CN113331054B - 一种有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术技术领域，具体公开了一种有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法。该方法中在培养盒中形成了空气单向流动，并通过医用注射器来添加含有抑菌剂溶液增殖培养基和生根培养基，所述抑菌剂溶液由新鲜马蔺根、新鲜甘蕉根茎、新鲜柔枝槐根、新鲜水毛花根、新鲜苦瓜根茎和蒸馏水为原料制成，利用该方法进行植物组织培养，可以实现在有菌环境条件下添加培养基操作，植物组织培养过程感染病菌风险低，培育的组培苗生根率和移植存活率高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法。
背景技术
组织培育应用最广泛的植物无性繁殖技术之一，该技术不受环境和季节的限制，繁殖后代的性状与母本保持完全一致，组培苗生长周期短，对采穗圃的面积要求较小，能在有限的时间和空间内高质量、高产量地发展林木种苗生产，促进良种质资源的保存、利用以及推广种植，适合大规模的生产，因此在花卉、果树和甘蔗上有着广泛的应用。传统组织培养由于需要严格的无菌操作和培养环境，需要较高投入和技术要求，导致生产成本过高，大大限制该技术的推广应用。因此提供一种无需在无菌环境操作和组织培养或是减少需在无菌环境操作和组织培养的环节的植物组织培养方法意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法，利用该方法进行植物组织培养，可以实现在有菌环境条件下添加增殖培养基和生根培养基操作，无感染病菌。
为实现上述目的，本发明提供了一种有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法，包括以下步骤：一种有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)备好植物组织培养的培养器；所述培养器包括可拆卸的盒体和盖体；所述盒体内放置有载苗穴盘，塑料盒体长25-35厘米、宽18-23厘米、高13-15厘米，离盒底0.2-0.3厘米设有1直径为0.3-0.5厘米的进气孔；盖体长25-35厘米、宽18-23厘米、高1.5-3.0厘米，左右两侧各有一直径0.8-1.0换气孔，盖体与主体卡扣密封；
所述载苗穴盘长宽小于盒体，穴盘有8-12个穴孔，穴孔口直径5-6厘米、穴孔底直径2-3厘米，深5-6厘米；
(2)培养器盒体、盖体和载苗穴盘经过消毒灭菌处理后，将载苗穴盘放到培养盒内，置于无菌条件下备用；
(3)将植物增殖苗丛芽，分成2-3株的小丛苗，将小丛苗放入备好盒体的载苗穴盘穴孔内，添加MS培养基，盖上盖体，并持续向进气孔中通入无菌空气，进行培育；
(4)培养15-20天后添加增殖培养基；
(5)待组培苗长满穴孔后，添加生根培养基，进行生根培育；
(6)组培苗生根后，移出培养盒进行假植，停止向培养盒通入无菌空气。
进一步，上述技术方案中，步骤(4)中所述增殖培养基和步骤(5)中所述添加生根培养基添加方式为通过医用注射器注入培养基。
进一步，上述技术方案中，所述医用注射器包括注射器外套和适配成移动于该外套内芯杆，所述外套有外套空腔，所述外套空腔分别在外套的前后端开口，所述外套空腔的前端有封底部，在所述外套空腔的封底部的前端有锥头，所述锥头内有锥头孔，所述锥头孔与外套空腔贯通，在外套的后部有外套卷边，在外套的外表面上有容量标尺；
