH2的细胞毒性，还可以将疏水性抗炎药物连接到树状大分子表面，增强药物水溶性。包裹的金纳米颗粒同样不仅可以降低G5.NH2的细胞毒性，还可以显著增强载体的转染效率。
本发明以功能化的树状大分子为纳米载体，负载miR-155i，以脂多糖激活的肺泡巨噬细胞(MH-S)为研究对象，通过miR-155i转染上调MH-S的SOCS1蛋白表达。通过核磁共振氢谱(1H-NMR)对修饰在树状大分子上mPEG-COOH、Dex-PEG-COOH的数量进行了表征；紫外可见光谱(UV-vis)对Au的成功包裹进行了表征；通过透射电镜(TEM)分析了纳米金的尺寸大小；通过凝胶阻滞实验和电势粒径检测对载体负载miR-155i的能力进行了表征；通过CCK-8实验对载体、载体/miR-155i复合物的细胞毒性进行表征；通过流式细胞仪对载体负载miR-155i后的转染能力进行了定量分析；利用实时荧光定量PCR、免疫印迹法、酶联免疫吸附实验评价载体的基因治疗和化疗联合治疗效果。
有益效果
(1)本发明简单，实验条件温和，易操作；
(2)本发明制备得到的功能化树状大分子包裹金纳米颗粒，具有良好的水溶性和生物相容性，对炎症巨噬细胞具有抑制性；
(3)本发明的材料转染过程易于操作，同时具有良好的药物治疗效果，在炎症基因治疗和化疗等生物医学方面具有良好的应用潜力。
附图说明
图1为本发明的合成过程及急性肺损伤治疗应用示意图；
图2为本发明制备的Au DENPs(a)、Dex-PEG-COOH(b)和Au-Dex DENPs(c)的核磁共振氢谱图；
图3为本发明制备的Au DENPs和Au-Dex DENPs的UV-vis图谱；
图4为本发明制备的Au DENPs(a)和Au-Dex DENPs(b)的透射电镜图和粒径分布直方图；
图5为本发明制备的Au DENPs/miR-155i复合物(a)和Au-Dex DENPs/miR-155i(b)的凝胶阻滞实验电泳图，其中2～7分别代表N/P比值为0.25、0.5、1、2、4和6的载体/miR-155i复合物，1代表裸miR-155i；
图6为本发明制备的Au DENPs/miR-155i及Au-Dex DENPs/miR-155i在不同N/P比下的表面电势图；
图7为本发明制备的Au DENPs/miR-155i及Au-Dex DENPs/miR-155i在不同N/P比下的水动力直径图；
图8为本发明制备的Au DENPs和Au DENPs/miR-155i(a)及Au-Dex DENPs和Au-DexDENPs/miR-155i(b)对MH-S的细胞毒性结果图；
图9为本发明制备的Au DENPs/miR-155i及Au-Dex DENPs/miR-155i被MH-S摄取能力测试结果图；
图10为本发明制备的Au DENPs/miR-155i及Au-Dex DENPs/miR-155i对MH-S内IL-1β、TNF-α、COX-2和SOCS1基因的RT-PCR定量分析结果图；
图11为本发明制备的Au DENPs/miR-155i及Au-Dex DENPs/miR-155i对MH-S细胞处理后细胞内COX-2和SOCS1蛋白表达的Western blot试验结果图；
图12为本发明实施例9中各实验组小鼠肺泡灌洗液相关炎症因子ELISA含量测定结果图；
图13为本发明实施例10中各实验组小鼠肺部组织切片染色分析结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特殊说明，否则所有化学试剂都是可商购的，无需进一步纯化即可直接使用。G5.NH2购自美国Dendritech公司。氯金酸购自国药集团化学试剂有限公司(中国上海)。RPMI-1640培养基(1640培养基，GIBCO,Invitrogen,Carlsbad,CA)，胎牛血清(FBS,GIBCO)，青霉素-链霉素(HyClone,Thermo Scientific,Logan,UT)和胰蛋白酶0.25％溶液(HyClone)购自杭州吉诺生物医学技术有限公司(中国杭州)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)来自7Sea Biotech Co.,Ltd.(中国上海)。从上海Slac实验动物中心(中国上海)购买约6周大的小白鼠。所有实验中使用的电阻率高于18.2MΩ.cm的水均通过实验室水净化系统(Cascada I,PALL，北京，中国)进行净化。
