CN113350502B - 一种Pd@TiO2@ZnPc复合体系的制备方法及其复合体系和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Pd@TiO2@ZnPc复合体系的制备方法及其复合体系和应用，其制备包括：向Pd NS的溶液中加入TTIP反应后，离心洗涤收集固体Pd@TiO2，将Pd@TiO2加入ZnPc溶液中避光反应后，离心洗涤固体，获得Pd@TiO2@ZnPc。本发明制备的复合体系具有类过氧化氢酶活性，可有效分解肿瘤中高浓度的H2O2分解产生O2，实现增强乏氧肿瘤PDT治疗的目的，最终实现增强的肿瘤PDT与PTT协同治疗。本发明的制备方法简单、价格低廉、功能效果优异、生物相容性高，具有优异的光热性能，可做为肿瘤光热治疗剂，可以大规模生产利用。

Description

一种Pd@TiO2@ZnPc复合体系的制备方法及其复合体系和应用
技术领域
本发明属于具有光动力活性的光敏体系技术领域，具体涉及一种具有类过氧化氢酶活性的纳米复合体系Pd@TiO2@ZnPc复合体系的制备方法及其复合体系和在光动力治疗乏氧肿瘤中的应用。
背景技术
癌症严重危害着人类的生命健康安全。光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)做为一种非侵入性的光介导的治疗方法，通过局部光照激活光敏剂分子与氧气作用产生具有强生理毒性的活性氧物种(Reactive oxygen species,ROSs)。ROSs可以对肿瘤细胞造成氧化损伤，引起细胞凋亡和坏死。PDT的机理决定了光敏剂、光源及O2是其发挥活性的三要素。
健康组织内各细胞所处O2环境较为均衡，而实体肿瘤由于血管畸形造成了O2的供应效率低，并且肿瘤细胞的快速增殖进一步加剧了O2的消耗，造成了肿瘤组织处O2供应和消耗的严重不平衡，使肿瘤细胞呈现乏氧状态。乏氧不仅严重制约了PDT活性的发挥，还会促进肿瘤细胞的转移和侵袭。因此，寻求有效的方法增加肿瘤组织中O2的含量对于提高实体肿瘤PDT疗效具有重要意义。肿瘤细胞由于代谢异常导致H2O2在肿瘤细胞中大量积累，含量约为100μM，远高于正常细胞。因此，催化内源性H2O2分解产生O2为缓解肿瘤乏氧问题提供了可行的方法。
锌酞菁(Zinc phthalocyanine,ZnPc)是一类分子染料，具有光疗窗口吸收强及化学修饰简便等优点，是优良的光敏剂。然而，肿瘤微环境的乏氧特性限制了ZnPc的PDT活性发挥。
近年来，具有近红外强吸收的二维钯纳米片(Pd NS)因其良好的光热转换效率广泛应用于肿瘤光热治疗(Photothermal therapy,PTT)。此外，Pd NS还具有类过氧化氢酶的功能，可以催化H2O2分解产生O2。但Pd NS本身催化H2O2分解活性弱，产生O2效率低，如何通过简单有效的方法实现其催化活性的提升，增加肿瘤组织中O2的含量对于提高实体肿瘤PDT疗效具有重要意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种具有类过氧化氢酶活性的Pd@TiO2@ZnPc复合体系(定义为PTZCs)的制备方法，制备的复合体系可催化内源性H2O2分解产生O2缓解肿瘤乏氧问题，实现肿瘤乏氧区的有效PDT治疗以及与PTT协同治疗。
本发明还提供了所制备的Pd@TiO2@ZnPc复合体系及其应用。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种Pd@TiO2@ZnPc复合体系的制备方法，包括如下步骤：
