CN113349058B - 一种濒危植物笔筒树繁殖技术及野外回归方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种濒危植物笔筒树繁殖技术及野外回归方法，基于笔筒树孢子繁殖困难，孢子对基质保水性，透气性及养分供应要求苛刻等技术问题，本发明通过长期不断的优化消毒方案，同时改变培养基质，探索培养皿内放置无菌滤纸，调控笔筒树孢子生长条件，达到加速孢子到配子期的繁育效果。同时，通过移栽后的精准控制，配合专用设备，形成笔筒树稳定的繁育体系，有效解决了笔筒树繁育技术问题。

Description

一种濒危植物笔筒树繁殖技术及野外回归方法
技术领域
本申请涉及植物保护领域，尤其是涉及一种应用于濒危植物笔筒树的繁育方法及专用设备。
背景技术
濒危植物，是指由于环境的变化而面临绝种危机的植物，植物研究者称，物种的绝灭和新物种的形成是一个自然的演化过程，由于地球环境的变迁，一些物种无法适应新的环境而灭绝，同时形成一些适应新环境的新物种，植物的生存作为生物多样性、生态系统中不可或缺的环节，却一直受制于内忧外患的压力，无声无息中，大批植物正走向濒危的状态，植物濒危的原因非常复杂，其人类的不当活动以及气候变化和外来入侵物种的蔓延等外部因素却是植物物种走向濒危之路的主要原因。
其中笔筒树就是其中的一种，笔筒树(Sphaeropteris lepifera)为桫椤科(Cyatheaceae)白桫椤属(Sphaeropteris)的树蕨类植物，树干修长，树冠如伞，叶痕大而密，是稀有的树蕨类植物。保护笔筒树的方式有进行新的培育，以增加笔筒树的数量，
CN111096173A公开了一种笔筒树的人工繁育方法，基于笔筒树孢子繁殖困难，孢子对基质保水性，透气性及养分供应要求苛刻等技术问题，本发明通过开展不同采摘时期、播种方式、移栽时机、基质类型等因子调控，初步构建笔筒树孢子繁育体系。但该方法中的孢子繁殖较为困难，生长成为配子体的时间较长。
在外植体消毒过程中，消毒时间十分关键，消毒时间的延长提高消毒效果，但会降低外植体生命力。CN110786243A公开了一种笔筒树组织培养繁殖方法，具体将笔筒树卷拳叶诱导转接到GGB培养基，再通过增值培养、分化培养得到笔筒树幼苗。该方法经过长时间组织培养，外植体消毒极易使得笔筒树受污染，且影响其生命力，该培养方法的成活率较低，无法形成大量的繁殖体系。事实上，我们发现笔筒树卷拳叶和其他部位叶的组培繁殖遇到瓶颈，污染严重，长期“污染”的问题不能被攻破，不容易形成稳定的培养体系。
同时，笔筒树移栽后的生长同样受环境影响较大，温度过高或过低均影响其生长，目前仅对笔筒树的繁育方法做了研究，针对繁育移栽后的幼苗保护措施，尤其适用于濒危植物保护的措施缺乏全面系统性的研究。因此，亟需构建一种稳定的笔筒树繁殖技术及专用濒危植物保护措施。
发明内容
针对以上技术问题，我们接种孢子至萌发培养基，通过长期不断的优化消毒方案，同时改变培养基质，探索培养皿内放置无菌滤纸，调控笔筒树孢子生长条件，达到加速孢子到配子期的繁育效果。同时，通过移栽后的精准控制，配合专用设备，形成笔筒树稳定的繁育体系，有效解决了笔筒树繁育技术问题。
本发明提供一种笔筒树繁殖技术，具体包括如下步骤：
(1)消毒处理：采用新鲜孢子作为繁殖材料，将收集到的成熟孢子无菌水浸泡24h，过滤，再将孢子放入1.5ml离心管，加入1ml无菌水，放入离心机，2500-3000r/min转速离心2-3min，去除上清液，再次在离心管内滴入15％-25％次氯酸钠与10-15％双氧水溶液按3:1的体积比混合的溶液1ml，静置灭菌4min，并使用无菌水冲洗笔筒树孢子3次，得到无菌的笔筒树孢子悬浊液；
(2)接种孢子：将消毒过后的孢子悬浊液接种至萌发培养基表面，所述萌发培养基：下层脱脂棉，中间放1/4MS液体培养基，上层含无菌水的滤纸覆盖整个培养皿保湿；
(3)孢子生长：将培养皿先于黑暗环境下放置24h，再取出放入温度为25℃，湿度80％的人工气候箱中进行培养，光照度为60μmolm-2s-1，时间12h/d，30-40d大量长成配子体；
(4)配子生长：随后将上述长成配子体的笔筒树绿色组织接种至玻璃瓶中，瓶中的培养基为MS固体培养基+1-2mg/L 6BA+0.2-0.5mg/L NAA，于人工气候箱增殖并诱导生根培养，25℃，湿度80％，光照度为100μmolm-2s-1，光照16h/d，培养30-40d诱导出生根幼苗；