实施例1
(1)称取HOOC-PEG-COOH 57.7mg溶于5mL无水DMSO中，加入EDC(55.27mg)和DMAP(21.14mg)活化3小时。称取Dex 11.3mg溶于3mL无水DMSO中，随后逐滴加入到HOOC-PEG-COOH溶液中，室温搅拌3天，将所得的溶液用截留分子量为500的透析袋在水溶液中透析3天(2L/次，3次/天)，经冷冻干燥后得到Dex-PEG-COOH。
(2)称取第五代PAMAM 50mg溶于5mL超纯水中，将步骤(1)得到的Dex-PEG-COOH溶于5mL超纯水中，加入EDC(55.27mg)和NHS(33.18mg)活化3小时后滴加到G5.NH2溶液中，室温搅拌反应3天，得到G5.NH2-(PEG-Dex)。
(3)在步骤(2)得到的G5.NH2-(PEG-Dex)中逐滴加入687μL HAuCl4溶液(30mg/mL)，冰浴搅拌混合20min后，加入过量预冷的NaBH4溶液(5.67mg，1mg/mL)继续反应4小时，得到{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-Dex)}(Au-Dex DENPs)。
合成过程中对树状大分子表面修饰用核磁进行表征：
图2b，在Dex-PEG-COOH的核磁共振氢谱图中，3.63ppm是(HOOC-PEG-COOH)重复单元-CH2CH2-的质子峰。处于6-8ppm的质子峰，其归属于Dex苯环上的质子。根据它们积分面积之比，计算出每个HOOC-PEG-COOH上连接了0.66个Dex分子。图2c，在Au-Dex DENPs的核磁共振氢谱图中，在化学位移2.25-3.4ppm处的质子峰代表G5.NH2的亚甲基质子峰，3.63ppm是(HOOC-PEG-COOH)重复单元-CH2CH2-的质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个G5.NH2上连接了10个Dex-PEG-COOH分子，每个G5.NH2上修饰了6.6个Dex。
TEM图片表明金纳米颗粒直径约2.1nm(图4b)，尺寸分布较窄，具有良好的分散性。进一步以电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)测定产物中Au含量，结果表明平均每个树状大分子包裹25个金原子。
对比例1
(1)称取第五代PAMAM 50mg溶于5mL超纯水中，称取mPEG-COOH(57.7mg)溶于5mL超纯水中，加入EDC(55.27mg)和NHS(33.18mg)活化3小时后加入到G5.NH2溶液中，室温搅拌反应3天，得到G5.NH2-mPEG。
(2)在步骤(1)得到的G5.NH2-mPEG中逐滴加入687μL HAuCl4溶液(30mg/mL)，冰浴搅拌混合20min后，加入过量预冷的NaBH4溶液(5.67mg，1mg/mL)继续反应4小时，得到{(Au0)25-G5.NH2-mPEG)}(Au DENPs)。
合成过程中对树状大分子表面修饰用核磁进行表征，对各个峰进行积分计算可知：树状大分子表面修饰了10个mPEG-COOH(图2a)。TEM图片表明金纳米颗粒直径约2.0nm(图4a)，尺寸分布较窄，具有良好的分散性。进一步以电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP-OES)测定产物中Au含量，结果表明平均每个树状大分子内部包裹了25个金原子。
实施例2
将实施例1中{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-Dex)}和对比例1中{(Au0)25-G5.NH2-mPEG)}分别溶解于超纯水中，配制成浓度为0.2mg/mL溶液，利用紫外-可见分光光度检测在300nm-800nm波段范围内的紫外吸收值。紫外-可见分光光度检测结果如图3所示，520nm左右有吸收峰，说明金纳米颗粒的成功包裹。
实施例3