向Pd NS的溶液中加入钛酸异丙酯(TTIP)反应后，离心洗涤收集固体Pd@TiO2，将Pd@TiO2加入ZnPc溶液中反应后，离心洗涤固体，获得Pd@TiO2@ZnPc。
作为优选，向Pd NS的醇水混合溶液中加入TTIP反应24h后，离心洗涤收集Pd@TiO2，将Pd@TiO2加入ZnPc的DMF溶液中避光反应2h后，离心洗涤，获得PTZCs。
其中，所述Pd NS由二(乙酰丙酮)钯(II)(Pd(acac)2(II))，NaI，PVP溶解在水和DMF的混合溶液中，将反应液转移到高压反应釜中充入CO，高温反应，离心洗涤得到。
其中，所述水和DMF的体积比为1:3-5，所述反应液转移到高压反应釜中充入CO，100℃反应2-5h。
作为优选，所述Pd NS由50mg Pd(acac)2,75mg NaI,160mg PVP溶解在水和DMF的混合溶液(水和DMF的体积比为1:3)中，将反应液转移到高压反应釜中充入CO，100℃反应3h，离心洗涤得到Pd NS。
其中，所述ZnPc先由K2CO3、对羟基苯甲酸与4-硝基邻苯二甲腈溶解于N-N-二甲基甲酰胺溶剂中，N2保护条件下，反应生成1,4-(3,4-二腈基苯氧基)苯甲酸；再由1,4-(3,4-二腈基苯氧基)苯甲酸与醋酸锌经DBU催化，在正戊醇溶液中反应生成酞菁化合物ZnPc。
作为优选，所述Pd@TiO2加入ZnPc的DMF溶液中避光搅拌过夜，所述ZnPc的DMF溶液的浓度为1-1.5mg/mL。
作为优选，所述ZnPc的DMF溶液的浓度为1mg/mL。
本发明所述的制备方法所制成的Pd@TiO2@ZnPc复合体系。
其中，所述的Pd@TiO2@ZnPc复合体系为一种适合静脉注射复合纳米粒子。
其中，所述的Pd@TiO2@ZnPc复合体系的具有类过氧化氢酶活性的PTZCs复合体系。
本发明所述的Pd@TiO2@ZnPc复合体系在制备光热治疗剂中的应用。
本发明所述的Pd@TiO2@ZnPc复合体系在制备肿瘤乏氧光热治疗剂和光动力治疗剂中的应用。本发明的Pd@TiO2@ZnPc复合体系在肿瘤乏氧光热、光动力协同治疗中的应用。
本发明制成的具有类过氧化氢酶活性的PTZCs复合体系可以治疗乏氧肿瘤。
本发明使用TiO2修饰Pd NS，获得Pd@TiO2，极大的提升了Pd NS的类过氧化氢酶活性，增强了催化H2O2分解产生O2的能力。随后，将Pd@TiO2开发为ZnPc的载体，合成PTZCs复合体系。
本发明针对实体肿瘤乏氧微环境导致的PDT效果显著下降这一问题，利用Pd@TiO2优异的类过氧化氢酶活性和载药能力，负载ZnPc，构建PTZCs复合体系(Pd@TiO2@ZnPc)，可催化内源性H2O2分解产生O2缓解肿瘤乏氧问题，实现肿瘤乏氧区的有效PDT治疗，并利用PdNS自身的PTT活性，实现肿瘤PDT与PTT协同治疗，获得良好治疗效果。
机理：本发明在Pd NS表面修饰TiO2(Pd@TiO2)后，极大的增强了催化H2O2分解产生O2的能力。并且Pd@TiO2中TiO2对ZnPc有极强的吸附能力，可实现ZnPc的高效负载，提高载药量从而提高治疗效率，所用的ZnPc为侧链四取代苯甲酸修饰锌酞菁衍生物。本发明合成了一种具有类过氧化氢酶活性的PTZCs复合体系。该体系催化肿瘤组织中的高表达的H2O2分解产生O2，缓解肿瘤乏氧，提高PDT疗效；此外，PTZCs复合体系中的Pd NS还具有PTT的效果，可实现PDT与PTT协同治疗肿瘤的效果。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、本发明所制得的PTZCs复合体系中Pd@TiO2极大的提升了Pd NS的类过氧化氢酶活性，可高效催化H2O2分解产生O2，缓解肿瘤乏氧，增强肿瘤PDT治疗效果。
