CN113349158A

CN113349158A - 一种小鼠抑郁症模型的构建方法

Info

Publication number: CN113349158A
Application number: CN202110764494.0A
Authority: CN
Inventors: 陆建峰; 曹立宁
Original assignee: Tongji University; Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Current assignee: Tongji University; Shanghai East Hospital Tongji University Affiliated East Hospital
Priority date: 2021-07-06
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2041-07-06
Also published as: CN113349158B

Abstract

本发明公开了一种小鼠抑郁症模型的构建方法，所述方法包括在小鼠中缝背核区域注射7‑10μg血清素神经元特异性神经毒剂。可以采用立体定位注射方法，将5,7‑DHT注射入小鼠的中缝背核，注射神经毒剂后30天可以获得稳定的抑郁症小鼠模型。本发明提供了大脑血清素含量降低的小鼠抑郁模型构建方法，该方法在保证动物高存活率和不影响运动功能的前提下，精准的去除小鼠大脑DRN区超过90％的血清素神经元；它模拟了临床抑郁症患者的血清素含量低下，有益于科学家探索抑郁症的发病机制，为不同类型抗抑郁症药物及治疗方案的筛选及评价提供了研究基础。

Description

一种小鼠抑郁症模型的构建方法

技术领域

本发明属于病理学实验领域，涉及一种小鼠抑郁症模型的构建方法，本发明还包括患有抑郁症的小鼠及其构建方法的应用。

背景技术

在城市化进程不断推进的今天，城市居民的生活水平不断提高，但是随之产生的教育、医疗、房价、就业、婚恋等问题反而使得城市人群的精神问题更加严重，越来越多的年轻人出现抑郁情绪，而近年来有关抑郁症自杀的报道层出不穷。世界卫生组织最新数据表明：中国约有5400万抑郁症患者；在中国，每年需要耗费78亿美元用于抑郁症导致的缺勤、医疗和丧葬费用。

抑郁症是以“三低”(情绪低落、思维迟缓、意志活动减退)为主要临床表现、并伴有自杀企图或行为的精神疾病。迄今为止，抑郁症的发病机制尚不明确，其发病主要与生物、心理与社会环境这三个因素有关：①生物学因素主要涉及遗传及神经内分泌等方面；②心理因素与病前性格特征(如抑郁气质)有关；③而环境因素与压力及成年期的应激性生活事件有关。因此，根据抑郁症发病机制的不同，建立相关的抑郁症模型，对于研究不同发病机制下抑郁症的治疗方案有非常重要的意义。

由于小鼠的解剖学结构、发育过程、生化代谢途径都与人类接近，因此小鼠成为了经典的抑郁症模型的模式生物。小鼠抑郁症模型主要分为以下几类：①应激造模：如通过强迫游泳或悬尾环境使得动物因“反复绝望”；孤养幼鼠模拟早年母爱剥夺；长期与“天敌动物”生存在一起；或长期慢性低水平剥夺水、食物以及生活空间等。上述应激事件都可以诱发小鼠抑郁行为的产生；但是应激抑郁模型的造模工作量大、时间长，一旦去除应激环境，抑郁行为也会随之消失。②解剖操作造模：嗅球切除用于模拟由慢性皮质酮治疗引发的抑郁症，但是实验中动物死亡率较高，对于实验技术要求高；大脑中动脉阻塞方法用于模拟临床卒中病人由于肢体瘫痪行动受限所导致的抑郁状态，但是模型动物运动受限会影响抑郁行为的评估；③药物造模：糖皮质激素、利血平、去甲肾上腺素可用于诱导抑郁，药物诱导模型的应用最为广泛，但却无法模拟还原人类抑郁症的自然发病过程；④遗传工程造模：目前用的比较经典的是Flinders sensitive rat line(FSL)大鼠模型和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠模型，小鼠转基因模型较少；转基因模型模拟了人类抑郁症的部分特征，具有一定的局限性。因此，急需能够更好模拟抑郁症的小鼠模型。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抑郁症小鼠模型的构建方法。

本发明要解决的另一个技术问题是提供上述构建方法的应用。

选择性血清素再摄取抑制剂(Selective Serotonin Reuptake Inhibitors,SSRIs)通过抑制突触前膜对血清素再摄取而增加突触间隙血清素浓度。众所周知，SSRIs作为临床上用于治疗抑郁症的一线药物主要是通过增加患者脑内的血清素含量而改善抑郁症状，这提示：抑郁症发病与脑内血清素含量降低有密切关系。大脑内的血清素主要由血清素神经元合成和分泌，而脑内85％以上的血清素神经元位于大脑的中缝背核(dorsalraphe nucleus，DRN)。因此本发明试图使用特异性神经毒剂损毁小鼠脑内中缝背核的血清素神经元，通过降低脑内血清素含量而建立抑郁症模型。

