CN113330112A - 磷酸化的dicer抗体及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了磷酸化的Dicer1(pDicer1)抗体，包括那些选择性结合丝氨酸1728和/或丝氨酸1852的抗体。本文还提供了通过单独或与其他疗法组合施用pDicer1抗体来治疗癌症的方法。

Description

磷酸化的DICER抗体及其使用方法

本申请要求于2018年12月21日提交的美国临时申请序列号62/784,032和2019年3月1日提交的序列号62/812,743的优先权权益，两份申请的全部内容通过引用并入本文。

序列表的并入

包含在名为“UTFCP1431WO_ST25.txt的文件中的序列表，其大小为10KB(在Microsoft

中测量)，于2019年12月13日创建，通过电子提交方式提交，并通过引用并入本文。

背景

1.领域

本发明一般涉及免疫学和医学领域。更具体地，本发明涉及抗dicer抗体及其使用方法。

2.相关技术说明

Dicer1是一种必需的核糖核酸内切酶，可将前微RNA加工成功能性微RNA。DICER1充当单倍体不足的肿瘤抑制因子：在人类癌症中经常观察到体细胞杂合突变，而杂合性在几种鼠肿瘤模型中促进了肿瘤发生。DICER1综合征患者携带DICER1中的种系杂合突变(错义和截短)，并存在增加患多种癌症的风险，包括胸膜肺母细胞瘤、卵巢性索间质瘤、囊性肾瘤和甲状腺癌。

Dicer1在秀丽隐杆线虫(C.elegans)的KRAS信号传导轴中被ERK磷酸化。在这种情况下，磷酸化的Dicer1是细胞核的并驱动卵母细胞向胚胎过渡，表明Dicer1在发育过程中的这一关键重编程事件中发挥着新的作用。最近，发现秀丽隐杆线虫DCR1在Ser1705和Ser1833处的细胞外信号调节激酶(ERK)依赖性磷酸化对于卵子发生是必不可少的，而去磷酸化对于胚胎发生的进展是必不可少的(Drake等人,2014)。因此，Dicer1磷酸化和去磷酸化的振荡对于卵子发生和胚胎发生是必不可少的。这一发现首次强调了Dicer1功能在发育过程中受到严格的翻译后控制。在哺乳动物中，发现Dicer1在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和人胚胎肾细胞系中，当成纤维细胞生长因子刺激时在保守的丝氨酸处被磷酸化。此外，在体内在发育中的小鼠子宫腺中，Dicer1在Ser1712和Ser1836处被磷酸化。在所有这些情况下，Dicer1的磷酸化与其从细胞质到细胞核的易位相耦合。

Burger等人鉴定了其他的丝氨酸，其在DNA损伤应答期间被ATM/ATR磷酸化，导致培养的人类细胞中Dicer1从细胞质到细胞核的易位(Burger等人,2017)。这些结果表明Dicer1的磷酸化是保守的事件；然而，Dicer1磷酸化和去磷酸化在哺乳动物体内的作用仍然未知。

概述

在第一个实施方案中，本公开内容提供了分离的单克隆抗体，其中抗体在丝氨酸1728和/或丝氨酸1852处特异性结合磷酸化的人Dicer1(pDicer1)。在特定方面，抗体在丝氨酸1852处特异性结合磷酸化的人Dicer1(pDicer1)。在一些方面，抗体包含由抗磷酸-Ser1852-DICER1抗体杂交瘤克隆25(以下简称“克隆25”)编码的抗体的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:3(GYSFTSYW)、SEQ ID NO:5(IYPGNSAT)和SEQ ID NO:7(TRVGYRYEAWFAY))和V_L结构域的CDR1-3(SEQ ID NO:11(SSVSY)、SEQ ID NO:13(DTS)和SEQ ID NO:15(FQGSGYPLT))。在特定方面，抗体不结合或基本上不结合非磷酸化的Dicer1。在特定方面，仅当在丝氨酸处磷酸化([pS])时，抗体才识别肽序列VPR[pS]PVREL。

在一些方面，抗体包含与克隆25的V_H结构域(SEQ ID NO:2)至少约80％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的V_H结构域和与克隆25的V_L结构域(SEQ ID NO:10)至少约80％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的V_L结构域。在某些方面，抗体包含与由SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列至少约80％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的V_H结构域和与由SEQ ID NO:9编码的氨基酸序列至少约80％(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)相同的V_L结构域。在某些方面，抗体包含与克隆25的V_H结构域(SEQ ID NO:2)相同的V_H结构域和与克隆25的V_L结构域((SEQ ID NO:10)相同的V_L结构域。在某些方面，抗体包含与由SEQ ID NO:1编码的氨基酸序列相同的V_H结构域和与由SEQ ID NO:9编码的氨基酸序列相同的V_L结构域。

在某些方面，抗体是重组的。在一些方面，抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。在某些方面，抗体是Fab'、F(ab’)2、F(ab’)3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。在一些方面，抗体是人抗体、人源化抗体或去免疫化抗体。在另外的方面，抗体与显像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素缀合。

在另一个实施方案中，提供了组合物，包含在药学上可接受的载体中的实施方案的抗体(例如，结合磷酸化的人Dicer1的抗体)。本文进一步提供了分离的多核苷酸分子，包含编码实施方案的抗体(例如，结合磷酸化的人Dicer1的抗体)的核酸序列。在另外的实施方案中，分离的多核苷酸分子包含SEQ ID NO：4、6和8或SEQ ID NO：12、14和16。在其他实施方案中，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：4、6、8、12、14和16。在其他实施方案中，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。本文还提供了包含抗体V_H结构域的重组多肽，所述抗体V_H结构域包含克隆25的V_H结构域的CDR 1-3和克隆25的V_H结构域的CDR 1-3。在另一个实施方案中，提供了分离的多核苷酸分子，包含编码多肽的核酸序列，所述多肽包含抗体V_H结构域，所述抗体V_H结构域包含克隆25的V_H结构域的CDR 1-3和克隆25的V_H结构域的CDR 1-3。本文进一步提供了包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:9的表达载体。在一些实施方案中，表达载体包括SEQ ID NO：4、6和8和/或SEQ ID NO：12、14和16。

另一个实施方案提供了宿主细胞，包含一个或多个编码实施方案的抗体(例如结合磷酸化人Dicer1的抗体)或包含抗体V_H结构域的重组多肽的多核苷酸分子，所述抗体V_H结构域包含克隆25的V_H结构域的CDR 1-3和克隆25的V_H结构域的CDR 1-3。在一些方面，宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

本文还提供包含实施方案的pDicer1抗体和药学载体的药物组合物。另一个实施方案提供了组合物，包含有效量的实施方案的pDicer1抗体，用于治疗受试者中的癌症。本文进一步提供包含有效量的实施方案的pDicer1抗体的组合物用于治疗受试者中癌症的用途。在某些方面，用于治疗癌症的方法中的pDicer1抗体还包含细胞穿透肽(CPP)和/或细胞核定位信号(NLS)。在某些方面，实施方案的pDicer1抗体，例如ScFv，包含CPP和NLS序列。根据实施方案使用的CPP的示例包括但不限于源自HIV Tat、疱疹病毒VP22、果蝇触角同源框基因产物和protegrin I的肽段。

另一个实施方案提供了治疗受试者中癌症的方法，包括向受试者施用有效量的实施方案的pDicer1抗体。

在一些方面，癌症是子宫内膜癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胸膜肺母细胞瘤、卵巢性索间质瘤、囊性肾瘤或甲状腺癌(例如，甲状腺癌)。在特定方面，癌症是子宫内膜癌。在一些方面，癌症具有突变的KRas和/或p53。

在某些方面，通过静脉内、皮内、瘤内、肌内、腹膜内、皮下或局部施用抗体。在特定方面，静脉内施用抗体。

在另外的方面，方法还包括向受试者施用至少第二抗癌疗法。在一些方面，第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。

本文还提供了用于检测受试者中癌症的方法，包括测试来自受试者的样品中相对于对照升高的磷酸化的Dicer1的存在，其中测试包括将样品与实施方案的抗体接触。在特定方面，方法进一步定义为体外方法。

另一个实施方案提供了检测样品中磷酸化的Dicer1的体外方法，包括通过测量实施方案的pDicer1抗体与样品的结合来检测升高水平的磷酸化的Dicer1。在一些方面，样品是组织活检、细针抽吸物、唾液、尿液或血浆。在某些方面，与对照相比升高水平的磷酸化的Dicer1将样品鉴定为侵袭性癌症样品。在一些方面，侵袭性癌症是侵袭性子宫内膜癌。在一些方面，与对照相比升高水平的磷酸化的Dicer1表明预后不良。在特定方面，升高水平的磷酸化的Dicer1进一步定义为检测到样品中超过50％的细胞对于磷酸化的Dicer1是阳性的。在另外的方面，方法进一步包括将pDicer抗体施用于经鉴定具有升高水平的磷酸化的Dicer1的受试者。

进一步的实施方案提供了小鼠，其基因组包含磷酸-模拟Dicer1。在一些方面，磷酸-模拟Dicer1具有被天冬氨酸替换的丝氨酸1712和/或丝氨酸1836。在某些方面，磷酸-模拟Dicer1具有被天冬氨酸替换的丝氨酸1712和丝氨酸1836。在一些方面，磷酸-模拟Dicer1具有被天冬氨酸替换的丝氨酸1712。在特定方面，磷酸-模拟Dicer1具有被天冬氨酸替换的丝氨酸1836。在一些方面，小鼠是Dicer^S1712D、Dicer^S1836D或Dicer^2SD小鼠。在特定方面，小鼠是Dicer^S183D/S183D小鼠。在某些方面，小鼠已经加速老化。在一些方面，小鼠具有高代谢表型和/或改变的代谢miRNA。小鼠可以是雌性或雄性小鼠。本文进一步提供了从实施方案的小鼠中分离的细胞。

本文还提供了多肽，包含与人Dicer1至少90％相同的序列，其中对应于1728位的丝氨酸和/或对应于1852位的丝氨酸被天冬氨酸置换。本文进一步提供了包含编码实施方案的多肽的序列的多核苷酸分子。

通过下面的详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，详细说明和具体示例虽然表明了本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出，因为本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将由该详细描述变得显而易见。

附图的简要说明

下列附图构成本说明书的一部分，并被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或多幅并结合在此呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1A-1C：磷酸化的Dicer与人类中的原发性子宫内膜癌和胸膜肺母细胞瘤相关联。(A)胸膜肺母细胞瘤样品在间充质(箭号)中显示阳性磷酸化的DICER1(丝氨酸1852，克隆25)染色，主要具有细胞核定位，在上皮细胞(蓝色染色，箭头)中无染色。(B)用抗磷酸化的DICER1(丝氨酸1852，克隆25)单克隆Ser1852抗体(克隆25，在本文中命名为磷酸化-Dicer用于图形标记)(上图)和抗磷酸化ERK抗体(下图)染色的子宫内膜癌代表性图像。(C)放大显示细胞核磷酸化的DICER1染色的子宫内膜癌样品图像。(D)根据对于磷酸-Dicer是阳性的细胞的数量(图板A)，肿瘤被分为对于磷酸化的Dicer是“低至中”阳性或对于磷酸化的Dicer是“高”阳性。条形图显示具有临床病理特性的低至中或高磷酸化-Dicer1的肿瘤分布。BMI，体重指数；LVSI，淋巴血管间隙侵袭；侵袭，肌层侵袭深度。BMI的p＝0.002，LVSI为p＝0.06，子宫肌层侵袭深度的p＝0.03。

图2A-2D：磷酸化Dicer促进KRas^+/LA1小鼠的肿瘤发生。(A)KRas^+/LA1小鼠(n＝21)和KRas^+/LA1的Kaplan-Meier存活曲线；Dicer^+/2SD小鼠(n＝36)随访400天。p＝0.03。(B)左图：KRas^+/LA1小鼠(n＝17)和KRas^+/LA1；Dicer^+/2SD小鼠(n＝24)中患有癌症、多发性癌症和散播性癌症的小鼠发生频率。右图：肿瘤类型及其频率、具有>1种肿瘤类型的小鼠数量以及每种基因型中具有肿瘤的小鼠总数。*，转移的/散播的肿瘤。(C)KRas^+/LA小鼠(n＝17只小鼠中16例癌症)和KRas^+/LA1；Dicer^+/2SD小鼠(n＝24只小鼠中37例癌症)的肿瘤谱。(D)在63X处捕获的代表性免疫荧光图像显示磷酸化的Dicer和DAPI。杂合的KRas^+/LA1和Dicer^+/2SD不显示细胞核磷酸化的Dicer信号，而KRas^+/LA1；Dicer^+/2SD和Dicer^S2D+/2SD显示增加的磷酸化的细胞核Dicer信号。比例尺：50微米。用兔多克隆抗磷酸-Dicer抗体评估磷酸-Dicer检测。

图3A-3E：磷酸-Dicer促进p53^+/-小鼠中肿瘤发生。(A)p53^+/-小鼠(n＝19)和p53^+/-；Dicer^+/2SD小鼠(n＝32)的Kaplan-Meier存活曲线，随访540天。p＝0.07。(B)p53^+/-小鼠(n＝12)和p53^+/-；Dicer^+/2SD小鼠(n＝21)的无肿瘤存活曲线，随访540天。进行了Kaplan-Meier存活分析，p＝0.03。(C)左图：p53^+/-小鼠(n＝12)和p53^+/-；Dicer^+/2SD小鼠(n＝21)中患有癌症、多发性癌症和散播性癌症的小鼠发生频率。右图：肿瘤类型及其频率、具有>1种肿瘤类型的小鼠数量以及每种基因型中具有肿瘤的小鼠总数。*，转移的/散播的肿瘤。(D)p53^+/-小鼠(n＝12只小鼠，3只小鼠中3例癌症)和p53^+/-；Dicer^+/2SD小鼠(n＝21只小鼠，15只小鼠中20例癌症)的肿瘤谱。用兔多克隆抗磷酸-Dicer抗体评估磷酸-Dicer检测。

图4A-4C：KRas^+/LA1；Dicer^+/2SD小鼠中的肿瘤和转移。(A)正常脾(左)和脾淋巴瘤(右)的代表性20X H&E图像。(B)正常肝(左)、肝脏淋巴瘤(中)和肝脏组织细胞肉瘤(右)的代表性20X H&E图像。(C)正常肾皮质(左)、肾皮质淋巴瘤(中)和肾皮质中肺腺癌转移(右)的代表性20X H&E图像。

图5A-5E：纯合突变体的新型Dicer1等位基因和表型。(A)显示了Dicer1磷酸化的位点。DUF，未知功能的结构域；PAZ、Piwi Argonaute和Zwille结合结构域；dRBD，双链RNA结合结构域。(B)所有Dicer1突变体的纯合活力通过近交杂合突变体进行测试(列出了命名法和相关突变)。列出了所有基因型的观察和预期数量(括号中)。WT，野生型；Het，杂合突变体；同源，纯合突变体。进行了卡方检验并列出了p值。(C)一周龄(顶部)和两周龄(底部)Dicer^2SD/2SD小鼠(星号)和正常同窝幼崽的代表性图像。(D)1到10月龄的野生型(WT)、Dicer^{S1836D/S1836D}和Dicer^2SD/2SD雄性(左，分别n＝12、12和10)和雌性(右，分别n＝12、9和11)小鼠定期称重。显示了多个时间点(以月为单位)具有标准差的平均重量。在终点时所有基因型至少有3只小鼠(一些动物在达到终点之前死亡)。(E)通过与野生型小鼠交配来测试所有纯合突变体的生育能力。列出了所有突变体(雄性和雌性)的同窝幼崽数和平均窝产崽数。