2、本发明所制得的PTZCs复合体系中Pd@TiO2具有优异的光热性能，可做为肿瘤光热治疗剂，此外，Pd@TiO2对ZnPc有较高载药量。
3、本发明所制得的PTZCs复合体系可以实现缓解肿瘤乏氧，克服了实体肿瘤乏氧微环境导致的PDT效果显著下降这一问题，最终实现增强的肿瘤PDT与PTT协同治疗。
4、本发明的制备方法简单、价格低廉、功能效果优异、生物相容性高，可以大规模生产利用。
附图说明
图1为侧链四取代苯甲酸修饰锌酞菁衍生物合成路线图；
图2为Pd NS及Pd@TiO2对ZnPc负载能力对比图；
图3为各材料催化H2O2分解产生O2图；
图4为各材料在808nm激光器照射下光热升温曲线图(1W cm-2,8min)；(四条曲线从上到下依次为：PTZCs，Pd@TiO2，ZnPc，Water)
图5为PTZCs复合体系透射电镜图(标尺＝100nm)；
图6为乏氧环境下(1％O2)细胞中活性氧生成能力对比图；
图7为各药物细胞毒性图；
图8为乏氧环境下(1％O2)抗肿瘤活性图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
ZnPc合成
侧链四取代苯甲酸修饰酞菁衍生物的合成按图1所示步骤进行。将对羟基苯甲酸(579.7mg,4.2mmol)、4-硝基邻苯二腈(692mg,4mmol)、碳酸钾(K2CO3,1.38g,10mmol)和N,N-二甲基甲酰胺(DMF,10mL)的混合物在N2气氛下45℃搅拌过夜。反应结束后，将反应溶液与100mL冰水混合。加入盐酸至pH＝3时出现粘性固体沉淀物。经过滤、水洗、真空干燥得到1,4-(3,4-二腈基苯氧基)苯甲酸795.8mg，收率75.3％。将1,4-(3,4-二腈基苯氧基)苯甲酸(660mg,2.5mmol)和醋酸锌(275.2mg,1.5mmol)充分混合在10mL正戊醇中。将混合物在90℃下N2气氛中稳定30min，然后注入1,8-二氮杂二环(5.4.0)十一碳-7-烯(DBU,300μL)。提高温度至140℃，继续保持12h，柱层析纯化(甲醇:乙酸乙酯＝2:1，0.1M NaOH水溶液)。蓝色固体用盐酸沉淀，然后溶解在NaOH水溶液中，用盐酸沉淀。甲醇洗涤，真空干燥，得到深蓝色固体(114.6mg,16.4％)即为ZnPc。
IR(KBr,cm-1):3407-2925,1697,1599,1470,1391,1234,1160,1045,946.1HNMR(400MHz,d6-DMSO):δ(ppm)8.94(d,J＝20.8Hz,4H),8.55(d,J＝21.6Hz,4H),8.26-8.06(m,8H),7.90-7.74(m,4H),7.65-7.39(m,8H).13C NMR(100MHz,d6-DMSO):δ(ppm)206.99,167.29,161.80,161.54,139.65,132.47,126.46,124.47,121.83,118.76,118.31,113.41.MS-MALDI-TOF(m/z):calculated for C60H32O12N8Zn:1120.14.Found[M+H]+:1121.7.