一方面，本发明提供了一种非治疗性目的的小鼠抑郁模型的构建方法，即在小鼠中缝背核区域注射7-10μg血清素神经元特异性神经毒剂。

在本发明的一个优选实施例中，血清素神经元特异性神经毒剂的用量为3μL，浓度为3μg/μL。

其中，损毁小鼠中缝背核区域的方法包括以下步骤：

(1)给小鼠头部剃毛，固定小鼠头部于立体定位仪上；

(2)对剃毛后的头部目标区域进行消毒；

(3)调整立体定位仪的Z轴调节臂，使其在AP方向调节至30度角，并锁定；

(4)调整前囟和后囟连线至水平，将数字读数仪上的坐标调零；

(5)将吸入血清素神经元特异性神经毒剂的微量注射器置于立体定位仪的持针臂，按照坐标AP＝-6.27mm调节持针臂，找到进针点，用脑颅骨高速钻头打孔，进针后缓缓打入血清素神经元特异性神经毒剂溶液；

(6)对小鼠消毒剃毛后的头部目标区域封闭后消毒，并进行麻醉后苏醒；

(7)注射血清素神经元特异性神经毒剂溶液后的两天内，每日颈部皮下注射镇痛药一次。

优选的，步骤(2)中，所述的头部目标区域是中缝背核。

优选的，步骤(2)中，鼠眼覆盖迪可罗眼膏用于保护小鼠角膜。

优选的，步骤(5)中，注射完毕后留针5分钟以防药液回渗。

优选的，所述的血清素神经元特异性神经毒剂的注射浓度为1-4μg/μl，或者注射量为每只小鼠6-10μg。

优选地,所述小鼠为C57/6N品系。

优选地，使用数显式小鼠立体定位仪(瑞沃德)辅助方法操作。

优选地，使用Hamilton微量注射器(注射器容量5ul，针头32g)作为注射器。

优选地，注射的药剂为血清素神经元特异性神经毒剂。例如，在本发明的一个优选实施例中，使用5,7-二羟色胺氢溴酸盐(5,7-dihydroxytryptamine，5,7-DHT)作为所述的神经元特异性神经毒剂。

DRN的位置刚好位于血供丰富的上矢状窦(superior sagittal sinus，SSS)的正下方，在预实验中本发明采用传统立体定位方法竖直进针导致上矢状窦损伤，最终导致大量出血甚至动物死亡；因此本发明采用在大脑前后轴方向以30度方向进针从而达到避开SSS到达DRN区的目的(如图1A,1B)。所述方法包括：采用立体定位注射方法，将血清素神经元特异性神经毒剂5,7-dihydroxytryptamine(5,7-DHT)(注射剂量和浓度：3ul，3ug/ul)打进小鼠的中缝背核(dorsal raphe nucleus，DRN)。而对于对照组小鼠，则采用同样的方法在DRN脑区注射等量的含0.2％VC的生理盐水(溶解5,7-DHT的溶剂即为含0.2％VC的生理盐水)。30天后可以获得稳定的抑郁症小鼠模型。

另一方面，本发明还提供了上述小鼠抑郁模型的构建方法的应用，将所述的构建方法用于制备小鼠抑郁模型。

优选的，所述的小鼠模型在评估治疗或者诊断抑郁的药物中的应用；或者用于抑郁发生、发展的病理或者临床指针的研究；或者治疗或者缓解抑郁的方法。

本发明提供了大脑血清素含量降低的小鼠抑郁模型的构建方法，该方法在保证动物高存活率和不影响运动功能的前提下，精准的去除小鼠大脑DRN区超过90％的血清素神经元；它模拟了临床抑郁症患者的病理机制，为不同类型抗抑郁症药物及治疗方案的筛选及评价提供了研究基础。