(5)将生根幼苗移到装有灭菌基质的容器中，基质为2-3mm细泥炭，温室中80％遮荫度炼苗，25℃，光照16h，培养30d左右，长成壮苗，随后移栽。
本发明还提供一种笔筒树人工繁殖、移栽及野外回归方法，具体包括如下步骤：
(1)消毒处理：采用新鲜孢子作为繁殖材料，将收集到的成熟孢子无菌水浸泡24h，过滤，再将孢子放入1.5ml离心管，加入1ml无菌水，放入离心机，2500-3000r/min转速离心2-3min，去除上清液，再次在离心管内滴入15％-25％次氯酸钠与10-15％双氧水溶液按3:1的体积比混合的溶液1ml，静置灭菌4min，并使用无菌水冲洗笔筒树孢子3次，得到无菌的笔筒树孢子悬浊液；
(2)接种孢子：将消毒过后的孢子悬浊液接种至萌发培养基表面，所述萌发培养基：下层脱脂棉，中间放1/4MS液体培养基，上层含无菌水的滤纸覆盖整个培养皿保湿；
(3)孢子生长：将培养皿先于黑暗环境下放置24h，再取出放入温度为25℃，湿度80％的人工气候箱中进行培养，光照度为60μmolm-2s-1，时间12h/d，30-40d大量长成配子体；
(4)配子生长：随后将上述长成配子体的笔筒树绿色组织接种至玻璃瓶中，瓶中的培养基为MS固体培养基+1-2mg/L 6BA+0.2-0.5mg/L NAA，于人工气候箱增殖并诱导生根培养，25℃，湿度80％，光照度为100μmolm-2s-1，光照16h/d，培养30-40d诱导出生根幼苗；
(5)将生根幼苗移到装有灭菌基质的容器中，基质为2-3mm细泥炭，温室中80％遮荫度炼苗，25℃，光照16h，培养30d左右，长成壮苗，随后移栽；
(6)移栽基质：泥炭、珍珠岩和蛭石，体积比为3：1：1，基质有机质含量为275.60g/kg，速效磷含量为0.052g/kg，速效钾含量为0.23g/kg，速效氮含量为0.35g/kg，容重为0.23g/cm3，最大持水量为373.7％；
(7)移栽后的管理措施：采用本发明的濒危植物培育用高温防护装置调整遮荫度为75％，生长2-3个月后，接受正常自然光生长；
(8)野外回归种植：笔筒树1-2年生苗可实现野外回归种植，设置温湿光监测仪，定期监测记录幼苗野外回归后的环境状况及生长发育状况，夏季高温超过30℃，需要遮荫防护，冬季温度低于0℃，需要透明保温膜防护，具体使用濒危植物笔筒树的培育用防护装置。
进一步的，上述濒危植物笔筒树的培育用防护装置包括基板，濒危植物培育用防护装置基板的表面活动安装有多个支撑龙骨，濒危植物培育用防护装置支撑龙骨的一端设置有定位锚杆，濒危植物培育用防护装置基板的表面盖合有限制罩盖，多个支撑龙骨的表面固定安装有防护布，濒危植物培育用防护装置支撑龙骨包括活动安装在基板上的长管，濒危植物笔筒树的培育用防护装置长管的一侧开设有活动腔，濒危植物培育用防护装置活动腔的内部滑动安装有长杆，濒危植物培育用防护装置长管一侧的一端贯穿设置有定位螺丝，濒危植物培育用防护装置定位螺丝的一端插入到长杆的内部，濒危植物培育用防护装置定位锚杆设置在长杆位于长管外侧的一端。
通过采用上述技术方案，通过在实际使用时，夏季高温超过30℃，将整个防护装置罩在笔筒树幼苗上，然后防护布能够遮挡阳光直射，从而降低水分流失的速度，再配合人工浇灌，便能够使得笔筒树幼苗生长；冬季温度低于0℃，换成透明保温膜防护。
进一步的，防护装置限制罩盖顶部的内壁上固定安装有多个限制插销，濒危植物培育用防护装置基板的顶部开设有多个与限制插销相适配的限制插孔。
进一步的防护装置长管一侧的一端开设有与定位螺丝相适配的通孔，濒危植物培育用防护装置长杆的表面开设有多个与定位螺丝相适配的定位孔。
进一步的，防护装置定位锚杆包括焊接在长杆表面尾端的螺纹管，濒危植物培育用防护装置螺纹管的内部设置有螺纹杆，濒危植物培育用防护装置螺纹杆的一端焊接有拧动块。
进一步的，防护装置螺纹杆是由螺纹端和圆锥端焊接组成的，濒危植物培育用防护装置螺纹端的一端焊接在拧动块上，濒危植物培育用防护装置圆锥端的圆端焊接在螺纹端上。
进一步的，防护装置螺纹管的内壁上设置有与螺纹端相适配的内螺纹。
进一步的，濒危植物培育用防护装置防护布的表面开设有密集分布的通孔，通孔的孔径为0.5mm。
进一步的，防护装置基板的外径与限制罩盖的内径相适配。
进一步的，所述防护布夏季可以为遮荫网、遮荫网，冬季可以替换为透明保温膜。
本发明的有益效果：
1.本发明通过优化笔筒树各个生长期的生长环境条件，形成稳定的繁育体系，且该笔筒树繁育方法可使形成配子体的时间大大缩短，人工气候箱是最佳繁育环境，可实现温、湿、光可控，杂菌、藻类污染和杂草较少。