实施例2
Pd NS的制备
将Pd(acac)2(50.0mg)、PVP(MW＝30000,160.0mg)、NaI(75.0mg)、DMF(9mL)和超纯水(3mL)在一个20mL的特氟龙内衬的高压釜中室温搅拌，得到均匀的黄色溶液。密封后，加入CO至2.5bar,0.5h内升高至100℃，维持2.5h，得到深蓝色胶体，全部倒入30mL丙酮中。9600rpm离心5min，所得沉淀用乙醇-丙酮(1/8，V/V)洗涤三遍，最后，产物为Pd NS。
实施例3
Pd@TiO2的制备
1.2mg实施例制备的Pd NS分散在0.4mL乙醇中与0.5mL水和9.5mL异丙醇混合。0.5h后滴加0.2mL含10.6μL钛酸异丙酯(TTIP)的异丙醇。持续搅拌24h，反应液倾入大量丙酮中，9600rpm离心分离5min取固体即为Pd@TiO2，继续用乙醇-丙酮(1/8，V/V)洗涤三遍，最后，产物重新分散在1mL乙醇中得到Pd@TiO2分散液。
实施例4
PTZCs复合体系构建
实施例3得到的Pd@TiO2分散液离心后，产物Pd@TiO2用乙醇-丙酮(1/8，V/V)再次洗涤纯化后均匀分散在溶解有3mg ZnPc的3mL DMF中，将反应溶液避光搅拌过夜，15000rpm离心10min收集固体PTZCs，用DMF-丙酮(1/5，V/V)、乙醇-丙酮(1/8，V/V)分别洗涤纯化，产物再用1mL乙醇分散。
试验例1
(1)Pd NS及Pd@TiO2对ZnPc负载能力对比：
Pd NS对ZnPc的负载过程与Pd@TiO2对ZnPc的负载过程相似，即：取1.2mg的Pd NS用乙醇-丙酮(1/8，V/V)再次纯化后均匀分散在溶解有3mg ZnPc的3mL DMF中，将反应溶液避光搅拌过夜，15000rpm离心10min收集固体，用DMF-丙酮(1/5，V/V)、乙醇-丙酮(1/8，V/V)纯化，再用1mL乙醇分散。
用紫外测定Pd NS及Pd@TiO2负载过ZnPc后上清液在660nm处的吸光度(Ax)与已知浓度(C0)的ZnPc吸光度(A0)比较，通过公式(1)得上清液中ZnPc的浓度Cx，
Figure BDA0003034878130000051
通过mx＝Cx V计算出上清液中ZnPc的质量mx，负载量即为mx/m(Pd NS或者Pd@TiO2)
如图2所示，Pd NS对ZnPc的负载量为0.063mg mg-1，而Pd@TiO2对ZnPc负载量为0.23mg mg-1，说明Pd@TiO2对ZnPc负载能力较Pd NS而言有了很大提升。
(2)各材料催化H2O2分解产生O2效果对比：
使用乏氧荧光探针[Ru(dpp)3]Cl2(赛默飞，美国)检测O2的生成。在一个典型的过程中，实验中是保持钯元素的量一致，按终浓度药物([Pd NS]＝0.4μgmL-1,[TiO2]＝0.8μgmL-1,[Pd@TiO2]＝1.2μg mL-1,[PTZCs]＝1.46μg mL-1)和[[Ru(dpp)3]Cl2]＝10μM分散在3mLN2饱和的含10mM过氧化氢的水溶液中，10min后比较各组的荧光信号强度值的大小。如图3所示，加Pd@TiO2或PTZCs的组荧光强度明显下降，要远低于其他组，说明Pd@TiO2和PTZCs可以很好的催化H2O2分解产生O2。
(3)各材料在808nm激光器照射下光热升温效果对比图
用808nm激光(1W cm-2,8min)照射1mL含不同药物的水溶液([ZnPc]＝8.2μg mL-1，[Pd@TiO2]＝35.5μg mL-1，[PTZCs]＝43.7μg mL-1)，用红外热成像仪记录其温度。如图4所示，加Pd@TiO2或PTZCs的组温度明显上升，而纯水和ZnPc水溶液温度基本没有变化，说明Pd@TiO2和PTZCs具有优异的光热升温效果。
(4)实施例4制备的PTZCs纳米复合体系的形貌以透射电子显微镜观测：
如图5所示，透射电镜观察纳米粒大小及形貌，(样品的制备方法是将样品的乙醇分散体滴到230目碳支持膜铜网格上，并蒸发溶剂)。结果显示复合纳米颗粒尺寸均一，分散良好。
(5)用激光共聚焦和流式细胞仪检测乏氧环境下(1％O2)细胞中活性氧生成能力：
