CN113349161B - 多子小瓜虫的传代保种培养保种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多子小瓜虫的传代保种培养保种方法，不用分离多子小瓜虫的滋养体，直接将感染多子小瓜虫的病鱼与健康鱼进行同居感染；采用曝气增氧和过滤的方法优化了多子小瓜虫的培养条件，一般7‑10天才需要更换新水；减少换水及水质变化对宿主鱼体和多子小瓜虫的影响，使得滋养体能在优良的环境中存活并在更短的时间内产生更多的掠食体；将滤棉上的多子小瓜虫包囊洗脱静置孵化掠食体后再移回养殖桶，不需分离操作，而且可控制养殖系统内的虫体数量，当养殖桶内包囊数量较多，则不用对滤棉上包囊进行回收孵化。利用本发明对多子小瓜虫进行传代保种培养，可以稳定地收获多子小瓜虫，方法简便。
Description
技术领域
本发明属于原代细胞培养技术领域，具体涉及一种感染草鱼的多子小瓜虫的传代保种培养方法。
背景技术
由多子小瓜虫引起的“白点病”常导致各种淡水鱼类(草鱼、金鱼、黄颡鱼、翘嘴红鲌等)造成的大量死亡，严重危害水产养殖，其也是一种世界性分布的寄生性纤毛虫。治疗小瓜虫病最有效的药物有孔雀石绿和硝酸亚汞制剂，而其潜在毒性以及高残留作用使效果不佳，目前在水产养殖中已被禁止使用。而针对多子小瓜虫筛选高效且安全的治疗药物，或是开展虫体疫苗制备，都需要实验室大量培育多子小瓜虫个体。
多子小瓜虫的生活史分为三阶段：滋养体、包囊以及掠食体。滋养体是多子小瓜虫的寄生阶段，借助吞食宿主细胞来促进自身生长发育，成熟后脱离鱼体，漂浮在水中一段时间后，沉降至水底，形成包囊。包囊是多子小瓜虫的繁殖阶段，一段时间的分裂后，包囊分泌出成百上千的掠食体。掠食体寻找新宿主并进入上皮组织内发育成为滋养体。目前实验室多子小瓜虫人工培育条件苛刻，培育水温要求在18-25℃范围，而且必须依靠鱼类宿主进行活体传代。现有的传代保种培养是从患病鱼体表分离滋养体，孵化为掠食体后感染宿主鱼，再将宿主鱼体表的滋养体进行分离孵化，感染新的一批宿主鱼，如此反复，工作繁琐且成本较高。由于从自然界获取原代多子小瓜虫季节性很强，主要是每年的4-6月，9-11月份。其他月份获取困难，而实验室的实验工作基本也是阶段性，短期结束后不能进行多子小瓜虫活体保存。因此开展多子小瓜虫的实验室传代保种培养，方便各实验室开展多子小瓜虫的相关实验研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种多子小瓜虫的传代保种培养方法，该方法简单便于操作，可以稳定培养采集到多子小瓜虫，便于延长虫株的保存时间，且成本低廉。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种多子小瓜虫的传代保种培养保种方法，包括以下步骤：
1)、设置养殖系统(养殖容器)：
养殖系统包括一个直径0.7±0.1m，高1±0.1m圆形的养殖桶，桶内蓄水高度0.5±0.1m，所述养殖桶配设增氧器、控温器及循环过滤装置，循环过滤装置内设有过滤棉和陶粒，养殖桶底部的水经过循环过滤装置后返回至养殖桶内；
说明：增氧可依靠气泵+增氧气石等实现；控温器可选用控温加热棒，此均为常规的增氧和水温控制方式；
2)、将感染有多子小瓜虫的淡水鱼病鱼1～2尾或1～5尾淡水鱼病鱼的鱼鳃置于养殖桶内(鱼鳃被浸没于水中)，同时放入健康淡水鱼3～8尾进行感染；
淡水鱼病鱼的尾重≤1000克，一般为500～1000克；
健康淡水鱼的尾重≤500克，一般为50～500克；
3)、保持养殖桶内的水温为20～26℃的恒温，养殖桶内水氧气的含量为≥5.0mg/L；
每天，先同步进行以下两项工作：
3.1)、将3个直径6cm的培养皿放入养殖桶内(位于养殖桶的底部)，10～12小时后拿出检查包囊数；