图6A-6F：Dicer2^SD/2SD小鼠中的加速老化表型。(A)野生型和Dicer^2SD/2SD小鼠骨骼的代表性显微CT扫描(等值面阈值1000)。(B)对野生型(n＝4)和Dicer^2SD/2SD小鼠(n＝4)的脊柱后凸指数进行量化、平均并带有标准差表示。学生t检验用于确定显著性，*p＝0.02。(C)对野生型(n＝4)和Dicer^2SD/2SD小鼠(n＝4)的脊柱中的骨体积分数(BVF)进行量化、平均并带有标准差表示。学生t检验用于确定显著性，***p＝0.0003。(D)对野生型(n＝4)和Dicer^2SD/2SD小鼠(n＝4)的脊柱骨矿物质密度(BMD)进行量化、平均并带有标准差表示。学生t检验用于确定显著性，**p＝0.008。(E)来自六月龄的野生型和Dicer^2SD/2SD小鼠的股骨骨干(1.25X)的代表性H&E纵向切片。显示了皮质骨最薄切片的测量值。(F)来自八月龄的野生型和Dicer^2SD/2SD小鼠的睾丸(20X)、卵巢(10X)、皮肤(20X)和股骨骨骺和干骺端(5X)的代表性H&E切片。标记睾丸切片的间质(Leydig)细胞(箭号)、卵巢实质(星号)、皮肤中的皮下脂肪(I)、生长板软骨(箭号)的不规则厚度以及骨替代骺软骨(箭头)和脂肪细胞侵袭(星号)，在股骨骨骺骨髓中。(G)野生型(n＝57)、Dicer^{S1712D/S1712D}(n＝15)、Dicer^{S1836D/S1836D}(n＝21)和Dicer^2SD/2SD(n＝21)小鼠的存活曲线，随访560天。垂直线代表无发病安乐死的动物。

图7A-7C：Dicer^2SD/2SD小鼠的血液学表型。(A)2-8月龄的Dicer^2SD/2SD小鼠和8月龄的野生型小鼠的股骨和胫骨的代表性H&E切片。(B)2-8月龄的野生型(n＝7)和Dicer^2SD/2SD同窝幼崽小鼠(n＝8)的全血细胞计数。显示了具有标准差的平均测量值。对于血小板，p＝0.89，对于RBC，**p＝0.007，对于WBC，*p＝0.01。每个点代表一只小鼠。WBC，白细胞；RBC，红细胞。(C)2-8月龄的野生型(n＝7)和Dicer^2SD/2SD同窝幼崽小鼠(n＝8)血液中的血清酶水平。显示了具有标准差的平均测量值。对于AST，p＝0.11，对于ALT，p＝0.16，对于AP，*p＝0.01。每个点代表一只小鼠。AST，天冬氨酸氨基转移酶；ALT，丙氨酸转氨酶；AP，碱性磷酸酶；U/L，单位/升。

图8A-8E：磷酸化改变Dicer1定位和miRNA谱。(A)在来自野生型(WT)、Dicer^{S1712D /S1712D}、Dicer^{S1836D/S1836D}和Dicer^2SD/2SD小鼠的代表性睾丸切片(20X)上用抗Dicer1抗体进行免疫荧光。比例尺＝10μm。(B)在三种野生型(WT)、Dicer^{S1712D/S1712D}、Dicer^{S1836D/S1836D}和Dicer^2SD/2SD睾丸的生精小管中计算具有细胞核Dicer1的精母细胞(不包括精细胞和精子)的百分比。细胞被分类为细胞质或细胞核/两者。计算带有标准差的平均值。(C)miRNA在来自野生型和Dicer^2SD/2SD小鼠的睾丸(对于Dicer^2SD/2SD，n＝3，对于WT，n＝2)和MEF(对于Dicer^2SD/2SD，n＝4，对于WT，n＝3)中的差异表达。绿色、红色和黄色点分别代表与野生型样品相比，Dicer^2SD/2SD样品中下调、上调和未受影响的miRNA。蓝线代表2倍截止。(D)下调的miRNA的数量(>10个读数/百万，和>2倍差异)，以及突变睾丸和MEF的重叠。列出了重叠的miRNA。(E)使用DIANATOOLS对突变睾丸中下调的miRNA进行通路分析。列出了列表中的前22条通路。

图9A-9E：Dicer^2SD/2SD小鼠和MEF的更高代谢。(A)CLAMS测试用于测量野生型(n＝2)和Dicer^2SD/2SD小鼠(n＝4)从10am到9am的耗氧率(OCR)。显示每次测量的耗氧率(VO2)，单位为mL/kg/min，具有标准差。在实验测量期间，垂直线将亮时段(6am–6pm)和暗时段(6pm–6am)分开。在X轴上，1个单位＝从测量开始起6分钟。(B)对OCR率进行平均并分为亮时段和暗时段。使用学生t检验，对于亮时段，*p＝0.02。(C)CLAMS测试用于测量野生型(n＝2)和Dicer^2SD/2SD(n＝4)小鼠的轮活动。对测量值组合并分为亮时段和暗时段。每个点代表一只小鼠。(D)Seahorse有丝分裂压力测试测定用于测量野生型(n＝7)和Dicer^2SD/2SD(n＝9)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的OCR。绘制了具有标准差的平均测量值。使用学生t检验，*p＝0.02。(E)Seahorse糖酵解压力测试测定用于测量野生型(n＝7)和Dicer^2SD/2SD(n＝9)MEF的细胞外酸化率(ECAR)。绘制了具有标准差的平均测量值。使用学生t检验，*p＝0.04。

图10：在组织微阵列上测试的54个子宫内膜样子宫内膜癌的肿瘤特征。每个肿瘤被归类为少于50％或多于50％的磷酸-Dicer1阳性细胞。

说明性实施方案的描述

DICER1在小鼠模型中用作肿瘤抑制子。在人类中，体细胞突变与成人中的许多癌症相关，并且具有DICER1生殖系突变的DICER1综合征患者易患儿童癌症。Dicer1被ERK-MAP激酶通路磷酸化，在秀丽隐杆线虫发育中起重要作用。由于ERK-MAP激酶通路在人类癌症中被激活，本研究提出磷酸化的Dicer1是否有助于肿瘤发展。在人类子宫内膜癌中，发现磷酸化的DICER1与侵袭性疾病显著相关。为了测试Dicer磷酸化在肿瘤发展中的直接参与，产生在被ERK磷酸化的两个保守丝氨酸处具有磷酸-模拟改变的小鼠，并发现Dicer1的组成型磷酸化在两个独立的小鼠癌症模型(KRas+/LA1和p53+/-)中驱动肿瘤发育和散播。研究结果表明，磷酸化的Dicer1促进了肿瘤的发展和侵袭。

磷酸化位点(小鼠中的丝氨酸1712和1836，以及人类中的丝氨酸1728和1852)和磷酸-Dicer1的细胞核定位在小鼠和人类细胞中都非常保守。在目前的研究中，使用针对人DICER1中的同源残基的磷酸特异性抗体，发现DICER1被磷酸化以响应培养的人细胞中的成纤维细胞生长因子活性。因此，通过测定人原发性子宫内膜瘤子宫内膜肿瘤并通过生成磷酸-模拟Dicer1敲入小鼠模型来研究Dicer1磷酸化在肿瘤发展中的作用，其中丝氨酸1712和1836被天冬氨酸替换。发现1)磷酸化的DICER1存在于大多数子宫内膜癌中，并且与侵袭性疾病显著相关，和2)Dicer1的组成型磷酸化在两个独立的鼠癌症模型(KRas^+/LA1和p53^+/-)中驱动肿瘤的发展和散播。目前的研究结果表明，磷酸化的Dicer1与侵袭性人类子宫内膜癌相关；并在致癌KRAS和杂合p53背景下促进小鼠的肿瘤发展和侵袭。

因此，在某些实施方案中，本公开内容提供了用于磷酸化的DICER1，特别是人DICER1的丝氨酸1852的磷酸化的单克隆抗体。丝氨酸1852磷酸化对于DICER1的细胞核易位是必要和充分的。由于磷酸化的Dicer1促进肿瘤的发展和侵袭，本发明磷酸化的Dicer1抗体既可用作侵袭性肿瘤的预后标志物，也可阻断磷酸化的Dicer分子的功能并阻止肿瘤进展。因此，本文提供了使用本发明抗体作为诊断剂的方法，例如对具有侵袭性肿瘤的患者进行分层，和/或用于治疗癌症，例如肺癌、胰腺癌、卵巢癌、甲状腺癌或子宫内膜癌。

I.定义

如本文所用，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于表示没有任何特定组分被有意配制成组合物和/或仅作为污染物或以微量形式存在。因此，由组合物的任何非预期污染产生的指定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是其中不能用标准分析方法检测到任何量的特定组分的组合物。

如本文所用，“一个”或“一种”可表示一个(种)或多个(种)。如本文在权利要求中使用的，当与词“包括”结合使用时，词“一个”或“一种”可以表示一个(种)或多个(种)。

权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持定义仅指替代方案和“和/或”。如本文所用，“另一个”可表示至少第二个或更多个。术语“约”、“基本上”和“大约”通常表示规定值正负5％。

疾病或病况的“治疗”或处理是指执行方案，其可包括向患者施用一种或多种药物，以努力减轻疾病的体征或症状。治疗的理想效果包括降低疾病进展的速度、缓解或缓和疾病状态以及减缓或改善预后。减轻可以发生在疾病或病况的体征或症状出现之前，也可以在它们出现之后。因此，“治疗”或“处理”可包括“预防”或“防止”疾病或不良状况。此外，“治疗”或“处理”不需要完全减轻体征或症状，不需要治愈，并且特别包括对患者仅具有边际影响的方案。

本申请通篇使用的术语“治疗益处”或“治疗有效性”是指促进或增强受试者在该病况的医学治疗方面的健康的任何方面。这包括但不限于降低疾病的体征或症状的频率或严重程度。例如，癌症的治疗可涉及例如减小肿瘤的大小、减小肿瘤的侵袭性、降低癌症的生长速率或预防转移。癌症的治疗也可指延长癌症受试者的生存期。

“受试者”和“患者”指人类或非人类，如灵长类、哺乳动物和脊椎动物。在特定实施方案中，受试者是人类。

短语“药学上或药理学上可接受的”是指是指当对动物，例如人类，视情况而定施用时不产生不良、过敏或其他不期望反应的分子实体和组合物。根据本公开内容，本领域技术人员将知道制备包含抗体或其他活性成分的药物组合物。此外，对于动物(例如，人类)施用，应理解制备物应满足FDA生物标准办公室要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。

如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有水性溶剂(例如，水、醇/水溶液、盐水溶液、肠胃外媒介物，例如氯化钠、林格氏右旋糖等)、非水性溶剂(例如，丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯)、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂或抗真菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料、流体和营养补充剂，例如本领域普通技术人员已知的材料及其组合。根据众所周知的参数来调整药物组合物中各种成分的pH和精确浓度。

II.磷酸化的Dicer抗体

在某些实施方案中，考虑了与磷酸化的Dicer1的至少一部分结合并抑制Dicer信号传导的抗体或其片段。如本文所用，术语“抗体”旨在泛指任何免疫结合剂，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和基因修饰的IgG以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构域的多肽。抗体可选自嵌合抗体、亲和力成熟抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、人抗体或抗原结合抗体片段或者天然或合成配体。优选地，pDicer1抗体是单克隆抗体或人源化抗体，例如下面描述的抗磷酸-Ser1852-DICER1抗体杂交瘤克隆25。

克隆25VH核苷酸序列

CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGCCTGGGGCTTCCGTGAGGATGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTACAGCTTTACCAGCTACTGGATGCACTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTAGAATGGATTGGTGCTATTTATCCTGGAAATAGTGCTACCAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCCGCCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGTGGGCTATAGGTACGAAGCCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA(SEQ ID NO:1)

克隆25VH氨基酸序列

VQLQQSGTVLARPGASVRMSCKASGYSFTSYWMHWIKQRPGQGLEWIGAIYPGNSATNYNQKFKGKAKLTAVTSASTAYMELSSLTNEDSAVYYCTRVGYRYEAWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:2)

克隆25VH CDR1氨基酸序列

GYSFTSYW(SEQ ID NO:3)

克隆25VH CDR1核苷酸序列

GGCTACAGCTTTACCAGCTACTGG(SEQ ID NO:4)

克隆25VH CDR2氨基酸序列

IYPGNSAT(SEQ ID NO:5)

克隆25VH CDR2核苷酸序列

TATTTATCCTGGAAATAGTGCTAC(SEQ ID NO:6)

克隆25VH CDR3氨基酸序列

TRVGYRYEAWFAY(SEQ ID NO:7)

克隆25VH CDR3核苷酸序列

ACAAGAGTGGGCTATAGGTACGAAGCCTGGTTTGCTTAC(SEQ ID NO:8)

克隆25VL核苷酸序列

GACATTGTGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATTCACTGGTACCAGCAGAAGTCAAACACCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGACACATCCAAACTGGCTTCTGGAGTCCCAGGTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAAACTCTTACTCTCTCACGATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGTTGCCACTTATTACTGTTTTCAGGGGAGTGGGTACCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA(SEQ ID NO:9)

克隆25VL CDR1氨基酸序列

DIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIHWYQQKSNTSPKLWIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSMEAEDVATYYCFQGSGYPLTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:10)

克隆25VL CDR1氨基酸序列

SSVSY(SEQ ID NO:11)

克隆25VL CDR1核苷酸序列

TCAAGTGTAAGTTAC(SEQ ID NO:12)

克隆25VL CDR2氨基酸序列

DTS(SEQ ID NO:13)

克隆25VL CDR2核苷酸序列

GACACATCC(SEQ ID NO:14)

克隆25VL CDR3氨基酸序列

FQGSGYPLT(SEQ ID NO:15)

克隆25VL CDR3核苷酸序列

TTTCAGGGGAGTGGGTACCCGCTCACG(SEQ ID NO:16)

因此，通过已知方式和如本文所述，可以产生对磷酸化的Dicer、其各自表位的一种或多种或任何前述的缀合物具有特异性的单克隆抗体、抗体片段和结合结构域和CDR(包括上述任何一种的工程化形式)，无论这些抗原或表位是从天然来源分离的或者是天然化合物的合成衍生物或变体。