将Hela细胞置于96孔板中(细胞接种密度为：1×105个/孔)，200μL，用不同的药物(PBS、ZnPc、Pd@TiO2、PTZCs)处理Hela细胞；([ZnPc]＝2.8μg mL-1，[Pd@TiO2]＝12.18μg mL-1，[PTZCs]＝14.98μg mL-1上述浓度为加入后终浓度，培养液为DMEM)，PBS(pH＝7.4)不含药物的组作为对照，在乏氧条件下37℃孵育12h，将DMEM细胞培养液换成含2.5μM DCFH-DA(碧云天)的DMEM，再孵育1h。最后用PBS冲洗细胞，用665nm LED照射(0.4W cm-2,50s)，用激光共聚焦获取细胞图像，流式细胞仪测量荧光强度。如图6所示，PTZCs与ZnPc相比在乏氧条件下也可以很好的产生活性氧，说明PTZCs可以缓解肿瘤乏氧，提升PDT效果。而Pd@TiO2不含光敏剂，不会产生活性氧。
(6)使用MTT法检测各药物对细胞的毒性；
将Hela细胞置于96孔板中(细胞接种密度为：1×105个/孔)，200μL，在乏氧条件(1％O2)下37℃培养24h，并用各种药物(PBS、ZnPc、Pd@TiO2、PTZCs)处理；([ZnPc]＝2.8μgmL-1，[Pd@TiO2]＝12.18μg mL-1，[PTZCs]＝14.98μg mL-1上述浓度为加入后终浓度，培养液为DMEM)，PBS(pH＝7.4)不含药物的组作为对照。24小时后用酶标仪记录细胞存活率。如图7为药物的暗毒，各给药组细胞存活率无明显下降，证明各药物具有很好的细胞相容性，无细胞毒性，有很好的安全性。
(7)使用MTT法检测体外抗肿瘤活性：
将Hela细胞置于96孔板中(细胞接种密度为：1×105个/孔)，200μL，在乏氧条件(1％O2)下37℃培养24h，并用各种药物(PBS、ZnPc、Pd@TiO2、PTZCs)处理；([ZnPc]＝2.8μgmL-1，[Pd@TiO2]＝12.18μg mL-1，[PTZCs]＝14.98μgmL-1上述浓度为加入后终浓度，培养液为DMEM)，PBS(pH＝7.4)不含药物的组作为对照。4小时后，用665nm LED(0.4W cm-2,50s)和/或808nm激光(1Wcm-2,3min)照射细胞。24小时后用酶标仪记录细胞存活率。如图8所示，665nm光照下，PTZCs与ZnPc相比在乏氧条件下也有很好的杀死细胞的效果，说明PTZCs可以缓解肿瘤乏氧，提升PDT效果；在808nm光照下Pd@TiO2和PTZCs可表现出温和的PTT效果，并且在665nm和808nm双波长照射下PTZCs可实现PDT与PTT协同治疗。

Claims (10)

1.一种Pd@TiO2@ZnPc复合体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
向Pd NS的溶液中加入钛酸异丙酯TTIP反应后，离心洗涤收集固体Pd@TiO2，将Pd@TiO2加入ZnPc溶液中反应后，离心洗涤固体，获得Pd@TiO2@ZnPc；所述ZnPc溶液为ZnPc的DMF溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Pd NS由Pd(acac)2， NaI， PVP溶解在水和DMF的混合溶液中，将反应液转移到反应釜中高温反应，离心洗涤得到。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述水和DMF的体积比为1:3-5，所述反应液转移到高压反应釜中充入CO，100°C反应2-5 h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述ZnPc先由K2CO3、对羟基苯甲酸与4-硝基邻苯二甲腈溶解于N-N-二甲基甲酰胺溶剂中，N2保护条件下，反应生成1, 4 -(3,4-二腈基苯氧基)苯甲酸；再由1, 4 -(3, 4-二腈基苯氧基)苯甲酸与醋酸锌经DBU催化，在正戊醇溶液中反应生成酞菁化合物ZnPc。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Pd@TiO2加入ZnPc的DMF溶液中避光搅拌过夜，所述ZnPc的DMF溶液的浓度为1-1.5mg/mL。
6.一种权利要求1-5任一所述的制备方法所制成的Pd@TiO2@ZnPc复合体系，所述复合体系作为光热治疗剂或者肿瘤乏氧光热和光动力治疗剂。
7.根据权利要求6所述的Pd@TiO2@ZnPc复合体系，其特征在于，所述复合体系为一种适合静脉注射复合纳米粒子。
8.根据权利要求6所述的Pd@TiO2@ZnPc复合体系，其特征在于，所述复合体系具有类过氧化氢酶活性。
9.一种权利要求6所述的Pd@TiO2@ZnPc复合体系在制备光热治疗剂中的应用。
10.一种权利要求6所述的Pd@TiO2@ZnPc复合体系在制备肿瘤乏氧光热和光动力治疗剂中的应用。
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