所述芯杆的后端有按手，前部有密封圈；所述芯杆的密封圈从外套空腔后端开口处插入外套空腔内后，操纵所述芯杆的按手可使密封圈在外套空腔内前后移动，密封圈的外壁与外套空腔的内壁形成医用注射器的密封配合；通过医用注射器注入培养基具体方法为：将培养基装在医用注射器外套空腔内后，从注射器外套后端套上芯杆，并且将注射器外套锥头孔和培养器盖体的换气孔连接，通过操纵芯杆的按手将培养基注入到载苗穴盘穴孔内。
进一步，上述技术方案中，所述医用注射器在使用之前需经过消毒灭菌处理。进一步，上述技术方案中，所述医用注射器进行消毒灭菌处理方法为：将医用注射器各组件浸泡在消毒剂溶液中40～60分钟，取出无菌环境晾干备用。进一步，所述消毒剂溶液按质量份数计由泛醇羟丙基硬脂基二甲基氯化铵0.1％～0.3％、氯化钠5％～10％、尿素10％～15％和水混合搅拌溶解后得到。
进一步，上述技术方案中，所述增殖培养基由MS培养基溶液添加6-苄基腺嘌呤1.0～1.5mg/L、甲哌鎓0.1～0.5mg/L、蔗糖30g/L和抑菌剂溶液形成，按体积计算，抑菌剂溶液的添加量为MS培养基溶液体积的0.01％～0.05％。
进一步，上述技术方案中，所述生根培养基由MS培养基溶液添加1-萘乙酸钠5mg/L、蔗糖50g/L和抑菌剂溶液形成，按体积计算，抑菌剂的添加量为MS培养基溶液体积的0.01％～0.05％。
进一步，上述技术方案所述增殖培养基和所述生根培养基中抑菌剂溶液按质量份数计由新鲜马蔺根15～25份、新鲜甘蕉根茎20～30份、新鲜柔枝槐根10～20份、新鲜水毛花根15～25份、新鲜苦瓜根茎10～20份和蒸馏水10份经粉碎蒸煮后，提取滤液得到。
优选的，上述有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法技术方案中，步骤(4)中所述增殖培养基和步骤(5)中所述生根培养基添加质量与步骤(3)中所述MS培养基添加质量相同。
优选的，上述有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法技术方案中，所述植物包括甘蔗；步骤(3)所述植物增殖苗丛芽包括甘蔗增殖苗丛芽。
与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明植物组织培养方法中给培养盒进气孔持续的通入无菌干净的空气，空气经过培养盒内部，在培养盒盖体上换气孔流出，该过程在培养盒中形成了空气单向流动，在该条件下通过消毒后医用注射器通过换气孔向培养盒内添加增殖培养基和生根培养基，该添加增殖培养基和生根培养基是在有菌环境条件下操作完成，成功实现了增殖培养基和生根培养基是在有菌环境条件下添加，简化了植物组织培养过程和难度，降低了组织培育成本，降低了植物组织培育过程中被感染的风险。
2.结合采用医用注射器添加增殖培养基和生根培养基过程，本发明以泛醇羟丙基硬脂基二甲基氯化铵、氯化钠、尿素和水组成消毒剂对医用注射器在使用前进行消毒，在增殖培养基和生根培养基添加由新鲜马蔺根、新鲜甘蕉根茎、新鲜柔枝槐根、新鲜水毛花根、新鲜苦瓜根茎和蒸馏水为原料制成的抑菌剂溶液进一步为组织培育过程避免病菌等污染提供保障；而且新鲜马蔺根、新鲜甘蕉根茎、新鲜柔枝槐根、新鲜水毛花根、新鲜苦瓜根茎等物质中具有大量促进植物生长、提高植物抗逆性的活性物质，这些物质添加到增殖培养基和生根培养基中植物组织培育过程中被吸收有利于提高组培苗生长增殖速率，提高组培苗抗病抗逆性，提高组培苗生根率和移栽存活率。
附图说明
图1是培养容器示意图。
图2是培养容器的塑料盖体2的俯视图。
图3是培养容器里穴盘5的俯视图。
主要附图标记说明：
1-塑料盒主体，2-塑料盒盖体，3-盖体换气孔，4-进气孔，5-穴盘，6-穴孔。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