3.2)、更换循环过滤装置内的过滤棉，用清水将从循环过滤装置上取下的过滤棉进行冲洗(即，用清水将附着在滤棉上的多子小瓜虫的包囊及污物洗脱下来，水的用量一般为过滤棉体积的2～5倍)，所得的洗涤液于容器中静置后，分别形成上清和沉淀；静置时间同步骤3.1)设定的时间；
然后再进行以下操作：
当培养皿内的包囊平均数≥20个包囊/皿时，将上清(上清中含有孵化出的掠食体)倒回养殖桶内(即，过滤棉清洗下来的包囊不再回收，以控制多子小瓜虫的数量，从而实现淡水鱼能带虫生存)；
当培养皿内的包囊平均数＜20个包囊/皿时，将上清连同沉淀一起倒回养殖桶内；
说明：水温的变化幅度为±1℃；
4)、投喂饲料(每1～2天投喂一次饲料)；
每天检测一次养殖桶内的水质，当养殖桶内的水氨氮>0.3mg/L或亚硝酸盐>0.05mg/L时，需更换桶养殖桶中10～20％体积量的水；
说明：养殖桶内起始放入的水和每次更换时的用水为常规的淡水鱼养殖用水，更换新水时，是先将养殖桶内底部水排出，再将曝气调温(水中氧气的含量＞5.0mg/L，水温为20～26℃)后的新水直接加入养殖桶内；
按照本发明设定的方式，一般7-10天才需要进行一次上述的部分更换新水；
及时清理死亡的草鱼，原健康小草鱼死亡后，从养殖桶内取出，且补充相应数量的健康小草鱼(即，补充健康草鱼重新感染，健康小草鱼规格基本同被替代的死亡小草鱼的规格)，使得小草鱼的总数量保持不变；
当步骤2)中使用的是淡水鱼病鱼时，病鱼死亡后从养殖桶内取出；
当步骤2)中使用的是淡水鱼病鱼的鱼鳃时，从放入养殖桶内起的1～2天后从养殖桶内取出；
重复上述步骤3)，进行多子小瓜虫传代保种培养。
本发明中，鱼体等脱落的包囊孵化产生掠食体，掠食体感染鱼体成熟后形成包囊脱落，依次类推，进行多子小瓜虫的传代保种培养。
作为本发明的多子小瓜虫的传代保种培养方法的改进：
所述循环过滤装置每小时的循环水量是养殖桶内水量的(100±10)％。
作为本发明的多子小瓜虫的传代保种培养方法的进一步改进：
循环过滤装置包括循环水泵和过滤装置；
过滤装置包括一个底部为镂空层的箱体(长40cm×宽20cm×高20cm)，在镂空层的上表面铺设10±1cm厚、直径2～5mm的陶粒，陶粒上面铺20±2mm厚的过滤棉；
所述过滤装置位于养殖桶的上方；循环水泵将养殖桶底部的养殖水打入过滤装置，经过滤棉和陶粒的过滤后回到养殖桶内。
作为本发明的多子小瓜虫的传代保种培养方法的进一步改进：
养殖桶内上加盖板，所述盖板的作用是遮光及防鱼跳出。
作为本发明的多子小瓜虫的传代保种培养方法的进一步改进：
饲料为蛋白含量为28％的淡水鱼饲料。
说明：本发明中，饲料的投喂方式和投喂量按照常规的淡水鱼的饲料的投喂方式和投喂量。例如，每1～2天投喂一次饲料，以饲料基本不被剩余为准。
在本发明中，可将放置过夜的培养皿获得的包囊进行孵化，获得为掠食体后进行鱼体感染。
本发明的传代保种培养方法简化了多子小瓜虫的感染步骤，不用分离多子小瓜虫的滋养体，直接将感染多子小瓜虫的病鱼与健康鱼进行同居感染；采用曝气增氧和过滤的方法优化了多子小瓜虫的培养条件，一般7-10天才需要进行部分的更换新水；减少换水及水质变化对宿主鱼体和多子小瓜虫的影响，使得滋养体能在优良的环境中存活并在更短的时间内产生更多的掠食体；将滤棉上的多子小瓜虫包囊洗脱静置孵化掠食体后再移回养殖桶，不需分离操作，而且可控制养殖系统内的虫体数量，当养殖桶内包囊数量较多，则不用对滤棉上包囊进行回收孵化。利用本发明对多子小瓜虫进行传代保种培养，可以稳定地收获多子小瓜虫，方法简便，控制多子小瓜虫的数量，使感染多子小瓜虫的草鱼可以带病存活，降低传代保种培养成本，传代保种培养时间长，也可作为多子小瓜虫的保存培养。方便实验室开展多子小瓜虫的相关研究。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1多子小瓜虫包囊晚上释放掠食体的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、一种多子小瓜虫的传代保种培养方法，包括以下步骤：