2.本发明以生产中常用的肥料为试验材料，选用进口泥炭、珍珠岩与蛭石(3：1：1)轻型育苗基质，有机质含量为275.60g/kg，速效磷含量为0.052g/kg，速效钾含量为0.23g/kg，速效氮含量为0.35g/kg，容重为0.23g/cm3，最大持水量为373.7％，该基质配合了有机颗粒肥，对笔筒树容器苗生长及生理抗性指标的提升促进作用优异，为笔筒树容器育苗的产业发展提供理论依据和技术指导。
3.传统播种催芽到配子体长成需要1.5个月左右，该快繁方法大大缩短了笔筒树的育苗时间。本发明的无菌繁育方法，大大缩短了育苗时间，提高了笔筒树的成活率，促进其快速生长。且通过孢子繁殖可大大缩短无性繁育周期，笔筒树外植体组培时间较长，增殖和分化阶段需要2个月左右，而本发明的无菌繁育方法可从孢子体直接到配子体，从而使配子体之间在无菌条件下(相当于土壤)进行精子和受精卵的结合形成小苗。本发明的无菌繁育方法，比传统笔筒树催芽育苗到配子体缩短半个月左右，且比从外植体繁殖(多了体细胞分化)缩短2个月，成活率均比上述两种繁育方法高。
4.笔筒树外植体消毒过程中，消毒时间十分关键，消毒时间的延长提高消毒效果，但会降低外植体生命力，我们通过反复的对比，得出消毒笔筒树孢子的成活率最高，消毒处理：无菌水2500r/min转离心3min，再用15％NaClO+10％双氧水3:1的污染率可以达到0％，次氯酸钠和双氧水组合的消毒时间较短，对笔筒树孢子的伤害较小，组合后可从短时间消毒得到较低污染率的孢子，且组合后的效果比单一使用其中一种消毒剂的效果更优。
5.笔筒树的新鲜孢子在液体培养基1/4MS(下层脱脂棉，中间放液体培养基，上层含无菌水的滤纸覆盖整个培养皿保湿，这样的萌发效果更好)的培养基条件下萌发率高达99％以上，且形成大量配子体的时间大大缩短，30天左右即可完成该阶段的生长。通过观测生长状况我们同样发现，过早施用激素的培养基，笔筒树繁殖的配子体生长势较弱，分布没有单一使用1/4MS后的长势强。
6.我们通过大量的试验对比，摸索出配子体增殖期的最佳培养基为：MS+1-2mg/L6BA+0.2-0.5mg/L NAA，该组合后的孢子体增殖率最高，且缩短了诱导生根幼苗时间。
7.光照强度和光照时间对笔筒树的组培苗繁殖周期影响较大，前期孢子生长期间，光照度为60μmolm-2s-1，时间12h/d可显著缩短了形成配子体的周期；而后面配子体的生长期间，通过调整光强和时间，即100μmolm-2s-1，时间16h/d，诱导出生根幼苗可缩短到30天左右。通过优化光强条件，与传统笔筒树育苗繁殖相比，形成配子体可缩短10-14d。
8.不同肥料处理下笔筒树生物量变化较大，其中有机肥配合基质：泥炭、珍珠岩和蛭石，体积比例分别为3：1：1，有机质含量为275.60(g/kg)，速效磷含量为0.052g/kg，速效钾含量为0.23g/kg，速效氮含量为0.35g/kg，容重为0.23g/cm3，最大持水量为373.7％，促进了笔筒树生物量的显著增加，提高了叶绿素a与叶绿素b和类胡萝卜素含量。
9.本发明还进一步研究了移栽后笔筒树幼苗长至1-2年生苗的野外回归种植防护方法，该防护装置在夏季结合遮荫网可降低水分流失的速度，解决了濒危植物笔筒树幼苗在野外高温环境下，容易受到高温的破坏，导致幼苗的水分快速流失，又不能够得到及时的补充，从而致使幼苗枯萎，难以存活的问题。冬季该防护装置还可配合透明保温膜，罩在笔筒树幼苗上的，起到夜间防低温冻害的作用。
附图说明
图1笔筒树组织培养
图2笔筒树组织培养
图3笔筒树配子体
图4笔筒树幼苗
图5不同遮荫网下的光照强度的日变化图
图6不同光照强度下笔筒树叶片的叶绿素含量变化
图7不同光照强度下笔筒树叶片的净光合速率的变化
图8不同光照强度下笔筒树叶绿体的超微结构
图9不同肥料处理下笔筒树叶片的叶绿素含量变化
图10笔筒树野外移栽后遮荫防护处理
图11笔筒树野外移栽后防低温冻害防护处理
图12是防护装置结构示意图。
图13是防护装置局部结构立体分解图。
图14是防护装置局部结构仰视立体分解图。
图15是防护装置定位锚杆立体装配图。
图16是防护装置螺纹杆立体图。
附图标记说明：1、基板；2、支撑龙骨；3、定位锚杆；4、限制罩盖；5、限制插孔；6、限制插销；7、遮荫网；21、长管；22、长杆；23、活动腔；24、定位螺丝；25、定位孔；26、通孔；31、螺纹管；32、螺纹杆；33、拧动块；34、内螺纹；321、螺纹端；322、圆锥端。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例1