根据实施例1的方法制备的{(Au0)25-G5.NH2-mPEG)}DENPs和{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-Dex)}DENPS与miR-155i形成复合物，进行琼脂糖凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(1mg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0％w/v)，室温放置待琼脂糖凝胶凝固。按照不同N/P比(N/P比为树状大分子的伯氨基与miR-155i骨架上磷酸基团的摩尔比)0.25、0.5、1、2、4和6，miR-155i量为1μg/孔，配制载体/miR-155i复合物，孵育20min，并以裸miR-155i为对照，然后将载体和miR-155i(1μg)混合在一起，经静电吸附作用自动形成载体/miR-155i复合物。对随后加到琼脂糖凝胶孔中，电压100v，电泳时间35min。使用凝胶成像仪对miR-155i在凝胶中的迁移进行分析。结果如图5所示，{(Au0)25-G5.NH2-mPEG)}DENPs和{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-Dex)}DENPS都可以在N/P＝1时与miR-155i很好复合，将miR-155i的迁移完全阻滞，说明这两种载体均具有很好的基因负载能力。
实施例4
根据实施例1的方法制备的{(Au0)25-G5.NH2-mPEG)}DENPs和{(Au0)25-G5.NH2-(PEG-Dex)}DENPS分别与5μg miR-155i(N/P为10、20、30、40)复合后，在室温下孵育20min，然后加入1mL蒸馏水。采用马尔文激光粒度仪(Malvern，MK)在633nm激光波长处测定复合物的水动力学粒径和表面电势。结果如图6和7所示，两种载体的电势均在30mV以下，水合粒径均在300nm以内，这非常有利于复合物与细胞间进行静电相互作用，易于细胞内吞，非常适合用于基因传递应用。
实施例5
以MH-S为模型细胞来检测实施例1所制备的载体以及载体/miR-155i复合物的细胞毒性。收集MH-S细胞，按照8×103个细胞每孔的密度接种在96孔细胞培养板上，置于5％CO2，37℃条件下孵育过夜，添加2μg/mL LPS孵育细胞24h，弃掉培养基后，每孔更换90μL无血清培养基，并添加10μL含不同浓度的材料(最终材料浓度为0、50、100、500、1000、2000、3000nM)及其与miR-155i复合物(复合物中miR-155i的用量为1μg/孔)。之后将细胞培养板继续放置在5％CO2，37℃继续孵育24h。随后弃掉原培养基，加入含100μL含有10％CCK-8的无血清培养基，继续培养3h后，放置在多功能酶标仪中于测试波长450nm下测试吸光值。结果表明(图8)，与pH＝7.4的磷酸盐溶液(PBS)对照组相比，Au DENPs和Au-Dex DENPs在试验浓度范围内对MH-S细胞略有毒性，浓度为3000nM时细胞存活率为78％左右，负载miR-155i后，Au DENPs和Au-Dex DENPs与基因复合物各浓度的细胞存活率较Au DENPs和Au-DexDENPs相比有了明显的上升，说明负载基因减少了表面电荷有助于增强材料的细胞相容性。
实施例6
以MH-S细胞为细胞模型来评价细胞对载体/基因复合物的吞噬能力。将每孔1×105MH-S细胞种植于12孔板中，加入LPS孵育24h，然后将培养基换成含有载体/miR-155i在不同氮磷比(N/P＝2、5、10、20、30或40)的复合物的无血清培养基，与细胞共培养转染4h。转染结束后，将培养基和材料弃去，并用PBS清洗1-2遍以除去残留物质，利用胰酶消化并收集细胞。用流式细胞仪检测细胞样品的荧光强度以表征细胞对载体/基因复合物的细胞摄取情况。实验结果表明(图9)：各载体/基因复合物经过细胞转染4h后，都能够成功被细胞内吞，随着N/P比的增加，荧光强度呈现出先增强后减弱的趋势，并且当N/P＝20时，检测到最强的荧光强度。说明N/P＝20为Au DENPs和Au-Dex DENPs用于基因转染的最佳N/P比，材料能够将基因完全压缩，形成的复合物被MH-S细胞吞噬量最高。
实施例7