适用于本实施方案的抗体片段的示例包括但不限于：(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成；(ii)由V_H和C_H1结构域组成的“Fd”片段；(iii)由单一抗体的V_L和V_H结构域组成的“Fv”片段；(iv)“dAb”片段，其由V_H结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab’)2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(“scFv”)，其中V_H结构域和V_L结构域通过肽接头连接，使两个结构域结合形成结合结构域；(viii)双特异性单链Fv二聚体(参见美国专利号5,091,513)；(ix)通过基因融合构建的双抗体、多价或多特异性片段(美国专利申请公布20050214860)。Fv、scFv或双抗体分子可以通过引入连接V_H和V_L结构域的二硫桥而得到稳定。还可以制备包含连接到CH3结构域的scFv的微型抗体(minibody)。

在实施方案中还考虑了抗体样结合肽模拟物。Liu等人(2003)描述了“抗体样结合肽模拟物”(ABiP)，它们是作为消减抗体(pared-down antibody)的肽，并且具有更长的血清半衰期以及更少繁琐的合成方法的某些优势。

动物可以接种抗原，例如磷酸化的Dicer1肽，以产生对磷酸化的Dicer1具有特异性的抗体。通常，抗原与另一个分子结合或缀合以增强免疫应答。如本文所用，缀合物是与抗原结合的任何肽、多肽、蛋白质或非蛋白质物质，用于在动物中引发免疫应答。动物体内对抗原接种应答而产生的抗体包括由多种产生个体抗体的B淋巴细胞制成的多种不同分子(多克隆抗体)。多克隆抗体是抗体种类的混合群体，每个种类都可以识别同一抗原上的不同表位。鉴于动物体内多克隆抗体产生的正确条件，动物血清中的大多数抗体将识别免疫动物的抗原化合物上的集合表位。这种特异性通过亲和纯化得到进一步增强，以仅选择识别目标抗原或表位的那些抗体。

单克隆抗体是单一种类的抗体，其中每个抗体分子识别相同的表位，因为所有产生抗体的细胞都源自单个B淋巴细胞细胞系。产生单克隆抗体(MAb)的方法通常与制备多克隆抗体的方法相同。在一些实施方案中，啮齿动物例如小鼠和大鼠用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或蛙细胞用于产生单克隆抗体。大鼠的使用是众所周知的并且可以提供某些优势。小鼠(例如,BALB/c小鼠)是常规使用的并且通常提供高百分比的稳定融合。

杂交瘤技术涉及来自先前用Dicer抗原免疫的小鼠的单个B淋巴细胞与永生骨髓瘤细胞(通常是小鼠骨髓瘤)的融合。该技术提供了一种将单个抗体产生细胞繁殖无限代的方法，从而可以产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同的抗体(单克隆抗体)。

血浆B细胞(CD45⁺CD5^-CD19⁺)可以从新鲜制备的免疫兔的外周血单核细胞中分离出来，并进一步针对磷酸化的Dicer结合细胞进行选择。富集产生抗体的B细胞后，可以分离总RNA并合成cDNA。可以扩增来自重链和轻链两者的抗体可变区的DNA序列，构建到噬菌体展示Fab表达载体中，并转化到大肠杆菌中。磷酸化的丝氨酸1852Dicer特异性结合Fab可通过多轮富集淘选筛选出来并进行测序。使用哺乳动物表达载体系统在人胚胎肾(HEK293)细胞(Invitrogen)中，选择的Dicer结合命中可以表达为兔和兔/人嵌合形式的全长IgG，并使用蛋白G树脂和快速蛋白液相色谱(FPLC)分离部件得到纯化。

在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如，包含来自非人供体的抗原结合序列移植到异源非人、人或人源化序列(例如框架和/或恒定结构域序列)的抗体。已经开发出用人源的类似结构域替换单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域的方法，使外源抗体的可变区保持完整。可替代地，“全人”单克隆抗体在人免疫球蛋白基因转基因的小鼠中产生。还开发了通过重组构建具有啮齿类动物(例如小鼠)和人类氨基酸序列的抗体可变结构域将单克隆抗体的可变结构域转化为更多人形式的方法。在“人源化”单克隆抗体中，只有高变CDR源自小鼠单克隆抗体，框架和恒定区源自人类氨基酸序列(参见美国专利号5,091,513和6,881,557)。人们认为，用人类抗体相应位置中发现的氨基酸序列替换啮齿动物特征的抗体中的氨基酸序列将降低治疗使用期间不良免疫反应的可能性。产生抗体的杂交瘤或其他细胞也可能发生基因突变或其他变化，这可能会或可能不会改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。

在各种动物物种中生产多克隆抗体以及生产各种类型包括人源化、嵌合和全人的单克隆抗体的方法是本领域公知的并且是高度可预测的。例如，以下美国专利和专利申请提供了对此类方法的描述：美国专利申请号2004/0126828和2002/0172677；和美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,196,265；4,275,149；4,277,437；4,366,241；4,469,797；4,472,509；4,606,855；4,703,003；4,742,159；4,767,720；4,816,567；4,867,973；4,938,948；4,946,778；5,021,236；5,164,296；5,196,066；5,223,409；5,403,484；5,420,253；5,565,332；5,571,698；5,627,052；5,656,434；5,770,376；5,789,208；5,821,337；5,844,091；5,858,657；5,861,155；5,871,907；5,969,108；6,054,297；6,165,464；6,365,157；6,406,867；6,709,659；6,709,873；6,753,407；6,814,965；6,849,259；6,861,572；6,875,434；和6,891,024。本文和其中引用的所有专利、专利申请出版物和其他出版物在此通过引用并入本申请。

抗体可以从任何动物来源产生，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是绵羊、鼠(例如小鼠和大鼠)、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡。此外，更新的技术允许从人类组合抗体库中开发和筛选人类抗体。例如，噬菌体抗体表达技术允许在没有动物免疫的情况下产生特异性抗体，如美国专利号6,946,546，其通过引用并入本文。

无论动物物种、单克隆细胞系或抗体的其他来源如何，完全可以预期针对磷酸化的Dicer丝氨酸1852的抗体将具有中和或抵消Dicer磷酸化的影响的能力。某些动物物种可能对于产生治疗性抗体不那么优选，因为它们更可能由于补体系统通过抗体的“Fc”部分的激活而引起过敏应答。然而，整个抗体可以被酶促消化成“Fc”(补体结合)片段，以及具有结合结构域或CDR的抗体片段。Fc部分的去除降低了抗原抗体片段引发不希望的免疫应答的可能性，并因此没有Fc的抗体对于预防性或治疗性处理可能是优选的。如上所述，抗体也可被构造成嵌合的或者部分或完全人的，以便减少或消除由于向动物施用已在其它物种中产生或具有来自其它物种的序列的抗体而产生的不利免疫后果。

取代变体通常包含在蛋白质内一个或多个位点处一种氨基酸与另一种氨基酸的交换，并且可以被设计用于调节多肽的一个或多个性质，有或没有丧失其他功能或性质。取代可以是保守的，也就是说，一个氨基酸被一个相似形状和电荷的氨基酸替换。保守取代在本领域中是众所周知的，并且包括例如以下变化：丙氨酸至丝氨酸；精氨酸至赖氨酸；天冬酰胺至谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸至谷氨酸；半胱氨酸至丝氨酸；谷氨酰胺至天冬酰胺；谷氨酸至天冬氨酸；甘氨酸至脯氨酸；组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸至亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸至精氨酸；蛋氨酸至亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或蛋氨酸；丝氨酸至苏氨酸；苏氨酸至丝氨酸；色氨酸至酪氨酸；酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸；以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸。可替代地，取代可以是非保守的，使得多肽的功能或活性受到影响。非保守的变化通常涉及将残基取代为化学上不相似的残基，例如用极性或带电的氨基酸取代非极性或不带电的氨基酸，反之亦然。

蛋白质可以是重组的，也可以是体外合成的。可替代地，可以从细菌中分离非重组或重组蛋白质。还预期可以在组合物和方法中实施含有这种变体的细菌。因此，不需要分离蛋白质。

预期在组合物中有约0.001mg至约10mg的总多肽、肽和/或蛋白质每ml。因此，组合物中蛋白质的浓度可为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml或更多(或其中可推导出的任何范围)。其中，约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％可以是结合磷酸化的Dicer1的抗体。

抗体或优选地抗体的免疫学部分可以化学缀合至或表达为与其他蛋白质的融合蛋白质。出于本说明书和所附权利要求的目的，所有此类融合蛋白均包括在抗体或抗体的免疫学部分的定义中。

实施方案提供了针对Dicer、多肽和肽的抗体和抗体样分子，这些抗体和抗体样分子与至少一种试剂连接以形成抗体缀合物或有效载荷。为了提高抗体分子作为诊断或治疗剂的功效，通常连接或共价结合或复合至少一种所需分子或部分。这种分子或部分可以是但不限于至少一种效应分子或报告分子。效应分子包括具有所需活性，例如细胞毒活性的分子。已与抗体附接的效应分子的非限制性示例包括毒素、治疗酶、抗生素、放射性标记的核苷酸等。相比之下，报告分子定义为可以使用测定法检测到的任何部分。已经与抗体缀合的报告分子的非限制性示例包括酶、放射性标记、半抗原、荧光标记、磷光分子、化学发光分子、生色团、发光分子、光亲和分子、有色颗粒或配体，例如生物素。

本领域已知将抗体与其缀合部分附接和缀合的几种方法。一些附接方法涉及使用金属螯合络合物，例如使用有机螯合剂，例如二乙基三胺五乙酸(DTPA)；乙三胺四乙酸(ethylenetriaminetetraacetic acid)；N-氯-对-甲苯磺酰胺；和/或与抗体附接的四氯-3-6-二苯基甘脲-3。单克隆抗体也可以在偶联剂如戊二醛或高碘酸盐存在下与酶反应。在这些偶联剂的存在下或通过与异硫氰酸酯反应制备具有荧光素标志物的偶联物。

III.治疗方法

本实施方案的某些方面可用于预防或治疗与Dicer信号传导相关的疾病或病症。任何合适的药物都可以降低Dicer的信号传导以防止癌细胞增殖。优选地，此类物质将是磷酸化的Dicer1抗体。

本治疗方法有用的肿瘤包括任何恶性细胞类型，例如在实体瘤或血液肿瘤中发现的恶性细胞类型。示例性实体肿瘤可包括但不限于选自下列组成的组的器官的肿瘤：胰腺、结肠、盲肠、胃、脑、头、颈、卵巢、肾、喉、肉瘤、肺、膀胱、黑色素瘤、前列腺和乳腺。示例性血液肿瘤包括骨髓肿瘤、T或B细胞恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、骨髓瘤等。可使用本文提供的方法治疗的癌症的进一步示例包括但不限于肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)、腹膜癌，胃癌或胃部癌(包括胃肠道癌和胃肠道间质癌)、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌，甲状腺癌、各种类型的头颈癌和黑色素瘤。在特定实施例中，癌症是乳腺癌。

癌症具体可以是以下组织学类型，但不限于这些：赘生物，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；胸膜肺母细胞瘤，乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡状腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；大汗腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；侵袭性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；卵泡膜细胞瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；雄性细胞瘤，恶性；塞托利细胞瘤；莱迪希细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无色素黑色素瘤；浅表扩散黑色素瘤；雀斑恶性黑色素瘤；肢端雀斑黑色素瘤；结节性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合瘤，恶性；苗勒管混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间充质瘤，恶性；布伦纳瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；近皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞性牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原质性星形细胞瘤；纤维状星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金；类肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿病；其他特异性非霍奇金淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；低级别/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞NHL；高级淋巴母细胞NHL；高级小非裂解细胞NHL；大块病NHL；套细胞淋巴瘤；AIDS相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴细胞白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓系白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓系肉瘤；毛细胞白血病；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；急性淋巴母细胞白血病(ALL)；急性髓性白血病(AML)；和慢性粒细胞白血病。

A.药物组合物

本文还提供了包含磷酸化的-Dicer1抗体和药学上可接受的载体的药物组合物和制剂。

如本文所述的药物组合物和制剂可以通过将具有所需纯度的活性成分(例如抗体或多肽)与一种或多种任选的药学上可接受的载体(Remington's PharmaceuticalSciences 22^nd edition,2012)混合来制备，以冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，包括但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲铵氯化物；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖例如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性药学上可接受的载体进一步包括间质药物分散剂，例如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(

Baxter International,Inc.)。一方面，sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶如软骨素酶组合。

B.组合疗法

在某些实施方案中，本实施方案的组合物和方法涉及与至少一种另外的疗法组合的pDicer1抗体。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，肿块切除术(lumpectomy)和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。另外的疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。

在一些实施方案中，另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗转移剂。在一些实施方案中，另外的疗法是施用副作用限制剂(例如，旨在减少治疗副作用的发生和/或严重程度的试剂，例如抗恶心剂等)。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中，另外的疗法是手术。在一些实施方案中，另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中，另外的疗法是伽马照射。在一些实施方案中，另外的疗法是靶向PBK/AKT/mTOR通路、HSP90抑制剂、微管蛋白抑制剂、细胞凋亡抑制剂和/或化学预防剂的疗法。另外的疗法可以是本领域已知的一种或多种化学治疗剂。

pDicer1抗体可以在相对于另外的癌症疗法例如免疫检查点疗法之前、期间、之后或以各种组合施用。施用可以间隔从同时到几分钟到几天到几周不等。在免疫细胞疗法与另外的治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常会确保在每次递送之间没有很长的时间段，使得这两种化合物仍然能够发挥对患者有利的组合效果。在这种情况下，预期可以在彼此相隔约12至24或72小时内，更具体地，彼此相隔约6-12小时内向患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在某些情况下，如果各个施用之间间隔几天(2、3、4、5、6或7天)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)，可能需要显著延长治疗时间。

可以采用各种组合。对于下面的示例，pDicer1抗体是“A”，抗癌疗法是“B”：

向患者施用本实施方案的任何化合物或疗法将遵循施用此类化合物的一般方案，考虑到试剂的毒性(如果有的话)。因此，在一些实施方案中，存在可归因于组合疗法的监测毒性的步骤。

1.化学疗法

根据本实施方案可以使用多种化学治疗剂。化学治疗剂的示例包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺；烷基磺酸盐，如白消安、丙硫丹、哌硫丹；氮丙啶类，如苯并多巴、碳醌、美托多巴和乌多巴；亚乙基亚胺和甲基三聚氰胺，包括三乙胺、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛和布拉他西酮)；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡司他丁(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；念珠藻环肽(duocarmycin)(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；eleutherobin；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，例如苯丁酸氮芥、氯萘嗪、胆磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲基氯胺酮(mechlorethamine)、盐酸甲基氯胺酮、美法仑、新霉芥、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)和尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，如卡莫司汀、氯唑菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷尼司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γlI和加利车霉素ωI1)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；双膦酸盐，如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素、authrarnycin、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、仙人掌霉素、carabicin、胭脂红霉素、carzinophilin、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯并-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依柔比星、伊达比星、马塞洛霉素(marcellomycin)、丝裂霉素，如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olvomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌罗霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)和三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫胺嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿苷、依西他滨和氟尿苷；雄性激素，例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)和睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素，如米托坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如frolinci acid；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶；贝司他韦(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登醇类(maytansinoid)，例如美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidanmol)；尼曲吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生(razoxane)；力索新(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、疣孢霉素A、漆斑菌素A和蛇形菌毒素)；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如紫杉醇和多西紫杉醇吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；巯嘌呤；铂络合物，如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；米托蒽醌；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄醇类，如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素(plicomycin)、吉西他滨、navelbine、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂(transplatinum)和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