一种笔筒树繁殖技术，具体包括如下步骤：
(1)消毒处理：采用新鲜孢子作为繁殖材料，将收集到的成熟孢子无菌水浸泡24h，过滤，再将孢子放入1.5ml离心管，加入1ml无菌水，放入离心机，2500r/min转速离心3min，去除上清液，再次在离心管内滴入15％次氯酸钠与10％双氧水溶液按3:1的体积比混合的溶液1ml，静置灭菌4min，并使用无菌水冲洗笔筒树孢子3次，得到无菌的笔筒树孢子悬浊液；
(2)接种孢子：将消毒过后的孢子悬浊液接种至萌发培养基表面，所述萌发培养基：下层脱脂棉，中间放1/4MS液体培养基，上层含无菌水的滤纸覆盖整个培养皿保湿；
(3)孢子生长：将培养皿先于黑暗环境下放置24h，再取出放入温度为25℃，湿度80％的人工气候箱中进行培养，光照度为60μmolm-2s-1，时间12h/d；
(4)配子生长：随后将上述长成配子体的笔筒树绿色组织接种至玻璃瓶中，瓶中的培养基为MS固体培养基+1mg/L 6BA+0.5mg/L NAA，于人工气候箱增殖并诱导生根培养，25℃，湿度80％，光照度为100μmolm-2s-1，光照16h/d；
(5)将生根幼苗移到装有灭菌基质的容器中，基质为2-3mm细泥炭，温室中炼苗，25℃，光照16h/d，培养30d左右，长出幼苗，随后移栽。
实施例2
一种笔筒树移栽技术，其中，移栽基质：泥炭、珍珠岩和蛭石，体积比为3：1：1，有机质含量为275.60g/kg，速效磷含量为0.052g/kg，速效钾含量为0.23g/kg，速效氮含量为0.35g/kg，容重为0.23g/cm3，最大持水量为373.7％；
移栽后的管理措施：75％的遮荫度下生长2-3个月后，接受正常自然光生长。
实施例3
一种笔筒树移栽技术及野外回归种植方法，其中，移栽基质：泥炭、珍珠岩和蛭石，体积比为3：1：1，有机质含量为275.60g/kg，速效磷含量为0.052g/kg，速效钾含量为0.23g/kg，速效氮含量为0.35g/kg，容重为0.23g/cm3，最大持水量为373.7％；
移栽后的管理措施：75％的遮荫度下生长2-3个月后，接受正常自然光生长，遮荫时需配合使用本发明的濒危植物培育用高温防护装置。
当笔筒树长至1-2年生时，实现野外回归种植，设置温湿光监测仪，定期监测记录幼苗野外回归后的环境状况及生长发育状况，夏季高温超过30℃，需要遮荫防护，冬季温度低于0℃，需要透明保温膜防护，具体使用濒危植物培育用防护装置。
结合图12和图16，本申请公开濒危植物培育用高温防护装置，包括基板1，基板1的表面活动安装有多个支撑龙骨2，支撑龙骨2的一端设置有定位锚杆3，基板1的表面盖合有限制罩盖4，多个支撑龙骨2的表面固定安装有遮荫网7，支撑龙骨2包括活动安装在基板1上的长管21，长管21的一侧开设有活动腔23，活动腔23的内部滑动安装有长杆22，长管21一侧的一端贯穿设置有定位螺丝24，定位螺丝24的一端插入到长杆22的内部，定位锚杆3设置在长杆22位于长管21外侧的一端，长管21一侧的一端开设有与定位螺丝24相适配的通孔26，长杆22的表面开设有多个与定位螺丝24相适配的定位孔25，定位锚杆3包括焊接在长杆22表面尾端的螺纹管31，螺纹管31的内部设置有螺纹杆32，螺纹杆32的一端焊接有拧动块33，螺纹杆32是由螺纹端321和圆锥端322焊接组成的，螺纹端321的一端焊接在拧动块33上，圆锥端322的圆端焊接在螺纹端321上，螺纹管31的内壁上设置有与螺纹端321相适配的内螺纹34，遮荫网7的表面开设有密集分布的通孔，通孔的孔径为零点五毫米，基板1的外径与限制罩盖4的内径相适配。
在实际使用时，使用者将多个支撑龙骨2向外侧展开合适的角度，然后转动拧动块33，拧动块33带动螺纹杆32转动，螺纹杆32在螺纹管31的内腔活动，并且在内螺纹34的配合下，整个螺纹杆32便会从螺纹管31的一端伸出，当拧动块33会螺纹管31接触时，停止转动，然后将整个螺纹杆32插入到地面内，如此便能够将整个防护装置罩在笔筒树幼苗上，其中还可以根据幼苗生长的实际情况进行调整，调整时，使用者拧松取下定位螺丝24，然后将长杆22向外侧拉动，如此便能够延长长管21的长度，从而便可以调整防护装置的高度以及内部空间的尺寸，满足使用需求，然后遮荫网7便能够遮挡阳光直射，从而降低水分流失的速度，再配合人工浇灌，便能够使得笔筒树幼苗生长。