本发明的有益效果：建立了一种新型小鼠抑郁模型，为探索抑郁症的发病机制，为抑郁症治疗药物的筛选提供了研究工具。

附图说明

图1是本发明实施例的小鼠抑郁症模型的构建方法的实验装置示意图和确认针孔位置的组织切片图。

图2是本发明实施例的抑郁症小鼠的体重变化图。

图3是本发明实施例的抑郁症小鼠的悬尾实验结果示意图。

图4是本发明实施例的抑郁症小鼠的强迫游泳结果示意图。

图5是本发明实施例的抑郁症小鼠的旷场实验结果示意图。

图6是本发明实施例的抑郁症小鼠的脑组织病理切片图。

图7是本发明构建模型时强迫游泳实验和悬尾实验的对比实验结果图。

具体实施方式

下面结合附图详细介绍本发明技术方案。

实验动物：

32只成年雄性C57BL/6N小鼠(8周龄左右,初始体重20.5±0.6g)饲养于同济大学沪北动物实验中心(SPF级)饲养一周后，随机分为实验组和对照组，每组16只。

药物准备：

1.地昔帕明盐酸盐(desipramine hydrochloride)溶液配制：用生理盐水配制2.5mg/mL的地昔帕明盐酸盐溶液。

2.抗坏血酸(ascorbic acid，维生素C)溶液配制：将0.2g抗坏血酸用100ml生理盐水溶解，得到0.2％的抗坏血酸溶液。

3.酮洛芬(ketoprofen)溶液配制：将250mg酮洛芬溶解于15mL水,1mL的1M氢氧化钠,调整pH到7.3,增加终容积到125mL,得到2mg/mL浓度的酮洛芬溶液.

4.5,7-DHT溶液配制：将5mg的5,7-DHT溶解于1.67ml抗坏血酸溶液，得到3ug/uL的5,7-DHT溶液。(5,7-DHT溶于抗坏血酸溶液而非普通生理盐水的原因：5,7-DHT在空气中极易被氧化，如果直接溶解于生理盐水会立刻氧化变性失效，而抗坏血酸具有抗氧化的作用)

注：以下步骤需在冰上操作：上述药物配制好后，用0.22μm孔径的针头式滤器(hydrophilic PES membrane)过滤除菌后，用1.5ml的离心管分装，冻存于-80冰箱，使用时按需求量取出使用，使用中间暂存于干冰盒，使用后丢弃残液，不可反复冻融和重复使用。用该法可以保存药剂溶液1年。

操作前准备，镇痛和麻醉:

1.铝制饭盒(含剪刀、持针器、3-0带针缝线、耳标器、耳标)高温高压消毒。准备75％酒精、碘伏、3％双氧水、棉花棒、迪可罗眼膏、加热垫、无菌的一次性1ml注射器、带32G针头的Hamilton 5uL微量注射器(75％酒精浸泡消毒，忌高温高压消毒)。

2.操作前1小时给小鼠腹腔注射地昔帕明盐酸盐溶液。使用浓度为25mg/kg：即每1g体重给予10ul药量。使用该药的目的是保护其他儿茶酚胺能神经元不受损伤。

3.操作前镇痛：颈部皮下注射酮洛芬溶液(每1g体重给予2.5uL药液)。

4.麻醉：应用便携式小动物麻醉机，吸入异氟烷进行麻醉(诱导麻醉浓度：3％，维持麻醉状态的浓度：1.5％，流量：2L/min)。

实施例1构建抑郁小鼠模型

1.给小鼠头部剃毛，固定小鼠于立体定位仪的操作台上。

2.用棉棒依次蘸取75％酒精和碘伏，对剃毛后的头部目标区域进行消毒。鼠眼覆盖迪可罗眼膏用于保护小鼠角膜。

3.解锁立体定位仪的Z轴调节臂，将其在AP(anterior-posterior)方向调节至30度角(如图1A,B)，锁定。

4.调整前囟和后囟连线至水平。将数字读数仪上的坐标调零。

5.将吸入3ul 5,7-DHT的Hamilton微量注射器置于立体定位仪的持针臂，按照坐标(AP：-6.27mm)调节持针臂，找到进针点，用记号笔进行标记后，用颅骨高速钻头打孔，进针(DV＝-4.04mm)后缓缓打入5,7-DHT溶液(0.5μL/3min)，注射完毕后留针5分钟以防药液回渗。