2.放射疗法

引起DNA损伤并已被广泛使用的其他因素包括通常称为γ射线、X射线和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其他形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束照射和紫外线照射。很可能所有这些因素都会对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维护产生广泛的损伤。X射线的剂量范围从长时间(3至4周)的每天50至200伦琴剂量到2000至6000伦琴的单次剂量不等。放射性同位素的剂量范围变化很大，并且取决于同位素的半衰期、所发射辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的吸收。

3.免疫疗法

本领域技术人员将理解免疫疗法可以与实施方案的方法组合或联合使用。在癌症治疗的背景下，免疫疗法通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。利妥昔单抗

就是这样一个例子。免疫效应子可以是，例如，对肿瘤细胞的表面上的某些标志物具有特异性的抗体。抗体可以单独作为疗法的效应子，或者它可以招募其他细胞来实际影响细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并用作靶向剂。可替代地，效应子可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。

抗体-药物偶联物(ADC)包含与细胞杀伤药物共价连接的单克隆抗体(MAb)并且可用于组合疗法。这种方法将MAb对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物相组合，从而产生“武装的”MAb，将有效载荷(药物)递送至具有富集抗原水平的肿瘤细胞。药物的靶向递送也最大限度地减少了其在正常组织中的暴露，从而降低了毒性并提高了治疗指数。示例性ADC药物包括

(brentuximab vedotin)和

(曲妥珠单抗-美坦新偶联物(trastuzumab emtansine)或T-DM1)。

在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须带有一些易于靶向的标志物，即不存在于大多数其他细胞上。存在许多肿瘤标志物并且这些标志物中的任何一个都可以适合在本实施方案背景中靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B、erb b2和p155。免疫疗法的可替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用相组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子例如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子例如MIP-1、MCP-1、IL-8，和生长因子例如FLT3配体。

免疫疗法的示例包括免疫佐剂，例如牛分枝杆菌、恶性疟原虫、二硝基氯苯和芳香族化合物)；细胞因子疗法，例如IL-1、GM-CSF和TNF；基因疗法，例如TNF、IL-1、IL-2和p53；和单克隆抗体，例如抗CD20、抗神经节苷脂GM2和抗p185。考虑了一种或多种抗癌疗法可与本文的抗体疗法一起使用。

在一些实施方案中，免疫疗法可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点调高信号(例如，共刺激分子)或调低信号。免疫检查点阻断可靶向的抑制性免疫检查点包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也称为CD276)、B和T淋巴细胞衰减器(BTLA)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4，也称为CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V结构域Ig抑制子(VISTA)。特别是，免疫检查点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。

免疫检查点抑制剂可以是药物，例如小分子、配体或受体的重组形式，或者特别是抗体，例如人抗体。可以使用免疫检查点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用嵌合、人源化或人形式的抗体。如技术人员所知，本公开中提及的某些抗体可使用替代名称和/或等效名称。在本公开的上下文中，此类替代和/或等效名称是可互换的。例如，已知帕博利珠单抗(lambrolizumab)也被称为替代和等效名称MK-3475和派姆单抗(pembrolizumab)。

在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体方面，PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个特定方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个特定方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。

在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自由纳武单抗、派姆单抗和CT-011组成的组。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，包含融合到恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和

是可以使用的抗PD-1抗体。派姆单抗也称为MK-3475、Merck 3475、帕博利珠单抗、

和SCH-900475，是示例性的抗PD-1抗体。CT-011也称hBAT或hBAT-1，也是抗PD-1抗体。AMP-224也称B7-DCIg，是PDL2-Fc融合可溶性受体。

可以在本文提供的方法中靶向的另一个免疫检查点是细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)，也称为CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞的表面上，当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的成员，在辅助性T细胞表面表达并向T细胞传递抑制性信号。CTLA4类似于T细胞共刺激蛋白CD28，两种分子都与抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)结合。CTLA4向T细胞传递抑制性信号，而CD28则传递刺激性信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中，并且可能对其功能很重要。通过T细胞受体和CD28的T细胞激活导致CTLA-4(一种B7分子的抑制性受体)的表达增加。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是抗-CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白，或寡肽。

适用于本方法的抗人CTLA-4抗体(或源自其的VH和/或VL结构域)可以使用本领域公知的方法产生。可替代地，可以使用本领域公认的抗CTLA-4抗体。示例性抗CTLA-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为10D1、MDX-010、MDX-101和

)或其抗原结合片段和变体。在其他实施方案中，抗体包含伊匹单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，抗体包含伊匹单抗的VH区的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹单抗的VL区的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体竞争结合和/或结合CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，抗体与上述抗体具有至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹单抗至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。

4.手术

大约60％的癌症患者将接受某种类型的手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性手术。治愈性手术包括切除术，其中全部或部分癌组织被物理去除、切除和/或破坏并且可以与其他疗法联合使用，例如本实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法。肿瘤切除是指物理去除肿瘤的至少一部分。除肿瘤切除术以外，手术治疗还包括激光手术、冷冻手术、电外科和显微控制手术(莫氏手术)。

在切除部分或全部癌细胞、组织或肿瘤后，可在体内形成空腔。治疗可以通过灌注、直接注射或区域局部应用另外的抗癌疗法来完成。此类治疗可重复，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以是不同的剂量。

5.其他药剂

考虑其他试剂可与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的疗效。这些另外的试剂包括影响细胞表面受体的上调和GAP连接的试剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附的抑制剂、增加过度增殖细胞对凋亡诱导剂的敏感性的试剂或其他生物试剂。通过提高GAP连接的数量来增加细胞间信号传导会增加对邻近过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其他实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可与本实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖功效。考虑细胞粘附的抑制剂以提高本实施方案的功效。细胞粘附抑制剂的示例是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。

IV.制品或试剂盒

本文还提供了包含pDicer1抗体的制品或试剂盒。制品或试剂盒还可包括包装插页，该插页包括使用抗体治疗或延缓个体中癌症进展的说明书。本文所述的任何抗体或组合疗法可包括在制品或试剂盒中。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋和注射器。容器可由多种材料形成，例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)或金属合金(例如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中，容器容纳制剂以及容器上或与容器相关联的标签可表明使用说明。制品或试剂盒还可以包括从商业和用户角度看需要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和带有使用说明书的包装插页。在一些实施方案中，制品还包括一种或多种另外的试剂(例如，化疗剂和抗肿瘤剂)。一种或多种试剂的合适容器包括例如瓶子、小瓶、袋和注射器。

V.实施例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表了发明人发现的在本发明的实践中发挥良好作用的技术，因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，本领域技术人员根据本公开内容应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或相似的结果。

实施例1–Dicer1磷酸化的作用

丝氨酸1705或1712和丝氨酸1833或1836处的Dicerl磷酸化和细胞核易位由蠕虫和小鼠中KRas信号传导通路下游的Erk介导(Drake等人，2014)。具体而言，小鼠中在丝氨酸1836处的磷酸化足以导致细胞核易位并加速小鼠衰老。为了确定人类肿瘤中在丝氨酸1852处(对应于小鼠中丝氨酸1836处)的DICER1磷酸化是否与肿瘤进展相关，在组织微阵列中使用抗磷酸-Ser1852-DICER1(克隆25)和磷酸-ERK通过免疫组织化学，在具有增加的KRAS或激素信号传导的54例子宫内膜样子宫内膜癌中检查DICER1磷酸化状态。由于没有获得DICER1丧失的子宫内膜肿瘤，首先测试了来自DICER1综合征患者的两个胸膜肺母细胞瘤(PPB)肿瘤，以进一步测试抗磷酸-Ser1852-DICER1，克隆25抗体在人类肿瘤中的特异性。已发现DICER1在肺上皮中不存在，但在间充质中呈阳性，在研究的7例(包括此处测试的两个肿瘤)的6例中与PPB相关，这些研究来自携带生殖系DICER1突变的患者(Hill等人，2009)。识别磷酸化的丝氨酸1852的磷酸-Ser1852-DICER1(克隆25)抗体对PPB肺肿瘤的间充质染色呈阳性，并且在上皮细胞中呈阴性(图1A)，证明磷酸-Ser1852-DICER1克隆25对人类肿瘤中的DICER1蛋白具有特异性。此外，在丝氨酸1852处的磷酸化使DICER1成为细胞核的，如前所示。

然后将该抗体用于测定54个子宫内膜样肿瘤，这些肿瘤基于先前的微卫星不稳定性分析(Billingsley等人，2015)呈现完整DNA错配修复(MMR)，因此预计在这些肿瘤中没有主要的MMR依赖性遗传或表观遗传变化影响分子分析。此外，具有完整MMR通路的子宫内膜瘤不存在DICER1突变，这通常与POLE突变相关联(Billingsley等人，2015)。为了检查这些肿瘤中磷酸-DICER1的状态，使用识别磷酸化的丝氨酸1852的磷酸-Ser1852-DICER1(克隆25)(图1B-C)。每个含有>10％的细胞具有磷酸-Dicer或磷酸-ERK信号的肿瘤被称为阳性(图1B)。据观察，63％(32/51)的子宫内膜样肿瘤(三个病例由于每个肿瘤检查的5个中>2个丢失核心而未进行评估)对于磷酸-Dicer1是阳性的(图1B)。总体而言，对磷酸-Dicer是阳性的肿瘤中84％对于磷酸-ERK也是阳性的(27/32)，并且5例对于磷酸-ERK(细胞核或细胞质)是阴性的。磷酸-Dicer阳性细胞的分布与磷酸-ERK不完全重叠，这可能表明由于存在不同的磷酸酶，磷酸-ERK转换与磷酸-Dicer转换的动力学。对磷酸-Dicer1是阳性的五个肿瘤对于磷酸-ERK没有阳性信号(>10％的细胞)。这可能表明Dicer1可以被额外的MAPK磷酸化，或者磷酸-Dicer1的持久性比磷酸-ERK更长。为了剖析子宫内膜样子宫内膜癌中磷酸-DICER1水平与临床病理特征之间的关系，每个含有少于50％的细胞具有磷酸-Dicer1的肿瘤被归类为Dicer1磷酸化的“低至中”(n＝35)，含有超过50％的细胞具有磷酸-Dicer1的肿瘤为Dicer1的“高”(n＝16)。高磷酸-Dicer1与较低的体重指数(p＝0.002)和深肌层侵袭(p＝0.03)相关联(图1D，表1)。此外，还有一种趋势是，在具有高磷酸-Dicer1的肿瘤中，淋巴管间隙侵袭(p＝0.06)的存在更高。深肌层侵袭和增加的淋巴管间隙侵袭是这些癌症预后不良的特征。总之，这些数据表明细胞核磷酸化的Dicer1的存在与子宫内膜肿瘤侵袭相关。

表1.肿瘤磷酸-DICER1状态与人口统计学和临床病理学变量之间的关联。

*费舍尔精确检验

3例缺失BMI(体重指数)数据。LVSI(淋巴管间隙侵袭)

为了确定磷酸化的Dicerl是否可以在体内驱动肿瘤进展，通过用天冬氨酸替换Ser1712和Ser1836(对应于人丝氨酸1728和1852)来生成Dicerl敲入小鼠模型，天冬氨酸模拟磷酸化并使蛋白质不受磷酸酶去磷酸化的影响，因此是“组成性磷酸化”的模型。Dicer1丝氨酸1712和1836在内源性位点被天冬氨酸(Dicer2SD)替换。两种丝氨酸在小鼠模型中都被替换，以模拟在人类肿瘤中观察到的长期组成性磷酸化。Dicer1磷酸-模拟突变的纯合性导致高外显率产后致死率(high penetrance post-natal lethality)(78％)，少数幸存者不育，显示加速的老化表型。然而，杂合突变体在表型上是正常的。

根据对肿瘤中存在磷酸-DICER1的观察，检查磷酸-Dicer1是否可以在两个独立的癌症模型中调节肿瘤进展。为了独立于纯合突变体显示的发育致死性评估癌症表型，在携带KRas+/LA1和p53+/-突变的两种不同癌症模型中使用了杂合Dicer2SD小鼠。

KRasLA1等位基因由含有KRasG12D突变的重复外显子1组成，其经历重复的外显子1(10^-3至10^-7个细胞)的自发重组，产生野生型或突变等位基因(Johnson等人，2001)。该模型产生从一周龄开始的完全渗透性多灶性肺癌和因小鼠背景而异的低频胸腺淋巴瘤。选择这种肿瘤模型是因为Dicer1的杂合性与KRasG12D病变协同作用以驱动小鼠中肺癌的发展；并测定了杂合的Dicer2SD是否会加剧KRAS等位基因作为一个磷酸-模拟Dicer1等位基因来产生组成性磷酸化的Dicer1蛋白，并且第二个可以在磷酸化时由KRAS调节(Kumar等人，2009)。在此背景下，与在研究的400天终点未达到中位年龄的KRas+/LA1小鼠相比，KRas+/LA1；Dicer+/2SD小鼠发展了广泛的肿瘤并且具有显著降低的353天中位存活期(p＝0.03，图2A)。KRas+/LA1小鼠仅发展了肺腺瘤/腺癌(16/17)。KRas+/LA1；Dicer+/2SD小鼠也发展了肺腺癌(21/24)；然而，58％的小鼠(14/24)发展了继发性肿瘤，其中包括21％的淋巴瘤(5/24，包括3只没有肺腺癌的动物)、25％的组织细胞肉瘤(6/24)和各一只肝细胞癌、间皮瘤、内皮细胞肿瘤、血管肉瘤和血管瘤(图2B和2C)。值得注意的是，来自KRas+/LA1；Dicer+/2SD小鼠的淋巴瘤和组织细胞肉瘤散播到所有受影响小鼠的多个器官中，包括肺、肝、心、肾、脾和胸腺(图2C)。在一个KRas+/LA1；Dicer+/2SD小鼠中，肺腺癌转移到肾脏和心脏中(图4)。

为了确定磷酸-模拟Dicer1蛋白是否表现为组成型磷酸化的蛋白，使用磷酸-Dicer1对来自每个基因型的每个肺组织进行免疫荧光。杂合Dicer S2D等位基因或KRASLA1等位基因几乎不存在磷酸-Dicer信号(图2D)。如所预期的，使用抗体时，纯合Dicer-S2D肺细胞呈100％阳性信号，并且具有磷酸-Dicer信号的所有细胞显示细胞核定位。KRas+/LA1；Dicer+/2SD肺切片揭示70％以上的细胞具有磷酸-Dicer(针对小鼠磷酸化的Dicer1蛋白的多克隆抗体)细胞核的阳性信号，表明KRAS信号传导增加导致该模型中Dicer磷酸化和细胞核易位增加(图2E)。这些结果表明磷酸-模拟Dicer1与癌基因KRasG12D协同作用，导致广谱的肿瘤和转移。