将肺泡巨噬细胞种于12孔板上，于37℃、5％CO2培养24小时，加入脂多糖LPS溶液孵育12小时，更换成含血清培养基或者无血清培养基，加入实施例1和对比例1所述的树状大分子纳米颗粒与基因的复合物(复合物中miR-155i的用量为1μg/孔，N/P＝20)，在培养箱中培育4小时，然后将培养基换成含血清培养基继续培养24小时。RT-PCR实验检测肺泡巨噬细胞IL-1β、TNF-α、COX-2和SOCS1的mRNA表达量。首先抽提总RNA，然后通过逆转录将RNA转化为cDNA，最后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。实验结果显示(图10)，LPS组的IL-1β和TNF-α的mRNA表达量明显增加，与Au DENPs/miR-155i组和Au-Dex DENPs/NC组相比，Au-DexDENPs/miR-155i组降低幅度最大。同时，上调SOCS1下调COX-2的表达，也是Au-Dex DENPs/miR-155i组的幅度最大。
实施例8
将肺泡巨噬细胞种于12孔板上，于37℃、5％CO2培养24小时，加入脂多糖LPS溶液孵育12小时，更换成含血清培养基或者无血清培养基，加入实施例1和对比例1所述的树状大分子纳米颗粒与基因的复合物(复合物中miR-155i的用量为1μg/孔，N/P＝20)，在培养箱中培育4小时，然后将培养基换成含血清培养基继续培养24小时。以MH-S细胞为细胞模型来评价载体/基因复合物(N/P＝20，孵育时间30分钟)对COX-2及SOCS1蛋白的沉默效率。将每孔2×105MH-S细胞种植于6孔板中，所用培养基为添加了100U/mL青霉素、100U/mL链霉素和10％FBS的RPMI-1640培养基，置于5％CO2、37℃条件下，培养过夜加入LPS孵育24h，然后将培养基换成PBS、Au DENPs/miR-155i、Au-Dex DENPs/NC和Au-Dex DENPs/miR-155i(miR-155i/NC＝2μg)与细胞共培养4小时。然后更换为含10％FBS的培养基，继续培养24h。利用胰酶消化并收集细胞，将细胞在冰上裂解，并于4℃，12000rpm离心5min，收集上清蛋白液。随后依次进行SDS-PAGE电泳、转膜、免疫反应、ECL化学显影剂定影实验，并对凝胶图像进行分析。实验结果如图11所示，单基因治疗组Au DENPs/miR-155i对SOCS1有明显的基因增强效果，单药治疗组Au-Dex DENPs/NC对COX-2有明显的抑制作用，而最终组Au-Dex DENPs/miR-155i对SOCS1和COX-2基因同时有着增强和抑制作用，并且比单独基因组和单化疗组的作用效果更明显，体现了基因治疗与药物化疗联合作用的优势。
实施例9
所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的6周龄雄性BALB/c小白鼠购自上海斯莱克实验动物中心(中国，上海)。将小鼠随机分为5组(每组6只)。分组如下：对照组(PBS，100μL)；LPS组(1mg/mL，100μL)；Au DENPs/miR-155i组(N/P＝20，miR-155i＝0.25mg kg-1，100μL)；Au-Dex DENPs/NC组(N/P＝20，NC＝0.25mg kg-1，100μL)；Au-DexDENPs/miR-155i组(N/P＝20，miR-155i＝0.25mg kg-1，100μL)。将LPS配置成1mg/mL的溶液，取100μL通过雾化装置打入小鼠肺部。ELISA法检测炎症因子的分泌。收集各组老鼠的的肺泡灌洗液备用待测。将标准工作液依次加入到前2列孔中，每孔100μL，待测样品加入到其他孔，每孔200μL。给酶标板覆膜，37℃孵育90min，弃去液体，甩干，不用洗涤，每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，混匀，酶标板加上覆膜，37℃温育1h，甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μL，浸泡2min，吸去或甩掉酶标板内液体，在厚的吸水板上拍干，在每孔加酶结合物工作液，底物溶液，终止液，立即用酶标仪在450nm处测量各孔的吸光度。根据标准品的浓度和OD值做标准曲线，然后根据标准曲线方程计算出样本浓度。实验结果显示(图12)：与LPS组相比，Au DENPs/miR-155i组和Au-Dex DENPs/NC组都能够抑制炎症因子的分泌。Au-DexDENPs/miR-155i处理组抑制效果明显大于Au DENPs/miR-155i组和Au-Dex DENPs/NC组，达到了基因治疗和化疗联合抗炎的目的。