对于对照组小鼠，则采用同样的方法在DRN脑区注射等量的含0.2％VC的生理盐水(溶解5,7-DHT的溶剂即为含0.2％VC的生理盐水)。

6.缝合伤口后，碘伏消毒涉及区域2次，给小鼠打耳标，置于带加热垫的鼠笼进行麻醉后苏醒。苏醒后放回鼠笼，给予果冻。注射后两天，每日颈部皮下注射镇痛药酮洛芬一次。

7.待处理组和对照组小鼠休养一周后，检测指标。

注：实验组的其中3只小鼠在操作结束后立刻灌注取脑，经固定脱水后进行冰冻切片和HE染色，从而确定针孔的脑内位置。小鼠大脑立体定位图谱显示：DRN区正好位于大脑导水管(aqueduct，Aq)的下方，而从图1C的组织切片图看出：经过30度斜角入针，坐标(AP_f：-6.27mm，DV_f：-4.04mm，f代表final，即30度斜角换算纠正过后的最终坐标)，留下的针孔位于Aq下方(如图1C)，即神经毒剂可以精准到达DRN区。行为学和体重检测均在注射神经毒剂后30天进行。

实施例2：小鼠体重监测

对于实施例1的方法处理过的小鼠进行生长状况检测。

处理后30天对实验组和对照组这两组小鼠进行体重测量，体重变化如图2所示。

可以看出，两组小鼠在注射后30天时，体重呈现显著性差异(对照组：28.8±1.4vs.实验组：27.1±1.5g；P<0.05),实验组小鼠体重明显低于对照组。

实施例3：悬尾实验

悬尾实验是常用的动物抑郁行为的检测方法。当动物处于不可回避的压迫环境(悬尾或强迫游泳)，不断挣扎却又不能逃脱，从而出现间断性的“不动状态”，这是一种典型的与抑郁症类似的绝望状态，因此用“不动时间”来评估抑郁行为，不动时间与抑郁行为呈正相关。将小鼠尾巴3/4处悬挂于固定装置上(如图3A所示)，打开白噪音器(降低其他声音对小鼠造成的行为学影响)，在前方水平位置放置摄像头，拍摄6分10秒的视频。分析时，在视频的前6分钟，用计时器记录小鼠“不动”的总时间。实验结果表明(如图3B)，实验组小鼠在悬尾实验中的不动时间显著长于对照组小鼠的不动时间(对照组：142.9±58.9vs.实验组：230.5±53.7；P<0.05)，这说明实验组小鼠出现抑郁行为。

实施例4：强迫游泳实验

强迫游泳实验是常用的动物抑郁行为的检测方法。其原理同上述“悬尾实验”，也是通过造成无法逃脱的压迫环境而诱发动物的抑郁行为。如图准备好实验装置(如图4A,玻璃水缸尺寸：30cm高x 20cm直径，水面高度：15cm，水温：23-25℃，水缸之间用隔板隔开而降低小鼠互相之间的视觉行为影响)，打开白噪音器，在前方水平位置放置摄像头，拍摄6分10秒。分析从第2分钟开始到第6分钟结束的视频，采用计时器人工记录小鼠不动时间。实验结果表明(如图4B)，实验组小鼠在强迫游泳实验中的不动时间显著长于对照组小鼠的不动时间(对照组：124.8±46.9vs.实验组：168.7±22.01；P<0.05)，这说明实验组小鼠出现抑郁行为。

实施例5：旷场实验

由于脑部注射可能会导致小动物的运动功能下降，从而无法判定动物在不可逃脱的压迫环境中(悬尾或强迫游泳)出现的运动减少是抑郁行为导致还是方法引起运动神经损伤而出现的运动减少。因此，本发明采用旷场实验(如图5A,尺寸为40cm*40cm*20cm高的4个方格旷场同时进行实验)，让小鼠在旷场中自由探索10分钟，采用Smart软件采集分析10分钟内两组小鼠运动的总路程和运动轨迹。实验结果表明(如图5B,C)，两组小鼠在旷场中运动10分钟的运动轨迹(如图5B)和总距离(如图5C)没有显著性差异(对照组：2087±225.9vs.实验组：2180±282.3),这说明实验组小鼠的运动能力较对照组小鼠没有显著性差异，再次肯定了实验组小鼠在强迫游泳和悬尾实验中的运动减少是由抑郁导致的，而非本发明的方法造成的运动能力下降。

实施例6：小鼠大脑DRN区的血清素神经元细胞计数

在行为学实验结束后，即注射后约45天，对小鼠进行心脏灌注4％PFA以固定脑组织，取脑组织后进行4％PFA再次固定过夜，30％蔗糖脱水2天，冰冻切片及色氨酸羟化酶-2(TPH2)免疫荧光染色。TPH2是血清素神经元特有的用于合成血清素的关键限速酶，它是血清素神经元特异性的标志物。