TP53丧失与许多人类肿瘤中的DICER1突变和激活的KRAS通路相关联(Kumar等人，2009年；Pugh等人，2014；Rakheja等人，2014年)。为了测试磷酸化的Dicer1是否足以促进p53杂合背景下的肿瘤发生，随后将Dicer2SD等位基因引入主要发展骨肉瘤和淋巴瘤的p53+/-小鼠中(Jacks等人，1994年)。类似于KRas+/LA1；Dicer+/2SD模型，与在本研究中使用的在540天终点未达到中位年龄的p53+/-小鼠(n＝19)相比，p53+/-；Dicer+/2SD小鼠(n＝32)展示出降低的中位存活期497天(p＝0.07，图3A)。

此外，与p53+/-小鼠相比，p53+/-；Dicer+/2SD小鼠展现出广谱的肿瘤，无瘤存活期显著降低(p＝0.03，图3B)。71％(15/21)的p53+/-；Dicer+/2SD小鼠发展出肿瘤，相比于25％(3/12)的p53+/-小鼠发展出肿瘤(图3B和3C)。与仅发展骨肉瘤(n＝2)和淋巴瘤(n＝1)的p53+/-小鼠相反，p53+/-；Dicer+/2SD小鼠的肿瘤谱包括骨肉瘤(n＝6)、淋巴瘤(n＝6)、组织细胞肉瘤(n＝2)、血管肉瘤、肺腺癌、肝细胞癌、睾丸癌和两个未分化肿瘤(图3D)。24％的p53+/-；Dicer+/2SD小鼠(5/24)显示多种癌，包括一只发展骨肉瘤、淋巴瘤和腺癌的小鼠(图3C-D)。有趣的是，淋巴瘤、组织细胞肉瘤和睾丸癌如先前在KRas+/LA1；Dicer+/2SD小鼠中所观察到的那样被散播到许多器官。p53+/-小鼠中没有发展多种癌。

翻译后修饰的Dicer1在肿瘤发生中的作用尚不清楚。本研究首次证明Dicer1的磷酸化与两种不同的致癌病变KRas+/LA1和p53+/-合作，从而驱动肿瘤发生增加、多样的肿瘤谱和转移。此外，高百分比的小鼠中发展多种癌症表明磷酸-Dicer1不仅在肿瘤的发生和散播中发挥作用，而且使得多种细胞类型对肿瘤发展致敏。最后，这些在小鼠中的观察结果与磷酸-DICER1之间的相关相结合，使用单克隆抗磷酸-丝氨酸1852-DICER1抗体揭示人类中丝氨酸1852处的DICER1磷酸化与侵袭性子宫内膜癌特异相关，表明组成型Dicer1磷酸化促进肿瘤侵袭和转移。

实施例2–材料和方法

小鼠育种、维持、筛选和基因分型：小鼠维持在>90％C57BL/6背景中。所有的小鼠研究都是按照机构动物护理和使用委员会的方案进行的。活的小鼠在三周龄时断奶，收集耳组织活检。组织用裂解缓冲液(1X PCR缓冲液，1％Triton X，250μg/μL蛋白酶K)在55℃过夜，并在95℃加热15分钟使蛋白酶K变性。将2μL的裂解组织提取物用于PCR反应以扩增1Kb区域的靶向位点。对PCR产物进行凝胶纯化和桑格测序，以鉴定靶位点处的任何插入缺失。

磷酸化的DICER1 Ser1852抗体：为了在人类肿瘤中检测磷酸化的Dicer，产生了针对人DICER1肽VPR[pS]PVREL的小鼠单克隆抗体。[pS]是人类DICER1中磷酸化的丝氨酸1852。抗体是在MD-Anderson小鼠抗体机构中产生的，通过使用以下肽序列：半胱氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-磷酸丝氨酸-脯氨酸-缬氨酸-精氨酸-谷氨酸-亮氨酸免疫3只BALBC小鼠(于小鼠脚垫中)。将半胱氨酸添加到肽的C末端以使得与KLH缀合用于产生单克隆抗体的融合。五轮注射后，将小鼠放血并在ELISA测定法中对血清测试针对肽的应答。将免疫应答性小鼠的淋巴结排出，并将浆细胞与小鼠骨髓瘤对应物进行融合。将融合(细胞)接种在96孔板上，并在9天后，选择来自85个克隆的上清液并针对磷酸-Dicer Ser1852肽、非磷酸化的DICER1 Ser1852肽(该肽与磷酸-肽Ser1852相同，只是丝氨酸未磷酸化)和独特的磷酸-肽进行筛选，所述独特的磷酸-肽作为对照以排除抗体只检测到带负电的磷酸化位点。85个克隆中有59个产生了高到中等程度的特异性结合pSer1852-DICER1肽，而没有与未磷酸化的Ser1852-DICER1肽或随机磷酸-肽结合。用免疫荧光法和western分析测试2个克隆(25号和124号克隆)对Dicer人胚胎肾细胞(HEK)的特异性。25号克隆对磷酸化的人DICER1非常敏感和特异，并且在丝氨酸25处的磷酸化足以检测细胞核中的DICER1(如先前用针对线虫DCR-1表位产生的多克隆磷酸-Dicer抗体所示)。然后通过单克隆抗体机构以1mg/ml的浓度纯化25号克隆，并以1:200稀释度用于免疫组织化学和免疫荧光。然后在来自胸膜肺母细胞瘤患者的人类肿瘤上测试磷酸-Ser1852-DICER1单克隆抗体25号克隆，对于人类肿瘤的特异性其在上皮中对于DICER1为阴性，但在间质中为阳性(图1A)。发现抗磷酸-Ser1852-DICER1，25号克隆在PPB间质中阳性检测到细胞核DICER1，但在上皮细胞中没有检测到，如所预期的，这表明该抗体对人类肿瘤中的DICER1磷酸化是特异性的(图1)。

使用组织微阵列对人类子宫内膜肿瘤进行免疫组织化学：在54例原发性子宫内膜样子宫内膜癌病例的肿瘤微阵列(TMA)上进行免疫组织化学。这些是未经治疗的肿瘤样品。从福尔马林固定肿瘤的石蜡块中的活肿瘤组织区域获得四个独立的核心。纳入TMA的区域由妇科病理学家(DFC)确定。然后如前所述创建肿瘤微阵列(Fedor和De Marzo，2005)。先前已经描述了组织微阵列构建的实用方法(Fedor和De Marzo，2005)。获得TMA块的5微米切片，并对抗磷酸-Ser1852-DICER1、25号克隆(2块)(如上所述产生，1:200稀释)和抗磷酸-ERK(2块)进行染色。用抗磷酸-ERK(Thr 202/Tyr 204，#9101S，兔抗人，Cell SignalingTechnology，Inc.，Danvers，MA，1:100稀释)进行磷酸-ERK染色。然后将载玻片孵育MACH2Universal聚合物HRP(#M2U522H，BioCare Medical，LLC.，Concord CA)。用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)底物DAB+Liquid(#K3468，Dako Cytomation，Carpinta，CA)产生信号。载玻片由两位不知情的独立检查者(BJR和DFC)读取。对每种抗体的染色进行审查，并记录为具有细胞核染色的细胞百分比和具有细胞质染色的细胞百分比。这些百分比在检查者之间取平均值。

小鼠肿瘤研究：将杂合的Dicer2SD等位基因杂交到KRas+/LA1肿瘤模型中，该模型特异性地发展具有100％外显率的肺肿瘤。产生包括21只KRas+/LA1小鼠和36只KRas+/LA1；Dicer+/2SD小鼠的群组。对群组进行400天的监测。对濒临死亡的动物实施安乐死，并采集它们的组织。处死在400天时仍存活的动物，并收集其组织进行病理学检查。由于非肿瘤相关问题(皮炎、直肠脱垂)而实施安乐死的动物不包括在研究内。收集来自17只KRas+/LA1小鼠和24只KRas+/LA1；Dicer+/2SD小鼠的组织用于病理学检查。组织切片在组织可用时制备，并在所有样品准备好时一起检查。

同样，将突变的Dicer等位基因引入p53+/-驱动的肿瘤模型。产生包括19只p53+/-小鼠和32只p53+/-；Dicer+/2SD小鼠的群组。对群组进行540天的监测。对濒临死亡的动物实施安乐死，并采集它们的组织。处死在540天时仍存活的动物，并且收集其组织用于病理学检查。由于非肿瘤相关问题(皮炎、直肠脱垂)而实施安乐死的动物不包括在研究内。收集来自12只p53+/-小鼠和21只p53+/-；Dicer+/2SD小鼠的组织用于病理学检查。组织切片在组织可用时制备，并在所有样品准备好时一起检查。

组织病理学：将从小鼠收获的组织在10％中性缓冲福尔马林中固定，并石蜡包埋。用苏木精和伊红对4微米的切片进行染色，并通过光学显微镜进行检查。组织处理、石蜡包埋、切片和H&E染色由MD Anderson Department of Veterinary Medicine&SurgeryHistology Laboratory进行。

统计分析：使用GraphPad Prism 7软件进行学生t检验、费舍尔精确检验和Kaplan-Meier存活分析。采用对数秩(Mantel-Cox)检验计算p值，并且认为p<0.05具有统计学意义。

免疫荧光染色：将从小鼠收获的组织在10％中性缓冲福尔马林中固定，并石蜡包埋。组织处理、石蜡包埋、切片由MD Anderson Department of Veterinary Medicine&Surgery Histology Laboratory进行。用磷酸-Dicer特异性抗体(1:200，内部产生)和DAPI(用于标记DNA)进行免疫荧光以检测Dicer的磷酸化状态。对于每种基因型，在整个载玻片上捕获50张63X的图像。每幅图像捕获200-500个细胞。为了避免偏差，染色和图像捕获和分析是以盲的方式进行。

实施例3–磷酸化的Dicer1的进一步表征

小鼠中Ser1836处的磷酸化损害Dicer1功能：为了检查哺乳动物中对Dicer1功能的磷酸化介导的调节的作用，产生了三种磷酸-模拟Dicer1敲入小鼠模型(图5A，5B)。用CRISPR/Cas9技术产生用天冬氨酸替换Ser1712(Dicer^S1712D)的小鼠。用传统ES细胞技术获得用天冬氨酸替换Ser1836(Dicer^S1836D)以及用天冬氨酸替换Ser1712和Ser1836两者(Dicer^2SD)的小鼠。此外，CRISPR/Cas9介导的靶向也导致产生具有从位置1712位置开始的移码截短(Dicer^-)和密码子1712的3bp框内缺失(Dicer^Δ1712)的Dicer1等位基因。

Dicer1-空小鼠在E7.5具有胚胎致死性(Bernstein等人，2003)。为了确定磷酸-模拟Dicer1等位基因是否模拟Dicer1活性的丧失，在产生的每个等位基因的纯合突变小鼠中测定致死率。Dicer^{S1712D/S1712D}和Dicer^{Δ1712/Δ1712}小鼠以预期的孟德尔比率出生(图5B)。正如所料，Dicer^-/-小鼠是胚胎致死的。Dicer^{S1836D/S1836D}突变体出生，但只有11％的后代(11/103)在断奶时是纯合突变体，而不是预期的25％频率，表明了部分致死性(p＝0.003，图1B)。与Dicer^{S1836D/S1836D}小鼠一样，Dicer^2SD/2SD小鼠也是部分致死的，因为断奶时只有7％的后代(8/115)是纯合突变体(p<0.001)。对来自Dicer^+/2SD杂合子杂交的E18.5胚胎的检查揭示纯合突变胚胎是可存活的。在所检查的42个胚胎中，10个为野生型，22个为杂合型，并且10个为纯合突变体。E18.5胚胎的组织病理学检查未揭示在纯合突变体的任何缺陷；然而，在出生后4天内观察到死亡的幼崽，这些幼崽基因分型为纯合突变体，表明其致死性是产后的。综合起来，这些数据揭示在Ser1836处的组成型磷酸化损伤Dicer1功能，并导致产后致死性。

接下来，通过在每个突变背景上引入空等位基因，检查突变Dicer1等位基因是否在功能上是亚效等位基因。Dicer^S1836D/-和Dicer^2SD/-小鼠不能存活，而Dicer^S1712D/-和Dicer^Δ1712/-突变体可存活。这些数据表明，Ser1712的组成型磷酸-模拟或缺失似乎对Dicer1功能没有影响，而在Ser1836处的磷酸-模拟足以改变Dicer1功能并产生致命后果。

研究表明，Dicer1丧失激活p53通路(Mudhasani等人，2008)。因此，通过在Dicer^2SD/2SD背景中同时缺失p53，对Dicer^2SD/2SD小鼠的产后致死性是否依赖于p53进行了基因测试。在来自Dicer^+/2SD p53^+/-互交出生的72个后代中，没有Dicer^2SD/2SD p53^-/-(p＝0.01)。这一结果表明，p53的丧失并不能挽救Dicer^2SD/2SD小鼠中的产后致死性，提示了一种导致致死性的不同通路。

在Ser1836处的组成型Dicer1磷酸化导致生长迟缓和不育：为了确定产后致死性存活的Dicer^{S1836D/S1836D}和Dicer^2SD/2SD小鼠是否显示发育缺陷，广泛地对幸存者进行表征并发现多个显著缺陷。这些缺陷中最明显的是生长迟缓。与其野生型性别匹配的幼崽相比，雄性和雌性Dicer^{S1836D/S1836D}和Dicer^2SD/2SD幸存者显示出体型减少35-50％，并且生长迟缓表型在其整个寿命内持续存在(图5C和5D)。Dicer^{S1836D/S1836D}和Dicer^2SD/2SD小鼠也显示出经由将纯合突变雄性与野生型雌性进行合笼所测定的生育缺陷，反之亦然。Dicer^{S1712D/S1712D}和Dicer^{Δ1712/Δ1712}小鼠可育并且每窝产8-9个后代(图5E)；然而，Dicer^{S1836D/S1836D}和Dicer^2SD/2SD小鼠(雄性和雌性)没有产生任何后代(图5E)。这些结果提示，在Ser1836处的组成型Dicer1磷酸-模拟足以驱动早期产后致死性、延缓生长和引起不育。与Dicer^{S1836D/S1836D}小鼠相比，Dicer^2SD/2SD小鼠表现出类似的表型，其数量级更大(增加的产后致死性和生长迟缓)。因此，从这一点出发，对Dicer^2SD/2SD小鼠进行了重点研究。