所述培养器如图1～3所示，包括可拆卸的盒体(1)和盖体(2)；所述盒体(1)内放置有载苗穴盘(5)，塑料盒主体(1)长25-35厘米、宽18-23厘米、高13-15厘米，离盒底0.2-0.3厘米设有1直径为0.3-0.5厘米的进气孔(4)；塑料盒盖体长25-35厘米、宽18-23厘米、高1.5-3.0厘米，左右两侧各有一直径0.8-1.0换气孔(3)，盖体与主体卡扣密封；
所述载苗穴盘(5)长宽小于塑料盒主体，穴盘有8-12个穴孔(6)，穴孔(6)口直径5-6厘米、穴孔(6)底直径2-3厘米，深5-6厘米；
实施例2
(1)备好植物组织培养的培养器；
(2)培养培养器经过消毒灭菌处理后，将载苗穴盘放到培养盒内，置于无菌条件下备用；
(3)将甘蔗增殖苗丛芽，分成2-3株的小丛苗，将小丛苗放入备好盒主体的载苗穴盘穴孔内，添加MS培养基，盖上盖体，并持续向进气孔中通入无菌空气，进行培育；
(4)培养15天后添加增殖培养基；
(5)待组培苗长满穴孔后，添加生根培养基，进行生根培育；
(6)组培苗生根后，移出培养盒进行假植，停止向培养盒通入无菌空气。
步骤(4)中所述增殖培养基和步骤(5)中所述添加生根培养基添加方式为通过医用注射器注入培养基。
所述医用注射器包括注射器外套和适配成移动于该外套内芯杆，所述外套有外套空腔，所述外套空腔分别在外套的前后端开口，所述外套空腔的前端有封底部，在所述外套空腔的封底部的前端有锥头，所述锥头内有锥头孔，所述锥头孔与外套空腔贯通，在外套的后部有外套卷边，在外套的外表面上有容量标尺；
所述芯杆的后端有按手，前部有密封圈；所述芯杆的密封圈从外套空腔后端开口处插入外套空腔内后，操纵所述芯杆的按手可使密封圈在外套空腔内前后移动，密封圈的外壁与外套空腔的内壁形成医用注射器的密封配合；通过医用注射器注入培养基具体方法为：将培养基装在医用注射器外套空腔内后，从注射器外套后端套上芯杆，并且将注射器外套锥头孔和培养器盖体的换气孔连接，通过操纵芯杆的按手将培养基注入到载苗穴盘穴孔内；
所述医用注射器在使用之前需经过消毒灭菌处理，所述医用注射器进行消毒灭菌处理方法为：将医用注射器各组件浸泡在消毒剂溶液中40分钟后，取出无菌环境晾干备用。
所述消毒剂溶液按质量份数计由泛醇羟丙基硬脂基二甲基氯化铵0.1％、氯化钠10％、尿素15％和水混合搅拌溶解后得到。
上述技术方案中，所述增殖培养基由MS培养基溶液添加6-苄基腺嘌呤1.5mg/L、甲哌鎓0.1mg/L、蔗糖30g/L和抑菌剂溶液形成，按体积计算，抑菌剂溶液的添加量为MS培养基溶液体积的0.01％。
上述技术方案中，所述生根培养基由MS培养基溶液添加1-萘乙酸钠5mg/L、蔗糖50g/L和抑菌剂溶液形成，按体积计算，抑菌剂的添加量为MS培养基溶液体积的0.05％。
上述技术方案所述增殖培养基和所述生根培养基中抑菌剂溶液按质量份数计由新鲜马蔺根25份、新鲜甘蕉根茎20份、新鲜柔枝槐根10份、新鲜水毛花根15份、新鲜苦瓜根茎10份和蒸馏水10份经粉碎蒸煮后，提取滤液得到。
上述有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法技术方案中，步骤(4)中所述增殖培养基和步骤(5)中所述生根培养基添加质量与步骤(3)中所述MS培养基添加质量相同。上述有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养温度为24～27℃；每日光照12h，光照强度为2000～2500lx；空气湿度65％～75％。
对比实施例2-1
与实施例2基本相同，不同的是所用消毒剂溶液为0.1％次氯酸钠溶液，所用的抑菌剂溶液为0.1％多菌灵可溶性液剂。