1)、设置小瓜虫传代养殖系统：
直径0.7m，高1m的圆形平底养殖桶，养殖桶配有控温器(用于调节桶内水的温度)，还配设增氧器、循环过滤装置，循环过滤装置包括循环水泵和过滤装置；
过滤装置内设有过滤用的滤棉和陶粒；具体为：该过滤装置为长40cm×宽20cm×高20cm底部镂空的硬质塑料箱，箱底铺设10cm厚、直径2-5mm的陶粒，陶粒上面铺2cm厚的过滤棉(单层过滤棉)。陶粒，比重2.26g/cm3，孔隙率55％；为圆颗粒、表面粗糙、多微孔、内部孔隙发达，比表面积大。过滤棉，是以聚氨酯为主要成份的一种开孔式海绵，比重0.03g/cm3，厚度2cm。陶粒和过滤棉均能通过常规市购的形式获得。
该过滤装置位于养殖桶的上方。循环水泵将养殖桶底部的养殖水打入过滤装置，经过滤棉和陶粒的过滤后回到养殖桶内。养殖桶内蓄水基本保持在0.5±0.05m，桶上加盖板遮光及防鱼跳出。
该小瓜虫传代养殖系统使用前(即，进行下述步骤2)的多子小瓜虫感染前)的7天就需要开启运转，水温控制成如步骤3)设定的温度。
2)、多子小瓜虫感染：将来自浙江开化感染多子小瓜虫严重的草鱼1尾(规格780g)作为病鱼放入养殖桶内，同时放入健康小草鱼(平均规格85g)8尾；
3)、桶内温度保持在23±1℃，同时曝气供氧；使得养殖桶内水中氧气的含量为≥5.0mg/L；
每天，先同步进行以下两项工作：
3.1)、将3个直径6cm的培养皿放入养殖桶内的底部，10～12小时后拿出检查包囊数；
3.2)、更换循环过滤装置内的过滤棉，用清水将从循环过滤装置上取下的过滤棉上的污物洗至烧杯内(水的用量为过滤棉体积的2～3倍)，静置10～12小时(同步骤3.1的时间)，分别形成上清和沉淀，
然后再进行以下操作：
当培养皿内的包囊平均数≥20个包囊/皿时，将上清(烧杯中含有孵化出掠食体的上清水)倒回养殖桶内；即，过滤棉清洗下来的包囊不再回收，以控制多子小瓜虫的数量；
当培养皿内的包囊平均数＜20个包囊/皿时，将烧杯内的上清连同沉淀一起倒回养殖桶内。
说明：上清的量相对于养殖桶的水量微乎其微，可忽略不计。
一般感染24小时后即可在培养皿内肉眼发现多子小瓜虫的包囊，在健康草鱼体表粘液上检查到多子小瓜虫的滋养体。
4)、培养过程中每2天给草鱼喂食1次，饲料的投喂方式和投喂量按照常规的淡水鱼的饲料的投喂方式和投喂量。以饲料基本不被剩余为准。饲料选用蛋白含量为28％的草鱼市售商品饲料。
每天检测一次养殖桶内的水质，当养殖桶内的水氨氮>0.3mg/L或亚硝酸盐>0.05mg/L时，需更换桶养殖桶中10～20％体积量的水；
养殖桶内起始放入的水和每次更换时的用水为常规的淡水鱼养殖用水，更换新水时，是先将养殖桶内底部水排出，再将曝气调温(水中氧气的含量＞5.0mg/L，水温为23±1℃)后的新水直接加入养殖桶内；
按照上述换水处理后，能确保养殖桶内的水质满足要求；即，水质指标满足氨氮≤0.3mg/L且亚硝酸盐≤0.05mg/L，
按照本发明设定的方式，一般7-10天才需要进行一次部分的更换新水。
及时清理死亡的草鱼，病鱼死亡后从养殖桶内取出，原健康小草鱼死亡后，从养殖桶内取出，且补充相应数量的健康小草鱼(规格基本同被替代的死亡小草鱼的规格)，使得小草鱼的总数量保持不变，仍然为8尾。
且重复进行上述步骤3)，依次类推，进行多子小瓜虫传代保种培养。
传代保种培养期间内，培养皿中多子小瓜虫包囊数量如下表1所示。
实施例2、一种多子小瓜虫的传代保种培养方法，包括以下步骤：
步骤2)、多子小瓜虫感染，作如下更改：