在丝氨酸1712和1836处的组成型Dicer1磷酸化驱动了加速衰老表型：通过以下几个标准来评估小鼠的老化表型：包括生长迟缓、不育、降低的存活率、脊柱后凸(脊柱弯曲)、骨质疏松、皮肤萎缩、心肌病、肌肉营养不良、减少的脂肪量、贫血和脱发(Gurkar和Niedernhofer，2015年；Harkema等人，2016年；Koks等人，2016年；Reiling等人，2014年；Treiber等人，2011年。由于Dicer^2SD/2SD小鼠显示生长迟缓、不育和早期致死性，提示加速衰老，因此，在这些小鼠中还检查了加速衰老的其他表型。对突变型和野生型小鼠老化时的检查揭示，与野生型同窝幼崽的正常姿态相比，从6个月龄开始的Dicer^2SD/2SD小鼠的驼背姿势明显(图6A)。7-9月龄Dicer^2SD/2SD小鼠和野生型小鼠的定量显微计算机断层成像(显微-CT)扫描证实，突变小鼠相对于野生型小鼠的显著脊柱后凸(脊柱后凸指数分别＝2.5和3.7，p＝0.02，图6A和6B)。显微-CT扫描还揭示，与野生型小鼠相比，Dicer^2SD/2SD小鼠中骨质疏松严重，突变小鼠脊柱中骨体积分数(38％对比65％，p＝0.0003，图6C)以及骨矿物质密度(347mg/cc对比420mg/cc，p＝0.008，图6D)显著降低。股骨和胫骨的组织病理学检查显示，突变小鼠中骨髓早在2月龄就被脂肪细胞侵袭，并且到9月龄时脂肪细胞替换大部分造血细胞(图6E、6F和6A)。在突变小鼠整个骨骼中也观察到骨质损失(图6A和6E)。由于造血细胞主要存在于小鼠骨髓中，因此对突变动物检测造血功能受损。全血计数分析显示与野生型相比，Dicer^2SD/2SD小鼠中血小板计数无变化(p＝0.89)，总白细胞计数减少33％(4.18对比6.22 10³/μL，p＝0.01)和红细胞计数减少15％(8.6对比10.3 10⁶/μl，p＝0.007)(图7B)。这些结果提示，磷酸-模拟Dicer1明显影响骨骼完整性和骨髓脂肪生成，与造血功能减少相关。

在显微镜下检查来自Dicer^2SD/2SD和野生型小鼠的多个器官以测定组织变性。与先前对突变小鼠不育的观察一致，来自2-7月龄的突变小鼠的睾丸切片缺少成熟精子，并且与野生型小鼠相比，具有减少数量的间质细胞(图6F)。同样，来自纯合突变小鼠的卵巢体积缩小，含有更少的卵泡，并且卵巢实质的大部分由空泡细胞构成(图6F)。突变小鼠的表皮薄，组织结构异常，并且皮下脂肪组织的量减少(图6F)。6月龄以上的突变体一直缺乏腹部脂肪。幼年的Dicer^2SD/2SD小鼠(1-2月龄)也发展出中性粒细胞性结膜炎，并随着小鼠年老，偶尔发展出角膜病变。此外，在突变体中，生殖组织包括前列腺、精囊和子宫的体积减小并且副性腺含有更少的分泌物质。在一些突变小鼠中还观察到慢性心肌病、膜增生性肾小球肾炎、肝细胞核巨大、肺支气管相关淋巴组织(BALT)增生。BALT增生和膜增生性肾小球肾炎表明非特异性慢性免疫刺激。由于这些病变表明Dicer^2SD/2SD小鼠的多个器官中慢性免疫刺激，因此怀疑突变小鼠可能改变了循环中的血清酶。血液化学分析揭示突变小鼠中天冬氨酸转氨酶(729对比136U/L)、丙氨酸转氨酶(703对比63U/L)和碱性磷酸酶(202对比100U/L)水平升高(图7C)。Dicer^2SD/2SD小鼠中存在的所有表型在Dicer^{S1836D/S1836D}小鼠中也很明显，尽管严重程度较低。这些结果共同提示，磷酸-模拟Dicer1破坏了正常组织功能，导致不育、组织萎缩和常与衰老相关的变化，包括骨质疏松、造血减少和骨髓脂肪生成增加。

加速老化的最终结果是寿命缩短。虽然所有Dicer^+/+和Dicer^{S1712D/S1712D}小鼠在本研究的540天时间点仍然存活，但Dicer^2SD/2SD和Dicer^{S1836D/S1836D}小鼠的中位存活分别为236天和302天(p＝0.0001，图6G)。与先前观察到的Dicer^2SD/2SD小鼠表现出比Dicer^{S1836D/S1836D}小鼠更大幅度的表型相一致，Dicer^{S1836D/S1836D}和Dicer^2SD/2SD小鼠之间的总存活差异也是统计学显著的(p＝0.02)。总之，这些结果揭示了在Ser1836处的组成型Dicer1磷酸-模拟，或双磷酸-模拟，驱动加速老化表型，并进一步支持磷酸化改变Dicer1功能的假说。

磷酸化改变Dicer1定位：因为磷酸化导致Dicer1在秀丽隐杆线虫中的细胞核定位，在突变型和野生型睾丸中检查Dicer1的定位。在来自野生型和突变型小鼠的睾丸切片上使用Dicer1抗体的免疫荧光染色揭示，Dicer1蛋白在Dicer1染色阳性的3％的野生型小鼠、10％的Dicer^{S1712D/S1712D}、30％的Dicer^{S1836D/S1836D}和100％的Dicer^2SD/2SD的精母细胞的细胞核中累积(图8A和8B)。采用严格的标准，细胞核内Dicer1蛋白水平低(<50％的细胞核表面)的精母细胞被认为对于细胞核积聚是阴性的，在定量过程中将没有被Dicer1抗体染色的细胞排除在外。肾脏和肝脏切片中也证实Dicer^2SD/2SD的细胞核积聚。这个结果提供了两个见解。第一，在这两个位点的磷酸化对于Dicer1蛋白的有效细胞核易位至关重要。第二，Ser1836处的磷酸-模拟突变，伴随大多数细胞的细胞质Dicer1蛋白，足以驱动小鼠的观察到的表型。这表明无论细胞核定位的程度如何，Ser1836处的磷酸-模拟足以损害Dicer1功能。

在丝氨酸1712和1836处的组成型Dicer1磷酸化改变了代谢性miRNA的子集：为了确定在丝氨酸1712和1836处的Dicer1磷酸化是否改变了其典型的miRNA加工功能，通过对小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和野生型及Dicer^2SD/2SD小鼠睾丸进行下一代深度测序，鉴定成熟miRNA。对MEF进行分析，以确定大体病理表现前最早的分子变化。对睾丸进行分析，因为在这个组织中观察到随着动物年龄增长明显的形态学变化。

与野生型样品相比，发现来自Dicer^2SD/2SD小鼠的MEF和睾丸样品中的miRNA子集均下调(图8C)。在MEF和睾丸中分别表达的359和368个miRNA中，突变MEF中的49个miRNA(14％)和突变睾丸中的52个miRNA(14％)下调超过2倍(平均>8倍)。在突变MEF中49个下调的miRNA中，只有17个miRNA在睾丸中表达，并且这17个miRNA中的16个(94％)在两种组织中都下调(图8D)。同样，在突变睾丸中52个下调的miRNA中，39个在MEF中表达，并且在这39个miRNA中16个(41％)在两种组织中都下调(图8D)。这种重叠强烈地提示Dicer1中的磷酸-模拟突变调节了miRNA子集的产生。对突变睾丸中差异下调的miRNA的通路分析强调代谢通路是最受影响的(图8E)。对来自MEF的差异下调miRNA的通路分析也导致对代谢通路的鉴定，进一步强调了对受影响miRNA的失调加工的特异性。因为衰老与代谢的改变有关；这些结果表明代谢相关miRNA的下调可能是突变小鼠中加速衰老表型背后的驱动力(27，28)。这导致对双磷酸-模拟Dicer1小鼠是否改变了代谢的研究。

在丝氨酸1712和1836处的组成型Dicerl磷酸化驱动高代谢表型：在Dicer^2SD/2SD突变体中鉴定下调的miRNA作为代谢通路的参与者表明这些小鼠中的代谢可能发生改变。为了确定代谢变化是否可能是Dicer^2SD/2SD突变体加速衰老表型的潜在原因，使用综合实验室动物监测系统(CLAMS)测试来测量3-4月龄的突变体小鼠和野生型同窝幼崽的活动和呼吸速率。观察到突变小鼠相对于野生型小鼠的平均耗氧率(OCR)显著增加(24％)(52.6对比42.3ml/kg/min，p＝0.04，图9A和9B)。这种差异在小鼠通常休息的亮时段更为明显(相对于野生型增加38％，52.7对比38.1ml/kg/min，p＝0.02，图9B)。与呼吸速率的增加类似，突变小鼠显示比野生型小鼠的轮活动增加50％(10,555对比7,057转)，并且在亮时段期间差异为2.5倍(4,605对比1,853转，图9C)。总之，这些结果表明，与野生型小鼠相比，Dicer^2SD/2SD小鼠在休息期间表现出增加的代谢率和极度活跃。

为了研究代谢变化是否先于表型表现，从突变型和野生型小鼠测定小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，并使用Seahorse Bioanalyzer测量它们的糖酵解和线粒体呼吸速率。与CLAMS测试的结果一致，与野生型MEF相比，Dicer^2SD/2SD MEF显示出在耗氧率(118.7对比88.6pmoles/min，p＝0.02)和细胞外酸化率(111.8对比84.4mpH/min，p＝0.04)中的统计学显著增加(图9D和9E)。这些结果表明，代谢率增加可能是Dicer^2SD/2SD小鼠在胚胎发育过程中最早出现的缺陷，并影响随后显现的缺陷。综上所述，这些结果表明磷酸-模拟Dicer1调节代谢通路，并提示代谢率增加可能是Dicer^2SD/2SD小鼠加速衰老表型背后的潜在机制。

研究表明，与先前描述的Dicer1亚效等位基因相比，磷酸-模拟Dicer1影响更广泛的组织和表型。这些结果表明磷酸化是哺乳动物中Dicer1功能的重要调节子，并且磷酸化介导的Dicer1功能和相关表型的改变不同于Dicer1空或亚效等位基因。因此，Dicer1磷酸化的失调可能与多种人类病理相关联，并且控制这一过程的药物干预可能具有深远的益处。

实施例4–材料和方法

小鼠模型的构建体设计和生成：靶向构建体设计为产生双磷酸-模拟突变体(在同一等位基因中的S1712D和S1836D)，有可能获得单个突变体。构建体包含插入Dicer1的内含子24中的floxed新霉素抗性基因(neoR)，具有5.9Kbp 5’同源臂和2.7Kbp 3’同源臂。5’臂包含S1712D突变(TCT–>GAT)，而3’臂包含S1836D突变(TCT–>GAT)。5’臂上的S1712D突变将同源区域分为4.2Kb外部区域和1.7Kb内部区域(以neoR为中心)。类似地，S1836D突变将3’臂分为2.0Kb的外部区域和0.7Kb的内部区域。当同源重组(HR)发生在两个同源臂的外部区域时，将引入两个突变并产生双突变体。另一方面，如果HR发生在一个同源臂的外部区域(引入突变)和另一个同源臂的内部区域(未引入突变)，则会产生单突变体。

构建体经完全测序并成功地电穿孔到TC1小鼠ES细胞中。使用5’和3’外部探针通过Southern印迹分析筛选新霉素抗性克隆。SpeI消化的基因组DNA用于Southern印迹筛选。阳性克隆通过对靶向区域的PCR和测序得到确认。将准确产生的两系ES克隆注射到囊胚中，然后将其植入假孕雌性以产生嵌合体。雄性嵌合体与C57BL/6雌性杂交，用于突变等位基因的种系传递。一个携带突变等位基因的雄性后代与携带Zp3-Cre转基因的C57BL/6雌性小鼠杂交以去除新霉素抗性基因。携带突变等位基因(无neoR)的雄性后代与野生型C57BL/6雌性杂交2代以上。

基于CRISPR/Cas9的基因靶向：如前所述(Aryal等人，2017)，选择靶位点，合成sgRNA，并向受精的受精卵注射sgRNA、Cas9 mRNA和包含突变的供体寡核苷酸。简而言之，使用crispr.mi t.edu工具将43个碱基的序列(靶密码子两侧各20个碱基)用于对所有可能的靶位点进行评分。选择得分高且在sgRNA种子区域包含诱变位点的位点进行靶向。还选择了具有PAM序列的六个可能的脱靶位点来筛选意外突变。

用于sgRNA合成的模板是通过使两个互补的寡核苷酸(如下列出的序列)退火而产生的。T7启动子序列加下划线，sgRNA靶位点加粗。

5’GAAATTAATACGACTCACTATAGACCCACGGCAGCATTCTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT3’(SEQ ID NO:17)。

将5μg的两种寡核苷酸混合在无核酸酶的水中，煮沸5-10分钟并在室温冷却2小时至过夜。200-400ng模板用于用MEGAshortscript Kit(Invitrogen AM1354)合成sgRNA，sgRNA通过酸性苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀(Invitrogen)进行纯化，重悬于70μl无RNase水中并根据制造商的方案使用Biospin P30色谱柱(#732-6223，Biorad)进一步纯化。在Tris-EDTA缓冲液(5mM Tris，0.1mM EDTA)中制备含有10ng/μl Cas9 mRNA(PrecisionX hspCas9SmartNuclease mRNA，System Biosciences)、7.5ng/μl的sgRNA和20ng/μl的供体寡核苷酸的最终注射溶液。将最终溶液注射到200-250个受精卵的原核中。然后将受精卵植入假孕小鼠(每只动物20-25个)。所有注射和植入均在MD Anderson基因工程化的小鼠设施中完成。

脱靶位点的选择和筛选：从crispr.mit.edu网站获得所有可能脱靶位点的列表。先前描述的标准(Aryal等人，2017年)用于选择用于筛选的位点。引物设计在所选位点约上游500个碱基和下游500个碱基处，并对该区域进行PCR扩增和桑格测序。

OTS1 Fwd:GCTCAGTGGCTGGCATATATG(SEQ ID NO:18)

OTS1 Rev:CCCAACTGCAGCTCCTTTG(SEQ ID NO:19)

OTS2 Fwd:GCCGTGATTTGGGACAAAAAG(SEQ ID NO:20)

OTS2 Rev:CCCCATAGGTGGGTTTGTATC(SEQ ID NO:21)

OTS3 Fwd:CCCCCATAGCTGGTTCAAAC(SEQ ID NO:22)

OTS3 Rev:GGCAACAAGGGCAGATACATG(SEQ ID NO:23)

OTS4 Fwd:CCTCTAGGCCTGTGATCAGAATAG(SEQ ID NO:24)

OTS4 Rev:GGCGGGTTAATGACTCATACAG(SEQ ID NO:25)

OTS5 Fwd:GGCTGGACATAGTTGTCTGTTG(SEQ ID NO:26)

OTS5 Rev:GCTCCACCTGGCTTCATTATC(SEQ ID NO:27)

OTS6 Fwd:GAGGACCGATGGTTGTGAAAAATC(SEQ ID NO:28)

OTS6 Rev:CCTGGCACCTAGGAGAATTTAG(SEQ ID NO:29)

小鼠繁育、维持、筛选和基因分型：小鼠维持在>90％C57BL/6背景中。所有小鼠研究均按照机构动物护理和使用委员会方案进行。活小鼠在三周龄时断奶，并收集耳活检。组织用裂解缓冲液(1X PCR缓冲液、1％Triton X、250μg/μL蛋白酶K)在55℃消化过夜，并在95℃加热15分钟使蛋白酶K变性。2μL裂解的组织提取物用于PCR反应以扩增靶向位点的1Kb区域。PCR产物经过凝胶纯化和桑格测序，以鉴定靶位点的任何插入缺失。