对比实施例2-2
与实施例2基本相同，不同的是所用消毒剂溶液为75％酒精溶液，所用的抑菌剂溶液为0.3％恶霉灵溶液。
实施例3
(1)备好植物组织培养的培养器；
(2)培养培养器经过消毒灭菌处理后，将载苗穴盘放到培养盒内，置于无菌条件下备用；
(3)将甘蔗增殖苗丛芽，分成2-3株的小丛苗，将小丛苗放入备好盒主体的载苗穴盘穴孔内，添加MS培养基，盖上盖体，并持续向进气孔中通入无菌空气，进行培育；
(4)培养20天后添加增殖培养基；
(5)待组培苗长满穴孔后，添加生根培养基，进行生根培育；
(6)组培苗生根后，移出培养盒进行假植，停止向培养盒通入无菌空气。
步骤(4)中所述增殖培养基和步骤(5)中所述添加生根培养基添加方式为通过医用注射器注入培养基。
所述医用注射器包括注射器外套和适配成移动于该外套内芯杆，所述外套有外套空腔，所述外套空腔分别在外套的前后端开口，所述外套空腔的前端有封底部，在所述外套空腔的封底部的前端有锥头，所述锥头内有锥头孔，所述锥头孔与外套空腔贯通，在外套的后部有外套卷边，在外套的外表面上有容量标尺；
所述芯杆的后端有按手，前部有密封圈；所述芯杆的密封圈从外套空腔后端开口处插入外套空腔内后，操纵所述芯杆的按手可使密封圈在外套空腔内前后移动，密封圈的外壁与外套空腔的内壁形成医用注射器的密封配合；通过医用注射器注入培养基具体方法为：将培养基装在医用注射器外套空腔内后，从注射器外套后端套上芯杆，并且将注射器外套锥头孔和培养器盖体的换气孔连接，通过操纵芯杆的按手将培养基注入到载苗穴盘穴孔内；
所述医用注射器在使用之前需经过消毒灭菌处理，所述医用注射器进行消毒灭菌处理方法为：将医用注射器各组件浸泡在消毒剂溶液中60分钟后，取出无菌环境晾干备用。
所述消毒剂溶液按质量份数计由泛醇羟丙基硬脂基二甲基氯化铵0.3％、氯化钠5％、尿素10％和水混合搅拌溶解后得到。
上述技术方案中，所述增殖培养基由MS培养基溶液添加6-苄基腺嘌呤1.0mg/L、甲哌鎓0.5mg/L、蔗糖30g/L和抑菌剂溶液形成，按体积计算，抑菌剂溶液的添加量为MS培养基溶液体积的0.05％。
上述技术方案中，所述生根培养基由MS培养基溶液添加1-萘乙酸钠5mg/L、蔗糖50g/L和抑菌剂溶液形成，按体积计算，抑菌剂的添加量为MS培养基溶液体积的0.01％。
上述技术方案所述增殖培养基和所述生根培养基中抑菌剂溶液按质量份数计由新鲜马蔺根15份、新鲜甘蕉根茎30份、新鲜柔枝槐根20份、新鲜水毛花根25份、新鲜苦瓜根茎20份和蒸馏水10份经粉碎蒸煮后，提取滤液得到。
上述有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法技术方案中，步骤(4)中所述增殖培养基和步骤(5)中所述生根培养基添加质量与步骤(3)中所述MS培养基添加质量相同，上述有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养温度为24～27℃；每日光照12h，光照强度为2000～2500lx；空气湿度65％～75％。
对比实施例3-1
与实施例3基本相同，不同的是所用消毒剂溶液为0.1％次氯酸钠溶液，所用的抑菌剂溶液为0.5％多菌灵可溶性液剂。
对比实施例3-2
与实施例3基本相同，不同的是所用消毒剂溶液为75％酒精溶液，所用的抑菌剂溶液为0.3％恶霉灵溶液。
不同组培方式试验结果见下表1，由表可知按照实施例2和实施例3组培进行植物组织培育污染率为0，对比实施例2-1、对比实例2-2、对比实施例3-1和对比实施例3-2污染率分别为2.1％、1.5％、1.9％、1.4％，常规组培苗繁殖方式污染率为4.6％，显而易见，虽然本发明植物组织培养的方法是在有菌环境条件下添加增殖培养基和生根培养基，但是其受环境污染风险低于一般组培苗繁殖方式，而且利用该方法培育的组培苗生根率和移植存活率与一般组培苗繁殖方式略高。