限制罩盖4顶部的内壁上固定安装有多个限制插销6，基板1的顶部开设有多个与限制插销6相适配的限制插孔5。
在实际使用时，当多个支撑龙骨2全部展开后，将限制罩盖4盖合在基板1上，然后保证限制插销6插入到限制插销6中，如此便能够将多个支撑龙骨2定位合适的位置，保证支撑龙骨2不会回缩，从而保证防护装置的稳定性。
试验一：不同消毒处理对笔筒树种子萌发生长的影响
试验方法：此试验是经过不断摸索得出的适宜笔筒树种子繁殖的消毒处理方法，采用不同浓度和种类的消毒剂、通过调整处理时间，以及和离心处理相结合，得出各消毒方式对于笔筒树外植体或种子的污染率的影响。每个处理20个，重复3次。温度为25℃，湿度80％的人工气候箱中进行培养，光照度为60μmolm-2s-1，时间12h/d。
表1不同消毒处理的灭菌效果对比
Figure BDA0003161914990000091
Figure BDA0003161914990000101
试验结果：笔筒树外植体消毒过程中，消毒时间十分关键，消毒时间的延长提高消毒效果，但会降低外植体生命力，我们通过反复的对比，得出消毒笔筒树孢子的成活率最高，而外植体消毒极易使得笔筒树受污染，且影响其生命力，该培养方法的成活率较低，无法形成大量的繁殖体系。事实上，我们发现笔筒树卷拳叶和其他部位叶的组培繁殖遇到瓶颈，污染严重，长期“污染”的问题不能被攻破，不容易形成稳定的培养体系。
实验例14的消毒处理：无菌水2500r/min转离心3min，再用15％NaClO+10％双氧水3:1的污染率可以达到0，且比同时进行离心消毒(实验例17)的效果最优，且该处理时间和消毒剂浓度对孢子的伤害最小，从而达到85.7％的成活率。随着次氯酸钠和双氧水的浓度越高、离心转速越高、消毒时间越长，孢子的成活率会随之降低。次氯酸钠和双氧水组合的消毒时间较短，对笔筒树孢子的伤害较小，组合后可从短时间消毒得到较低污染率的孢子，且组合后的效果比单一使用其中一种消毒剂的效果更优。
试验二：培养基配方、培养方式等对笔筒树繁殖的影响。
试验方法：采用新鲜孢子作为繁殖材料，将收集到的成熟孢子消毒后，进行萌发试验，具体将消毒过后的孢子接种至萌发培养基表面。研究不同培养基条件对笔筒树新鲜孢子的萌发率以及形成配子体的影响。每个处理20个，重复3次。其中实验例18-28均为液体培养基，即下层脱脂棉，中间放液体培养基，上层含无菌水的滤纸覆盖整个培养皿保湿。其中培养基：琼脂1L液体培养基加7g琼脂；组培方法同实施例1，试验中保持：温度为25℃，湿度80％的人工气候箱中进行培养，光照度为60μmolm-2s-1，时间12h/d。
表2不同培养基对笔筒树孢子萌发及配子体生长的影响
Figure BDA0003161914990000111
试验结果：笔筒树的新鲜孢子在1/4MS培养基条件下萌发率高达99.4％，且形成大量配子体的时间大大缩短，30天左右即可完成该阶段的生长。我们通过对比加入激素6-BA、NAA和IBA,发现其可同样提高笔筒树新鲜孢子萌发率，但延长了其后期成长为配子体的时间，事实上，通过观测生长状况我们同样发现，过早施用激素的培养基，笔筒树繁殖的团生长势较弱，分布没有单一使用1/4MS后的长势强。
通过对比实验，我们发现笔筒树孢子萌发对于湿度要求较高，采用液体1/4MS培养基，下层脱脂棉，中间放液体培养基，上层含无菌水的滤纸覆盖整个培养皿保湿，这样的萌发效果更好，对比普通1/4MS固体培养基，以及不覆盖保湿滤纸等，前者的萌发率显著增加，且大大缩短了长成配子体的时间。
试验三：配子体生长条件对比
试验方法：分别采用固体培养基MS、1/2MS、1/4MS，以及不同浓度的激素配合，6BA、NAA和IAA，研究不同培养基条件，以及培养基和激素的搭配使用，对笔筒树配子体生长的增殖率以及诱导生根时间的影响。组培方法同实施例1，孢子生长：培养温度为25℃，湿度80％，光照度为100μmolm-2s-1，时间16h/d。每个处理20个，重复3次。
表3培养基类型对孢子体增殖率的影响
Figure BDA0003161914990000121
试验结果：配子体增殖期的最佳培养基为：MS+1-2mg/L 6BA+0.2-0.5mg/L NAA，该组合后的孢子体增殖率最高，且缩短了诱导生根幼苗时间，其中，MS+1mg/L 6BA+0.5mg/LNAA这一组合的效果最优，同比单独使用其中一种激素或两种其他组合的激素效果好；在增殖生长和诱导生根速度上来看，MS培养基配合6-BA+NAA的效果要比1/2MS、1/4MS培养基好。