S1712D筛选引物Fwd:GTGCCAGGGATGTAGAAGAC(SEQ ID NO:30)

S1712D筛选引物Rev:GGGCTGCAGGAATTCGATATC(SEQ ID NO:31)

S1836D筛选引物Fwd:CACGTGGTACCTTAAGATGCATG(SEQ ID NO:32)

S1836D筛选引物Rev:GCGGGTGACTTGAACCTAAG(SEQ ID NO:33)

纯合存活力测试：对于每个突变等位基因，杂合小鼠同系交配并且在断奶时对后代进行基因分型。从五个Dicer^+/S1712D交配对中，在断奶时对十窝共85只后代进行了基因分型。从四个Dicer^+/Δ1712交配对中，在断奶时对八窝共68只后代进行了基因分型。从三个Dicer^+/-交配对中，在断奶时对五窝共28只后代进行了基因分型。从七个Dicer^+/S1836D交配对中，在断奶时对十四窝共103只后代进行了基因分型。从十对Dicer^+/2SD交配对中，在断奶时对十八窝共115只后代进行了基因分型。

E18.5胚胎解剖：Dicer^+/2SD和Dicer^+/S1836D杂合动物同系交配，并且每天早上检查阴栓(plug)。对阴栓呈阳性(E0.5)的雌性从该日期起18天(E18.5)进行安乐死。解剖子宫，分离每个蜕膜并放置在具有PBS缓冲液的10cm板中。解剖每个蜕膜以回收胚胎。对胚胎检查生存力，称重，安乐死，并收集尾部活检并进行基因分型。

体重测量：断奶的野生型(12只雄性和12只雌性)、Dicer^{S1836D/S1836D}(12只雄性和9只雌性)和Dicer^2SD/2SD(10只雄性和11只雌性)从出生后4周开始每周使用电子秤进行称重(至十分之一克)。当突变小鼠被安乐死时，它的同窝幼崽野生型小鼠也被处死。对于所有基因型，在所有时间点存在至少3只小鼠(雄性和雌性)。选择10个月作为终点是因为只有2只Dicer^2SD/2SD小鼠(一只雄性和一只雌性)在这个月龄之后存活下来。

生育测试：所有突变等位基因的8-12周龄纯合小鼠(雄性和雌性)与野生型小鼠(8-16周龄)交配。每天监测交配对并维持直到1-2窝出生。在断奶时计数并记录窝产仔数。在没有任何后代的情况下，每两个月用更年轻(8-16周龄)的野生型小鼠代替野生型动物，持续6个月。

显微-CT扫描：在MD Anderson癌症中心的小动物成像设施进行显微-CT扫描。简而言之，四只Dicer^2SD/2SD小鼠(两只雄性和两只雌性，6-8月龄)和它们的四只野生型同窝幼崽(两只雄性和两只雌性)使用异氟醚进行麻醉，固定并使用Explore Locus RS临床前体内扫描仪(GE Medical Systems)(其是一种锥形束体积CT系统，可以对啮齿动物进行活体成像)进行扫描。X射线源和基于CCD的探测器机架以大约1.0度的增量围绕对象旋转。几何模型由系统生成。MicroView软件用于创建阈值为700(Th700)和1000(Th1000)的等值面。脊柱的骨矿物质密度(BMD)和骨体积分数(BVF)的量化在Th700进行。脊柱后凸指数的计算方法如前所述(Laws和Hoey，2004)。

组织病理学和免疫荧光染色：如前所述，将从小鼠收获的组织固定在10％中性缓冲福尔马林中并且石蜡包埋。四微米切片用苏木精和伊红(H&E)染色，并通过光学显微镜检查。组织处理、石蜡包埋、切片和H&E染色由MD Anderson Department of VeterinaryMedicine&Surgery Histology Laboratory进行。选择的未染色切片用各自的抗体通过免疫荧光进行分析。使用了Total-Dicer1抗体(1:30，MABN461，EMD Millipore)和磷酸-Dicer特异性抗体(1:100，[Drake等人,2014])。手动进行睾丸切片中具有细胞核Dicer1的细胞的定量。使用用总Dicer1抗体和DAPI染色的组织切片。拍摄每个睾丸切片(来自野生型、Dicer^{S1712D/S1712D}、Dicer^{S1836D/S1836D}和Dicer^2SD/2SD小鼠的三个睾丸切片)的三个20X图像(不同区域)。使用ImageJ软件打开图像，并计数每个生精小管的精母细胞总数(DAPI的圆形细胞核染色，精细胞和精子被排除在外)。在>50％的细胞核中具有Dicer1染色的细胞被认为是细胞核染色阳性。为避免偏差，进行了盲法研究。

存活曲线：生成Dicer^{S1712D/S1712D}(n＝15)、Dicer^{S1836D/S1836D}(n＝21)、Dicer^2SD/2SD(n＝21)和野生型(n＝57)同窝幼崽小鼠的群组，并在断奶后(出生后三周)每天进行监测。将濒临死亡的动物进行安乐死并收获它们的组织。当突变小鼠被安乐死时，同窝幼崽对照小鼠也被安乐死。由于非濒临死亡的原因而必须被安乐死的小鼠被排除在研究之外。

MEF制备和细胞培养：Dicer^+/2SD杂合动物同系交配并且每天早上检查阴栓。对阴栓呈阳性(E0.5)的雌性从该日期起13天(E13.5)进行安乐死。解剖子宫，并分离每个蜕膜并放置在具有PBS缓冲液的10cm板中。解剖每个蜕膜以回收胚胎。从每个胚胎中去除胎儿肝脏、头部和四肢(收集用于基因分型)，将剩余的组织切碎并在37℃用胰蛋白酶处理5-10分钟。向每个样品中加入5mL补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM培养基，通过上下吹吸使细胞解离。细胞进行离心，用PBS洗涤，重悬于10mL培养基中，转移到10cm平板，在37℃孵育。每24小时更换培养基，并且当细胞达到汇合时，收获细胞并重新铺板(到3-4个板)。早期传代MEF(P2-P3)用于分析。

小RNAseq和通路分析：根据制造商的方案(Direct-zol RNA Miniprep plus,ZYMOL)提取和纯化来自睾丸和MEF的RNA，并提交给M.D.Anderson测序核心机构。使用Illumina TruSeq small RNA seq Kit制备条形码文库。文库在NextSeq500上进行测序。使用FASTQC对Illumina原始读数进行质量评估。

来自小鼠基因组组装GRCm38的1915个成熟miRNA序列从miRBase获得，并用作后续短读数作图的参考(Kozomara和Griffiths-Jones，2014)。使用SeqMan

版本14(DNASTAR,Inc,Madison,WI)中实施的接头扫描功能去除污染接头序列。从分析中丢弃中值质量低于phred＝30的序列。还使用SeqMan

进行了参考成熟miRNA的短读数作图，遵循如下说明：mer大小(mer的最小长度，在将读数组装成重叠群时需要被视为匹配的以碱基为单位的片段读数的重叠区域，)＝15；最小匹配百分比(指定连接重叠群中的两个序列所需的重叠中匹配的最小百分比)＝95％；和最小对齐长度(修剪后读数的至少一个对齐片段的最小长度)＝18。标记并组合重复序列。

使用

(DNASTAR Inc.,Madison,WI)对来自技术和生物学重复的作图数据进行统计分析。简而言之，使用RPM方法对作图数据进行标准化，并根据总RPM的log2计算野生型和突变体样品之间miRNA丰度的倍数变化(51)。观察到的差异的显著性由学生t检验确定，并且Benjamini-Hochberg校正用于多重假设检验；错误发现率(FDR)设置为0.05。使用欧几里得距离进行分层聚类。

最后，过滤掉两组(野生型和突变体)中小于10读数/百万的所有miRNA。过滤掉差异小于2倍且置信区间<95％的差异表达miRNA。从最终列表中，使用DIANATOOLS mirPathV.3软件对差异表达的miRNA进行通路分析。将miRNA列表上传到程序中，并使用三种不同的靶预测工具(TarBase、Targetscan和microT-CDS)进行分析。

CLAMS测试：简而言之，将四只Dicer^2SD/2SD小鼠(两只雄性和两只雌性)和两只野生型小鼠(一只雄性和一只雌性)饲养在单独的代谢笼中，适应两个小时，并且每分钟进行测量持续24小时。量热系统监测氧气消耗率和二氧化碳产生率。每个笼子中的自由运行轮记录活动发生的转数和一天中的时间。CLAMS系统还监测小鼠消耗的食物量，以及每餐的频率和持续时间。在实验开始和结束时对所有动物称重。

Seahorse代谢测定：根据制造商的方案(Seahorse Bioscience，XFe96培训手册)，将二代Dicer^2SD/2SD(n＝3)和野生型(n＝2)MEF用胰蛋白酶消化、计数并重新悬浮在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM培养基中至浓度为200个细胞/μl。将80μl每个MEF样品(6次技术重复)铺板到96孔板中，并在37℃孵育过夜。传感器盒在37℃与XF校准物水合过夜。第二天，将细胞洗涤并在非CO2培养箱中在37℃用测定特异性培养基(如手册中所述)孵育一小时。将传感器盒装入机器进行预校准，并准备好后装入带有细胞的板。进行3-5次测量(耗氧率和细胞外酸化率)。使用新的Dicer^2SD/2SD(n＝6)和野生型(n＝5)MEF重复该实验。对于数据分析，使用技术重复的平均值并将两个实验相组合。

统计分析：使用Prism 7软件(GraphPad Software)进行学生t-检验和Kaplan-Meier存活分析。P值<0.05认为是统计学显著的。

实施例5-磷酸化的人单克隆DICER1抗体作为侵袭性人癌症的生物标志物

进行研究以确定人单克隆抗磷酸化的Dicer1抗体是否检测人癌细胞中的Dicer1。具有BRAF600E突变的甲状腺乳头状癌细胞用针对S1852的抗磷酸化的单克隆Dicer1抗体以1:200进行染色。二抗抗小鼠488以1:500使用。这些研究证实磷酸化的Dicer1在甲状腺癌细胞是细胞核的。

为了确定Dicer1在癌症中是否被磷酸化，将单克隆抗体用于具有KRAS和FGF致癌突变且在POLE2或Dicer1中没有突变的子宫内膜癌。用组织微阵列测定了疾病等级增加的58个肿瘤。发现随着肿瘤等级的增加，Dicer1被磷酸化并在子宫内膜样子宫内膜癌中具有细胞核定位。磷酸化的Dicer1在1级子宫内膜样子宫内膜癌中呈阳性并且是细胞核的，但在3-4级子宫内膜样子宫内膜癌中发现程度更高。

在组织微阵列上用抗磷酸化的Dicerl单克隆抗体测试的54个子宫内膜样子宫内膜癌中，84％的肿瘤对磷酸-Dicerl呈阳性。为了确定肿瘤中pDICER1表达水平与子宫内膜样内膜癌的临床病理特征之间是否存在任何关系，将每个肿瘤分类为小于50％的pDicer1阳性细胞或大于50％(图10)。小于50％的肿瘤被归类为Dicer1磷酸化的“低至中”(n＝35)，具有大于50％细胞具有磷酸-Dicer1的肿瘤被归类为Dicer1的“高”(n＝16).

高pDicer1与较低的体重指数(p＝0.002)和深肌层侵袭(p＝0.03)相关(图10,表2)。此外，在pDicer1高的肿瘤中，也存在淋巴管间隙侵袭(p＝0.06)较高的趋势。深肌层侵袭和增加的淋巴血管间隙侵袭是这些癌症结果不良的特征。总之，这些数据表明细胞核pDicer1的存在与子宫内膜肿瘤侵袭相关。

表2：肿瘤细胞核DICER1状态与人口统计学和临床病理学变量之间的关联。

*费舍尔精确检验

3例缺失BMI(体重指数)数据

LVSI(淋巴血管间隙侵袭)

由于磷酸化的Dicerl可以标记侵袭性癌症，它可以用于对具有不同疾病等级的患者进行分层以进行治疗。因此，接下来的研究测定了由BRAF致癌突变而不是KRAS驱动的不同肿瘤类型。测定了BRAF600E阳性转移性黑色素瘤癌症。在肿瘤微阵列中测量黑色素瘤和良性痣样品中磷酸化的DICER1的表达。提供了四种单独的测量值，包括细胞核强度、细胞核百分比、细胞质强度和细胞质百分比。分析了四种不同类型的组织，包括无转移的原发性肿瘤、有转移的原发性肿瘤、转移和痣(良性)。

使用Cox比例风险回归模型评估磷酸化的DICER1表达与存活之间的关联。考虑了两种生存测量，包括总生存和无疾病生存。在四种组织类型中的每一种中分别进行分析。使用t检验在组织类型之间比较了磷酸化的DICER1表达。三个比较值得关注，包括有转移的原发性肿瘤对比无转移的原发性肿瘤、组合的有和无转移的原发性肿瘤加上转移对比良性痣，以及组合的有和无转移的原发性肿瘤对比转移。进行了类似的分析以比较溃疡与无溃疡、VGP与无VGP以及血管侵袭与无血管侵袭。Spearman等级相关分析用于评估连续参数Clark水平、Breslow厚度、年龄和肿瘤消退和DICER表达水平之间的关联。没有对测试的多样性进行正式调整(formal adjustment)。

磷酸化的DICER1表达与存活之间的关联：使用Cox比例风险回归分析评估磷酸化的DICER1表达与总体存活和无复发存活之间的关联。表3呈现了总体存活的结果。呈现了风险比和相应的95％置信区间，以及用于检验关联假设的p值。OS与pDICER1细胞核强度和转移性疾病的百分比相关。然而，对于具有转移的原发性样品，死亡患者的所有细胞质强度测量值均为0，因此无法拟合存活模型。进行Wi lcoxon秩和检验以评估死亡患者与存活患者的细胞质强度表达水平是否不同；该比较是统计学显著的(p＝0.017)。

表3：总体存活分析的结果。

pDICER1表达和组织类型之间的关联：使用t检验在组之间比较磷酸化的DICER1表达水平。表4呈现了无转移的原发性样品和有转移的原发性样品的比较结果。该表呈现了每组的平均值和标准差(SD)，以及样品数量和t检验的p值。有证据表明两组之间磷酸化的DICER水平的细胞核强度存在差异。

表4：无转移的原发性对比有转移的原发性。

表5呈现了所有黑色素瘤样品(原发性加转移)对比良性痣的比较结果。有大量证据表明，两组之间在细胞核强度和百分比方面存在磷酸化的DICER水平的差异，黑色素瘤样品中发现的水平更高。没有证据表明黑色素瘤和痣之间的细胞质强度和百分比存在水平差异。

表5：所有黑色素瘤(组合的原发性有和无转移加上转移)对比良性痣。

表6呈现了所有原发性黑色素瘤样品(有和没有转移)和转移样品的比较结果。原发性样品中细胞核强度和百分比的磷酸化的DICER1水平显著低于转移，而原发性样品中细胞质强度和百分比显著高于转移。