如图6A，本发明做了小鼠大脑的冠状切片，每组的三张切片取自前囟后4.2-4.6mm的脑组织(DRN区)，切片厚度为30μm，每4片中取一片切片用于染色(默认30μm厚度的连续4片脑组织的形态结构基本一致，即：120μm厚度之内的脑组织结构基本一致)。如图6A-B结果显示，实验组的血清素神经元细胞数量明显少于对照组细胞数；本发明随后对16只小鼠(8只实验组，8只对照组)的脑组织进行分析发现，两组小鼠大脑DRN区的血清素神经元数量呈现显著性差异(图6C，实验组：1255±241；对照组：139±82；P<0.01)。

实施例7：对比实验结果

按照实施例4和5的方法，在小鼠脑部注射2μL(3μg/μL)的5,7-DHT溶液,进行强迫游泳实验和悬尾实验。以等剂量的维生素C为参照。

结果如图7所示，注射VC的对照组和注射2μL的损伤组的动物在强迫游泳实验和悬尾实验的表现上没有显著差异。该实验结果表明，注射神经毒素的有效剂量与本模型的构建成功密切相关。

本发明首先对上述实验数据进行Kolmogorov Smirnov正态分布检验，对正态分布的数据采用T检验，对于非正态分布的数据采用Mann-Whitney U检验，显著性差异由P值表示(**P<0.01,*P<0.05)。

综合以上实验结果可以看出，经过立体定位方法精准去除小鼠大脑DRN区的血清素神经元(细胞死亡率接近90％)后，实验组小鼠在行为上表现出明显的抑郁表型(分别在悬尾实验和强迫游泳实验中，表现出不动时间显著增加)，上述结果说明依据本方法，能够成功获得抑郁症小鼠模型。

应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，在小鼠中缝背核区域注射7-10μg血清素神经元特异性神经毒剂。

2.根据权利要求1所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，血清素神经元特异性神经毒剂的用量为3μL，浓度为3μg/μL。

3.根据权利要求1所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，确定小鼠中缝背核区域的方法，包括以下步骤：

S1，固定小鼠头部于立体定位仪上；根据权利要求1所述的小鼠抑郁模型的构建方法，

S2，调整立体定位仪的Z轴调节臂，使其在AP方向调节至30度角，并锁定；

S3，调整前囟和后囟连线至水平，将数字读数仪上的坐标调零；

S4，按照坐标AP＝-6.27mm调节持针臂，进针点即中缝背核。

4.根据权利要求3所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将微量注射器置于立体定位仪的持针臂、垂直插入进针的步骤。

5.根据权利要求1所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

(1)给小鼠头部剃毛，固定小鼠头部于立体定位仪上；

(2)对剃毛后的头部目标区域进行消毒；

(5)将吸入血清素神经元特异性神经毒剂的微量注射器置于立体定位仪的持针臂，按照坐标AP＝-6.27mm调节持针臂，找到进针点，用颅骨高速钻头打孔，进针后缓慢注射血清素神经元特异性神经毒剂溶液；

(6)创面缝合后，对小鼠剃毛的头部目标区域消毒，并进行麻醉后苏醒；

6.根据权利要求5所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，鼠眼覆盖迪可罗眼膏用于保护小鼠角膜。

7.根据权利要求5所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中，注射完毕后留针5分钟以防药液回渗。

8.根据权利要求5所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠为C57BL/6N品系。

9.根据权利要求5所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，采用数显式小鼠立体定位仪进行小鼠头部的固定和头部目标区域的确定。

10.根据权利要求5所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，采用微量注射器进行药物注射。

11.根据权利要求10所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，采用的微量注射器的型号为注射器容量5μl，针头32g。

12.根据权利要求1-11中任意一项所述的小鼠抑郁模型的构建方法，其特征在于，注射的药物为血清素神经元特异性神经毒剂5,7-二羟色胺氢溴酸盐。

13.权利要求1-11任意一项所述小鼠抑郁模型的构建方法的应用，其特征在于，将所述的构建方法用于制备小鼠抑郁模型。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，

所述的小鼠模型在制备治疗抑郁治疗药物中的应用；或者

用于抑郁发生、发展的病因及病理机制的研究；或者

所述的小鼠模型在制备缓解抑郁治疗药物中的中应用。