试验四：光照条件对笔筒树繁殖周期上的影响
试验方法：组培方法同实施例1，其中采用不同的光照强度，50μmolm-2s-1，60μmolm-2s-1，80μmolm-2s-1，100μmolm-2s-1，120μmolm-2s-1，光照时间，12h/d，14h/d，16h/d，18h/d作为对比，分别对比了孢子生长和配子生长期间，光照条件对其的影响。每个处理20个，重复3次。
表4光照条件对形成配子体时间和诱导出生根幼苗时间的影响
Figure BDA0003161914990000131
试验结果：表4可知，光照强度和光照时间对笔筒树的组培苗繁殖周期影响较大，其中，对形成配子体时间和诱导出生根幼苗时间的影响较深。通过对比试验我们发现，前期孢子生长期间，光照度为60μmolm-2s-1，时间12h/d可显著缩短了形成配子体的周期；而后面配子体的生长期间，通过调整光强和时间，即100μmolm-2s-1，时间16h/d，诱导出生根幼苗可缩短到30天左右。通过优化光强条件，与传统笔筒树育苗繁殖相比，形成配子体可缩短10-14d。
试验五：不同遮荫网下的光照强度变化对笔筒树移栽后幼苗生长的影响
试验方法：参见图5，通过本发明的移栽技术，其中移栽后的遮荫装置设置不同梯度(遮荫度T1全光照0％，T2 25％，T3 50％，T4 75％)的遮荫度，测定遮荫网下的光照强度的日变化图，研究不同遮荫网下的光照强度变化对笔筒树幼苗生长的影响。移栽基质：泥炭、珍珠岩和蛭石，体积比为3：1：1，有机质含量为275.60g/kg，速效磷含量为0.052g/kg，速效钾含量为0.23g/kg，速效氮含量为0.35g/kg，容重为0.23g/cm3，最大持水量为373.7％(参见实施例2)；选生长基本一致的幼苗，移入不同光照强度小区进行试验，每处理6株，随机区组设计，5次重复，设保护行，幼苗均被置于每一育苗床内的中央位置，以避免任何可能来自四个侧面的影响。
试验结果：
(1)不同光照下笔筒树叶绿素含量变化
参见图6不同光照强度下笔筒树叶片的叶绿素含量变化，与不遮荫处理相比，遮荫后笔筒树叶片的叶绿素a(Chl a)、叶绿素b(Chl b)、总叶绿素(Chla+b)均显著增加，在T3和T4光处理下，笔筒树中的Chla，Chlb和类胡萝卜素浓度高于T1处理。此外，在T2下，笔筒树叶片中的Chla和Chlb含量分别增加了32.6％(p<0.05)和21.6％(p<0.05)。
(2)不同光照下笔筒树A-Ci曲线变化
当Ci≤600μmol·mol-1时，笔筒树叶片Pn随着Ci升高的增加速度较快，由此认为Pn是受Rubisco酶羧化的限制；当Ci＞600μmol·mol-1时，Pn随Ci浓度的增加逐渐达到饱和(图7不同光照强度下笔筒树叶片的净光合速率的变化)，此阶段RuBP的再生速率是限制Pn的主要因素。遮荫处理的笔筒树叶片Jmax值显著高于不遮荫处理，而T4光照水平的笔筒树叶片Jmax显著高于其他遮荫处理；遮荫处理的笔筒树叶片Vcmax值显著高于不遮荫处理，其中T475％遮荫率的Vcmax高于其它遮荫水平(表5)。
表5不同光强处理下笔筒树的光补偿点和饱和点变化
Figure BDA0003161914990000141
Figure BDA0003161914990000151
(3)不同光照强度下笔筒树叶绿体的超微结构
参见图8，不同光照条件下笔筒树叶片的解剖结构存在显著差异，总体表现为随着光照强度的降低，叶片的细胞排布越疏松，细胞层数越小，海绵组织细胞层数增加，而栅栏组织细胞层数减小。不同光照条件下笔筒树叶片的叶绿体超微结构存在显著差异，不同光照强度下，叶绿体整体形状呈椭圆形，类囊体结构薄膜垛叠结构清晰完整，但在T1光照强度条件下，叶绿体结构肿胀变形，类囊体结构紊乱，并出现断裂，模糊不清。
(4)移栽后遮荫时间对笔筒树生长的影响
移栽后遮荫处理时间梯度具体为：C1-一个月，C2-两个月，C3-三个月，C4-四个月，移栽半年后幼苗的苗高和成活率。如下表6，移栽后遮荫处理时间影响着笔筒树后期生长，移栽后的幼苗需要继续遮荫，其中T4遮荫度在遮荫2-3个月时的苗高生长效果更优，且移栽成活率也较高。
表6不同遮荫时间对笔筒树生长的影响
Figure BDA0003161914990000152
Figure BDA0003161914990000161
试验六：笔筒树移栽后不同施肥的对比