将来自浙江的开化多子小瓜虫感染的新鲜的草鱼鳃丝(2尾规格约750～800g的感染多子小瓜虫严重的草鱼的鱼鳃)取下，用网袋悬挂并浸没在养殖桶内的水中，同时放养健康草鱼(规格420g)4尾，养殖水温维持在25±1℃，1～2天后从养殖桶内取走草鱼鳃丝；其他等同于实施例1。
传代保种培养期间内，培养皿中多子小瓜虫包囊数量如下表1所示。传代保种培养约110天后，检查发现培养皿仍有多子小瓜虫包囊。
对比例1、
将实施例1的3.2)作如下更改：无论培养皿内的包囊平均数是多少，过滤棉清洗下来的包囊均不再回收，即，仅仅将上清倒回养殖桶内。其余等同于实施例1。
试验进行了30天，每3天收集观察记录培养皿中的包囊数量。所得结果如表1所述。
表1、培养皿中多子小瓜虫包囊数量(个/皿)
以上表明，实施例1、实施例2多子小瓜虫传代保种培养多日后，仍可通过培养皿观察到包囊的产生，表明本发明的传代保种培养方法简单可行。实施例3培养皿观察17天后数量明显减少，传代27天已检测不到包囊。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1.多子小瓜虫的传代保种培养保种方法，其特征在于包括以下步骤：
1）、设置养殖系统：
养殖系统包括一个直径0.7±0.1m，高1±0.1m圆形的养殖桶，桶内蓄水高度0.5±0.1m，所述养殖桶配设增氧器、控温器及循环过滤装置，循环过滤装置内设有过滤棉和陶粒，养殖桶底部的水经过循环过滤装置后返回至养殖桶内；
2）、将感染有多子小瓜虫的草鱼病鱼1~2尾或1~5尾草鱼病鱼的鱼鳃置于养殖桶内，同时放入健康草鱼3~8尾进行感染；
3）、保持养殖桶内的水温为20~26℃的恒温，养殖桶内水氧气的含量为≥5.0mg/L；
每天，先同步进行以下两项工作：
3.1）、将3个直径6cm的培养皿放入养殖桶内，10~12小时后拿出检查包囊数；
3.2）、更换循环过滤装置内的过滤棉，用清水将从循环过滤装置上取下的过滤棉进行冲洗，所得的洗涤液于容器中静置后，分别形成上清和沉淀；静置时间同步骤3.1）设定的时间；
然后再进行以下操作：
当培养皿内的包囊平均数≥20个包囊/皿时，将上清倒回养殖桶内；
当培养皿内的包囊平均数＜20个包囊/皿时，将上清连同沉淀一起倒回养殖桶内；
4）、投喂饲料；
每天检测一次养殖桶内的水质，当养殖桶内的水氨氮>0.3mg/L或亚硝酸盐>0.05mg/L时，需更换桶养殖桶中10~20%体积量的水；
及时清理死亡的草鱼，原健康小草鱼死亡后，从养殖桶内取出，且补充相应数量的健康小草鱼，使得小草鱼的总数量保持不变；
当步骤2）中使用的是草鱼病鱼时，病鱼死亡后从养殖桶内取出；
当步骤2）中使用的是草鱼病鱼的鱼鳃时，从放入养殖桶内起的1~2天后从养殖桶内取出；
重复上述步骤3），进行多子小瓜虫传代保种培养。
2.根据权利要求1所述多子小瓜虫的传代保种培养保种方法，其特征在于：
所述循环过滤装置每小时的循环水量是养殖桶内水量的（100±10）%。
3.根据权利要求2所述多子小瓜虫的传代保种培养保种方法，其特征在于：
循环过滤装置包括循环水泵和过滤装置；
过滤装置包括一个底部为镂空层、长40cm×宽20cm×高20cm的箱体，在镂空层的上表面铺设10±1cm厚、直径2~5mm的陶粒，陶粒上面铺20±2mm厚的过滤棉；
所述过滤装置位于养殖桶的上方；循环水泵将养殖桶底部的养殖水打入过滤装置，经过滤棉和陶粒的过滤后回到养殖桶内。
4.根据权利要求3所述多子小瓜虫的传代保种培养保种方法，其特征在于：
养殖桶内上加盖板，所述盖板的作用是遮光及防鱼跳出。
5.根据权利要求4所述多子小瓜虫的传代保种培养保种方法，其特征在于：
饲料为蛋白含量为28%的草鱼饲料。
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