表1.不同实施方式组培苗培育生长情况
综上所述，利用该方法进行植物组织培养，可以实现在有菌环境条件下添加增殖培养基和生根培养基操作，植物组织培养过程无感染病菌，培育的组培苗生根率和移植存活率不比一般组培苗繁殖方式差。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (3)
1.一种有菌环境条件下添加培养基的植物组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）备好植物组织培养的培养器；所述培养器包括可拆卸的盒体和盖体；所述盒体内放置有载苗穴盘，盒体上设有进气孔；盖体设有换气孔，盖体与主体通过卡扣密封；所述载苗穴盘设有穴孔；
（2）培养器经过消毒灭菌处理后，将载苗穴盘放到培养盒内，置于无菌条件下备用；
（3）将甘蔗增殖苗丛芽，分成2-3株的小丛苗，将小丛苗放入所述载苗穴盘的穴孔内，添加MS培养基，盖上盖体，并持续向进气孔中通入无菌空气，进行培育；
（4）培养15-20天后添加增殖培养基；所述增殖培养基由MS培养基溶液添加 6-苄基腺嘌呤1.0～1.5 mg/L、甲哌鎓0.1～0.5mg/L、蔗糖30g/L和抑菌剂溶液形成，按体积计算，抑菌剂溶液的添加量为MS培养基溶液体积的0. 01%～0.05%；
（5）待组培苗长满穴孔后，添加生根培养基，进行生根培育；所述生根培养基由MS培养基溶液添加1-萘乙酸钠5mg/L、蔗糖50g/L和抑菌剂溶液形成，按体积计算，抑菌剂的添加量为MS培养基溶液体积的0. 01%～0.05%；
（6）组培苗生根后，移出培养盒进行假植，停止向培养盒通入无菌空气；
所述步骤（4）、所述步骤（5）中所述抑菌剂溶液按质量份数计由新鲜马蔺根15~25份、新鲜甘蕉根茎20~30份、新鲜柔枝槐根10~20份、新鲜水毛花根15~25份、新鲜苦瓜根茎10~20份和蒸馏水10份经粉碎蒸煮后，提取滤液得到；
所述增殖培养基和步骤（5）中所述添加生根培养基添加方式为通过医用注射器注入培养基；所述医用注射器在使用之前需经过消毒灭菌处理，所述消毒灭菌处理方法为：将医用注射器各组件浸泡在消毒剂溶液中40~60分钟；所述消毒剂溶液按质量份数计由泛醇羟丙基硬脂基二甲基氯化铵0.1%~0.3%、氯化钠5%~10%、尿素10%~15%和水混合搅拌溶解后得到。
2.根据权利要求1所述的植物组织培养方法，其特征在于，所述医用注射器包括注射器外套和适配成移动于该外套内芯杆，所述外套有外套空腔，所述外套空腔分别在外套的前后端开口，所述外套空腔的前端有封底部，在所述外套空腔的封底部的前端有锥头，所述锥头内有锥头孔，所述锥头孔与外套空腔贯通，在外套的后部有外套卷边，在外套的外表面上有容量标尺；
所述芯杆的后端有按手，前部有密封圈；所述芯杆的密封圈从外套空腔后端开口处插入外套空腔内后，操纵所述芯杆的按手可使密封圈在外套空腔内前后移动，密封圈的外壁与外套空腔的内壁形成医用注射器的密封配合；通过医用注射器注入培养基具体方法为：将培养基装在医用注射器外套空腔内后，从注射器外套后端套上芯杆，并且将注射器外套锥头孔和培养器盖体的换气孔连接，通过操纵芯杆的按手将培养基注入到载苗穴盘穴孔内。
3.根据权利要求1所述的植物组织培养方法，其特征在于，步骤（4）中所述增殖培养基和步骤（5）中所述生根培养基添加质量与步骤（3）中所述MS培养基添加质量相同。
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