试验方法：试验中选择长势良好，且大小较为一致的健壮笔筒树幼苗移栽至育苗容器中。之后进行常规的水肥管理，定期防虫除草。育苗容器为无纺布网袋
Figure BDA0003161914990000162
培养的基质为泥炭、珍珠岩和蛭石，体积比例分别为3：1：1。基质的有机质含量为275.60(g/kg)，速效磷含量为0.052g/kg，速效钾含量为0.23g/kg，速效氮含量为0.35g/kg，容重为0.23g/cm3，最大持水量为373.7％。每种肥料处理设5个重复，每个重复移栽幼苗20株，容器均置于育苗盘中。
表7试验设计
处理 肥料类型 用量
T1 水溶肥N:P:K配比为20:20:20 800倍稀释
T2 缓释肥N:P:K配比为20:20:20 3g/盆
T3 有机肥鸡粪腐熟颗粒肥 3g/盆
T4 水溶肥N:P:K配比为15:9:12 500倍稀释
T5 缓释肥N:P:K配比为15:9:12 1g/盆
T6 有机肥羊粪腐熟颗粒肥 1g/盆
T7 水溶肥N:P:K配比为8:10:15 1000倍稀释
T8 缓释肥N:P:K配比为8:10:15 5g/盆
T9 有机肥牛粪腐熟颗粒肥 5g/盆
(1)不同肥料处理下笔筒树生物量变化
生物量是最直观、最容易测定的生长指标，也是反映苗木质量的重要因子，较可靠地反映了苗木生长。肥料的施加促进了笔筒树生物量的显著增加，笔筒树的鲜重、生物量及叶生物量比也随之增加，并在T3时达到最大值，表明施用有机肥更利于笔筒树幼苗生物量的增长。
表8不同肥料及用量对笔筒树生物量的影响
处理 鲜重(g) 干重(g) 叶生物量比 比叶重
T1 1.73±0.82c 0.54±0.097c 0.26±0.03c 0.029±0.003c
T2 2.30±0.36ab 0.70±0.96b 0.41±0.02b 0.043±0.002ab
T3 2.52±0.44a 0.83±0.015a 0.53±0.03a 0.045±0.002a
T4 1.10±0.02c 0.43±0.08c 0.23±0.02c 0.021±0.004c
T5 2.21±0.30ab 0.61±0.56b 0.39±0.04b 0.040±0.001ab
T6 2.34±0.31a 0.79±0.02a 0.48±0.01a 0.041±0.004a
T7 1.20±0.001c 0.48±0.06c 0.24±0.05c 0.020±0.003c
T8 2.12±0.05ab 0.64±0.06b 0.39±0.11b 0.042±0.003ab
T9 2.42±0.04a 0.81±0.01a 0.47±0.21a 0.043±0.003a
(2)不同肥料处理下笔筒树叶绿素含量变化
图9不同肥料处理下笔筒树叶片的叶绿素含量变化，不同的施肥显著地影响了笔筒树叶片的叶绿素含量。肥料的施加显著地增加了笔筒树叶片内的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量，但显著降低叶绿素a与叶绿素b的比值。与T1肥料处理相比，T3处理的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量达最大值，分别是T1处理的1.22、1.35和1.86倍。
(3)不同肥料下笔筒树光合特性变化
光合作用是地球上最为重要的化学作用。在不同的肥料处理下，笔筒树的光合参数具有显著的差异。笔筒树的净光合速率T3时的净光合速率是T1时的4.34倍。笔筒树叶片蒸腾速率在不同肥料处理下有着差异显著性。笔筒树胞间二氧化碳浓度的变化趋势与净光合速率的变化趋势相反，但各处理间皆差异显著。
表9不同肥料对笔筒树净光合速率、气孔导度、蒸腾系数和胞间二氧化碳浓度的影响
Figure BDA0003161914990000181
注：a,b,c表示根据LSD检验，在0.05水平上的差异显著性，相同字母表示差异不显著
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种笔筒树繁殖方法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)消毒处理：将孢子放入离心管，加入无菌水，2500-3000r/min转速离心2-3min，去除上清液，再次在离心管内滴入15％-25％次氯酸钠与10-15％双氧水的混合溶液，静置灭菌4min，并使用无菌水冲洗笔筒树孢子，得到无菌的笔筒树孢子悬浊液；(2)接种孢子：将消毒过后的孢子悬浊液接种至萌发培养基表面，所述萌发培养基为下层脱脂棉，中间放1/4MS液体培养基，上层含无菌水的滤纸覆盖整个培养皿保湿；(3)孢子生长：将培养皿先于黑暗环境下放置24h，再取出放入人工气候箱中进行培养；(4)配子生长：随后将长成配子体的笔筒树绿色组织接种至玻璃瓶中，瓶中的培养基为MS固体培养基+1-2mg/L 6- BA+0.2-0.5mg/L NAA，于人工气候箱增殖并诱导生根培养出生根幼苗；(5)将生根幼苗移到装有灭菌基质的容器中，基质为2-3mm细泥炭，遮荫炼苗30d左右，长成壮苗，随后移栽；