实施例10
HE染色观察肺组织病理学变化。将实施例9处理过的肺组织置于4％甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切成薄片后用二甲苯脱蜡，经梯度乙醇脱水置换。按照标准程序进行苏木精-伊红染色，清洗、脱水、封片，于光学显微镜下观察组织病理学变化。实验结果显示(图13)：Control组肺组织结构清晰，肺泡结构未见明显异常。LPS组肺泡腔和间质可见大量中性粒细胞渗出，并伴有肺间质水肿、肺泡结构被破坏。Au DENPs/miR-155i组和Au-Dex DENPs/NC组肺组织中性粒细胞浸润有所减少，肺泡结构有所改善，肺间质水肿减轻。与此同时，最终组Au-Dex DENPs/miR-155i显示出最佳的治疗效果，肺组织结构形貌与Control组最接近。证明了Au-Dex DENPs/miR-155i组跟Au DENPs/miR-155i组和Au-Dex DENPs/NC组相比，具有更好的肺组织修复能力。

Claims (8)

1.一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子纳米颗粒，其特征在于，以第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2为纳米平台，表面修饰聚乙二醇化的Dex、内部包裹金纳米颗粒，然后负载miR-155i获得。
2.一种同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子纳米颗粒的制备方法，包括：
(1)将Dex溶于溶剂中，得到Dex溶液。HOOC-PEG-COOH溶液经EDC和DMAP活化后，与Dex溶液混合，搅拌反应，得到Dex-PEG-COOH溶液，其中Dex、HOOC-PEG-COOH、EDC和DMAP的摩尔比为0.98-1.1:0.98-1.1:2-4:5-7；
(2)将步骤(1)中Dex-PEG-COOH溶液经EDC和NHS活化，加入到第五代聚酰胺-胺树状大分子G5.NH2溶液中，搅拌反应，得到树状大分子G5.NH2-(PEG-Dex)，其中G5.NH2、Dex-PEG-COOH、EDC和NHS的摩尔比为1:9-11:90-110:90-110；
(3)将氯金酸水溶液逐滴加入到步骤(2)中G5.NH2-(PEG-Dex)的溶液中，加入硼氢化钠溶液，搅拌反应，透析，冷冻干燥，得到Au-Dex DENPs，其中G5.NH2-(PEG-Dex)与氯金酸、硼氢化钠的摩尔比为1:25-27:70-80；
(4)将步骤(3)中Au-Dex DENPs溶于无菌水中，然后与miR-155i溶液混合，孵育，得到同时负载地塞米松和基因药物的功能化树状大分子纳米颗粒。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶剂为无水DMSO；Dex溶液浓度为3～5mg/mL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中HOOC-PEG-COOH溶液浓度为8～15mg/mL，溶剂为无水DMSO。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中活化时间为2-5h；搅拌反应温度为室温，搅拌反应时间为72～78小时。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中搅拌反应时间为3～4h。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中miR-155i溶液的溶剂为DEPC水；孵育温度为35～37℃，孵育时间为20～30分钟。
8.一种如权利要求1所述的功能化树状大分子纳米颗粒在制备急性肺损伤治疗药物中的应用。
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