所述步骤(1)消毒处理：采用新鲜孢子作为繁殖材料，将收集到的成熟孢子无菌水浸泡24h，过滤，再将孢子放入1.5ml离心管，加入1ml无菌水，放入离心机，2500-3000r/min转速离心2-3min，去除上清液，再次在离心管内滴入15％-25％次氯酸钠与10-15％双氧水溶液按3:1的体积比混合的溶液1ml，静置灭菌4min，并使用无菌水冲洗笔筒树孢子3次，得到无菌的笔筒树孢子悬浊液。
2.如权利要求1所述的笔筒树繁殖方法，其特征在于，所述步骤(3)孢子生长：将培养皿先于黑暗环境下放置24h，再取出放入温度为25℃，湿度80％的人工气候箱中进行培养，光照度为60μmolm-2s-1，时间12h/d，30-40d大量长成配子体。
3.如权利要求1所述的笔筒树繁殖方法，其特征在于，所述步骤(4)配子生长：随后将长成配子体的笔筒树绿色组织接种至玻璃瓶中，瓶中的培养基为MS固体培养基+1-2mg/L 6-BA+0.2-0.5mg/L NAA，于人工气候箱增殖并诱导生根培养，25℃，湿度80％，光照度为100μmolm-2s-1，光照16h/d，培养30-40d诱导出生根幼苗。
4.如权利要求1所述的笔筒树繁殖方法，其特征在于，所述步骤(5)将生根幼苗移到装有灭菌基质的容器中，基质为2-3mm细泥炭，温室中80％遮荫度炼苗，25℃，光照16h/d，培养30d左右，长成壮苗，随后移栽；所述移栽的基质为泥炭、珍珠岩和蛭石，体积比例分别为3：1：1，鸡粪腐熟颗粒肥3g/盆；移栽后的管理措施：75％的遮荫度下生长2-3个月后，接受正常自然光生长。
5.如权利要求1所述的笔筒树繁殖方法，其特征在于，将移栽生长的笔筒树1-2年生幼苗，进行野外回归种植；设置温湿光监测仪，定期监测记录幼苗野外回归后的环境状况及生长发育状况，夏季高温超过30℃，需要遮荫防护，冬季温度低于0℃，需要透明保温膜防护，具体使用濒危植物笔筒树的培育用防护装置。
6.如权利要求5所述的笔筒树繁殖方法，其特征在于，所述濒危植物笔筒树的培育用防护装置具体包括基板(1)，所述基板(1)的表面活动安装有多个支撑龙骨(2)，所述支撑龙骨(2)的一端设置有定位锚杆(3)，所述基板(1)的表面盖合有限制罩盖(4)，多个支撑龙骨(2)的表面固定安装有防护布(7)，所述支撑龙骨(2)包括活动安装在基板(1)上的长管(21)，所述长管(21)的一侧开设有活动腔(23)，所述活动腔(23)的内部滑动安装有长杆(22)，所述长管(21)一侧的一端贯穿设置有定位螺丝(24)，所述定位螺丝(24)的一端插入到长杆(22)的内部，所述定位锚杆(3)设置在长杆(22)位于长管(21)外侧的一端。
7.如权利要求6所述的笔筒树繁殖方法，其特征在于，所述限制罩盖(4)顶部的内壁上固定安装有多个限制插销(6)，所述基板(1)的顶部开设有多个与限制插销(6)相适配的限制插孔(5)；所述长管(21)一侧的一端开设有与定位螺丝(24)相适配的通孔(26)，所述长杆(22)的表面开设有多个与定位螺丝(24)相适配的定位孔(25)。
8.如权利要求7所述的笔筒树繁殖方法，其特征在于，所述定位锚杆(3)包括焊接在长杆(22)表面尾端的螺纹管(31)，所述螺纹管(31)的内部设置有螺纹杆(32)，所述螺纹杆(32)的一端焊接有拧动块(33)；所述螺纹杆(32)是由螺纹端(321)和圆锥端(322)焊接组成的，所述螺纹端(321)的一端焊接在拧动块(33)上，所述圆锥端(322)的圆端焊接在螺纹端(321)上；所述螺纹管(31)的内壁上设置有与螺纹端(321)相适配的内螺纹(34)。
9.如权利要求8所述的笔筒树繁殖方法，其特征在于，所述防护布(7)的表面开设有密集分布的通孔，通孔的孔径为0.5mm；所述基板(1)的外径与限制罩盖(4)的内径相适配。
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