表6：组合的原发性对比转移。

表7提供了关于四个参数中每一个的溃疡和pDICER1表达水平之间关联的细节。为每组(溃疡和无溃疡)提供平均值、SD和N，以及来自t检验的p值。溃疡样品中的细胞核百分比显著高于非溃疡样品。

表7：溃疡和磷酸化的DICER1表达之间的关联。

表8总结了血管侵袭和pDICER1表达水平之间的关联。没有血管侵袭的患者的细胞质强度和百分比实质上更高。没有证据表明细胞核强度或百分比与血管侵袭相关联。仅有8名患者具有血管侵袭。

表8：血管侵袭和DICER表达之间的关联。

表9总结了VGP和DICER表达水平之间的关联。有轻微的证据表明VGP患者中的细胞核强度更高。

表9：垂直生长期(VGP)和DICER表达之间的关联。

在周围神经类别中只有一名患者，因此没有进行对pDICER1表达水平与周围神经变量之间的关联的分析。

磷酸化的DICER1单克隆抗体在注射到细胞中时用于中和磷酸化并阻断其作用。HEK293细胞(第5代)在转染前一天以3x10⁵个细胞/孔的密度接种到6孔板中。磷酸化的DICER1在用200ng FGF2处理30分钟后可见(参见Drake等人，Developmental Cell，2014)。磷酸化的DICER1在这些细胞中是细胞核的。磷酸化的DICER1在HEK293细胞中被FGF处理后是细胞核的。

为了在FGF孵育后将抗磷酸化的DICER1抗体注射到HEK293细胞中，使用细胞的2x6孔板。参数包括HEK293细胞，无FGF孵育，无抗磷酸-DICER1抗体注射；HEK293细胞，加FGF，无抗磷酸-DICER1抗体注射；和HEK293细胞，加FGF，加抗磷酸-DICER1抗体注射。由于这些是劳动密集型实验，每个实验只注射一个平板的细胞。

在FGF处理和模拟注射或注射抗磷酸-DICER1抗体后，用DAPI染色细胞以标记细胞核，并用抗半胱天冬酶3抗体染色以测定细胞死亡。由于注射的细胞数量少，未进行统计学分析。在抗磷酸化的DICER1处理组中，在每次处理用GFP抗体或抗磷酸化的DICER1抗体注射的10个细胞中，10个细胞中有8个对抗半胱天冬酶3呈阳性，而在对照组中10个细胞中有0个对抗半胱天冬酶3呈阳性。因此，磷酸化的DICER1抗体可用于阻断DICER1磷酸化和功能。

***

根据本公开内容，可以在没有过度实验的情况下做出和执行本文公开和要求保护的所有方法。虽然本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案进行了描述，但对本领域技术人员来说显而易见的是，可以在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，对本文描述方法和方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，明显的是某些化学和生理学相关的试剂可以替代本文所述的试剂，同时将获得相同或相似的结果。所有这些对本领域技术人员来说显而易见的类似替代和修改都被认为在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。

参考文献

下面的参考文献以它们为文本所示提供示例性程序或其他细节补充的程度通过引用具体并入本文。

美国专利申请号2004/0126828

美国专利申请号2002/0172677

美国专利号3,817,837

美国专利号3,850,752

美国专利号3,939,350

美国专利号3,996,345

美国专利号4,196,265

美国专利号4,275,149

美国专利号4,277,437

美国专利号4,366,241

美国专利号4,469,797

美国专利号4,472,509

美国专利号4,606,855

美国专利号4,703,003

美国专利号4,742,159

美国专利号4,767,720

美国专利号4,816,567

美国专利号4,867,973

美国专利号4,938,948

美国专利号4,946,778

美国专利号5,021,236

美国专利号5,091,513

美国专利号5,164,296

美国专利号5,196,066

美国专利号5,223,409

美国专利号5,403,484

美国专利号5,420,253

美国专利号5,565,332

美国专利号5,571,698

美国专利号5,627,052

美国专利号5,656,434

美国专利号5,770,376

美国专利号5,789,208

美国专利号5,821,337

美国专利号5,844,091

美国专利号5,858,657

美国专利号5,861,155

美国专利号5,871,907

美国专利号5,969,108

美国专利号6,054,297

美国专利号6,165,464

美国专利号6,365,157

美国专利号6,406,867

美国专利号6,709,659

美国专利号6,709,873

美国专利号6,753,407

美国专利号6,814,965

美国专利号6,849,259

美国专利号6,861,572

美国专利号6,875,434

美国专利号6,881,557

美国专利号6,891,024

美国专利号6,946,546

Aryal等人,Loss of digestive organ expansion factor(Diexf)reveals anessential role during murine embryonic development that is independent ofp53.Oncotarget 8(61):103996-104006,2017.

Bernstein等人,Dicer is essential for mouse development.Nat Genet 35(3):215-217,2003.

Billingsley等人,Polymerase varepsilon(POLE)mutations in endometrialcancer:clinical outcomes and implications for Lynch syndrome testing.Cancer,121(3):p.386-94,2015.

Burger K,等人(2017)Nuclear phosphorylated Dicer processes double-stranded RNA in response to DNA damage.J Cell Biol216(8):2373-2389.

Burger,等人,Nuclear phosphorylated Dicer processes double-strandedRNA in response to DNA damage.J Cell Biol216(8):2373-2389,2017.

Drake等人,A requirement for ERK-dependent Dicer phosphorylation incoordinating oocyte-to-embryo transition in C.elegans.Dev Cell,31(5):p.614-28,2014.

Drake,等人,A requirement for ERK-dependent Dicer phosphorylation incoordinating oocyte-to-embryo transition in C.elegans.Dev Cell 31(5):614-628,2014.

Drake,等人,A requirement for ERK-dependent Dicer phosphorylation incoordinating oocyte-to-embryo transition in C.elegans.Dev Cell 31(5):614-628,2014.

Fedor and De Marzo,Practical methods for tissue microarrayconstruction.Methods Mol Med,2005.103:p.89-101,2005.

Gurkar and Niedernhofer,Comparison of mice with accelerated agingcaused by distinct mechanisms.Exp Gerontol 68:43-50,2015.

Harkema等人,Pathology of Mouse Models of Accelerated Aging.Vet Pathol53(2):366-389,2016.

Hill等人,DICER1 mutations in familial pleuropulmonaryblastoma.Science,325(5943):p.965,2009.

Jacks,等人,Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice.Curr Biol,4(1):p.1-7,1994.

Johnson等人,Somatic activation of the K-ras oncogene causes earlyonset lung cancer in mice.Nature,410(6832):p.1111-6,2001.

Koks等人,Mouse models of ageing and their relevance to disease.MechAgeing Dev 160:41-53,2016.

Kozomara and Griffiths-Jones,miRBase:annotating high confidencemicroRNAs using deep sequencing data.Nucleic Acids Res 42(Database issue):D68-73,2014.

Kumar等人,Dicer1 functions as a haploinsufficient tumorsuppressor.Genes Dev,23(23):p.2700-4,2009.

Laws and Hoey,Progression of kyphosis in mdx mice.J Appl Physiol(1985)97(5):1970-1977,2004.

Mudhasani等人,Loss of miRNA biogenesis induces p19Arf-p53signalingand senescence in primary cells.J Cell Biol181(7):1055-1063,2008.

Pugh等人,Exome sequencing of pleuropulmonary blastoma revealsfrequent biallelic loss of TP53 and two hits in DICER1resulting in retentionof 5p-derived miRNA hairpin loop sequences.Oncogene,33(45):p.5295-302,2014.

Rakheja等人,Somatic mutations in DROSHA and DICER1 impair microRNAbiogenesis through distinct mechanisms in Wilms tumours.Nat Commun,2:p.4802,2014.

Reiling,等人,The progeroid phenotype of Ku80 deficiency is dominantover DNA-PKCS deficiency.PLoS One 9(4):e93568,2014.

Swahari V,等人(2016)Essential Function of Dicer in Resolving DNADamage in the Rapidly Dividing Cells of the Developing and MalignantCerebellum.Cell Rep 14(2):216-224.

Treiber等人,Accelerated aging phenotype in mice with conditionaldeficiency for mitochondrial superoxide dismutase in the connectivetissue.Aging Cell 10(2):239-254,2011.

序列表

<110> 得克萨斯大学体系董事会

<120> 磷酸化的DICER抗体及其使用方法

<130> UTFC.P1431WO

<150> US 62/784,032

<151> 2018-12-21

<150> US 62/812,743

<151> 2019-03-01

<160> 33

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

caggtccagc tgcagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc cgtgaggatg 60

tcctgtaagg cttctggcta cagctttacc agctactgga tgcactggat aaaacagagg 120

cctggacagg gtctagaatg gattggtgct atttatcctg gaaatagtgc taccaactac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccgccag cactgcctac 240

atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac aagagtgggc 300

tataggtacg aagcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 2

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

1 5 10 15

Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

20 25 30

Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Ala Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

50 55 60

Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

85 90 95

Arg Val Gly Tyr Arg Tyr Glu Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 3

Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 4

ggctacagct ttaccagcta ctgg 24

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Ala Thr

1 5

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 6

tatttatcct ggaaatagtg ctac 24

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 7

Thr Arg Val Gly Tyr Arg Tyr Glu Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 8

acaagagtgg gctataggta cgaagcctgg tttgcttac 39

<210> 9

<211> 318

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 9

gacattgtgc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacattcact ggtaccagca gaagtcaaac 120

acctccccca aactctggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt cccaggtcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg aaactcttac tctctcacga tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgttgcca cttattactg ttttcagggg agtgggtacc cgctcacgtt cggtgctggg 300

accaagctgg agctgaaa 318

<210> 10

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<400> 10

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asn Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 11

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 12

tcaagtgtaa gttac 15

<210> 13

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 13

Asp Thr Ser

1

<210> 14

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 14

gacacatcc 9

<210> 15

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成肽

<400> 15

Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 16

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 16

tttcagggga gtgggtaccc gctcacg 27

<210> 17

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 17

gaaattaata cgactcacta tagacccacg gcagcattct ccgttttaga gctagaaata 60

gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt 120

tt 122

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 18

gctcagtggc tggcatatat g 21

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 19

cccaactgca gctcctttg 19

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 20

gccgtgattt gggacaaaaa g 21

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 21

ccccataggt gggtttgtat c 21

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 22

cccccatagc tggttcaaac 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 23

ggcaacaagg gcagatacat g 21

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 24

cctctaggcc tgtgatcaga atag 24

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 25

ggcgggttaa tgactcatac ag 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 26

ggctggacat agttgtctgt tg 22

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 27

gctccacctg gcttcattat c 21

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 28

gaggaccgat ggttgtgaaa aatc 24

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 29

cctggcacct aggagaattt ag 22

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 30

gtgccaggga tgtagaagac 20

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 31

gggctgcagg aattcgatat c 21

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 32

cacgtggtac cttaagatgc atg 23

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 33

gcgggtgact tgaacctaag 20

Claims (53)

1.分离的单克隆抗体，其中抗体特异性结合在丝氨酸1728和/或丝氨酸1852处磷酸化的人Dicer1(pDicer1)。

2.权利要求1的抗体，其中抗体特异性结合在丝氨酸1852处磷酸化的人Dicer1(pDicer1)。

3.权利要求2的抗体，其中抗体包含由杂交瘤克隆25编码的抗体的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO：3、5和7)和V_L结构域的CDR1-3(SEQ ID NO：11、13和15)。

4.权利要求1-3中任一项的抗体，其中抗体不结合或基本上不结合非磷酸化的Dicer1。

5.权利要求3的抗体，其中抗体包含与克隆25的V_H结构域(SEQ ID NO:1)至少约80％相同的V_H结构域和与克隆25的V_L结构域(SEQ ID NO:9)至少约80％相同的V_L结构域。

6.权利要求3的抗体，其中抗体包含与克隆25的V_H结构域(SEQ ID NO：1)相同的V_H结构域和与克隆25的V_L结构域(SEQ ID NO：9)相同的V_L结构域。

7.权利要求1-6中任一项的抗体，其中抗体是重组的。

8.权利要求1的抗体，其中抗体是IgG、IgM、IgA或其抗原结合片段。

9.权利要求1-6中任一项的抗体，其中抗体是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、单价scFv、二价scFv或单结构域抗体。

10.权利要求1-6中任一项的抗体，其中抗体是人抗体、人源化抗体或去免疫化抗体。

11.权利要求1-6中任一项的抗体，其中抗体与显像剂、化学治疗剂、毒素或放射性核素缀合。

12.组合物，包含在药学上可接受的载体中的权利要求1-11中任一项的抗体。

13.分离的多核苷酸分子，包含编码权利要求1-10中任一项的抗体的核酸序列。

14.包含抗体V_H结构域的重组多肽，所述抗体V_H结构域包含克隆25的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:3、5和7)和克隆25的V_H结构域的CDR 1-3(SEQ ID NO:11、13和15)。

15.分离的多核苷酸分子，包含编码权利要求14的多肽的核酸序列。

16.宿主细胞，包含编码权利要求1-10中任一项的抗体或权利要求14的重组多肽的一种或多种多核苷酸分子。

17.权利要求16的宿主细胞，其中宿主细胞是哺乳动物细胞、酵母细胞、细菌细胞、纤毛虫细胞或昆虫细胞。

18.药物组合物，包含权利要求1-10中任一项的pDicer1抗体和药学载体。

19.包含有效量的权利要求1-10中任一项的pDicer1抗体的组合物，用于治疗受试者的癌症。

20.包含有效量的权利要求1-10中任一项的pDicer1抗体的组合物用于治疗受试者中癌症的用途。

21.治疗受试者中癌症的方法，包括向受试者施用有效量的权利要求1-10中任一项的pDicer1抗体。

22.权利要求21的方法，其中癌症是子宫内膜癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、胸膜肺母细胞瘤、卵巢性索间质瘤、囊性肾瘤或甲状腺癌。

23.权利要求21的方法，其中癌症是KRAS阳性胰腺癌、BRAF阳性转移性黑色素瘤或BRAF阳性甲状腺癌。

24.权利要求21的方法，其中癌症是子宫内膜癌。

25.权利要求24的方法，其中癌症具有突变的KRAS和/或p53。

26.权利要求21的方法，其中静脉内、皮内、瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下或局部施用抗体。

27.权利要求21的方法，其中静脉内施用抗体。

28.权利要求21的方法，还包括对所述受试者施用至少第二抗癌疗法。

29.权利要求28的方法，其中第二抗癌疗法是手术疗法、化学疗法、放射疗法、冷冻疗法、激素疗法、免疫疗法或细胞因子疗法。

30.权利要求28的方法，其中第二抗癌疗法是MEK抑制剂。

31.用于检测受试者中癌症的方法，包括测试来自受试者的样品中相对于对照升高的磷酸化的Dicer1的存在，其中测试包括将样品与权利要求1-10中任一项的抗体接触。

32.权利要求43所述的方法，进一步定义为体外方法。

33.检测样品中磷酸化的Dicer1的体外方法，包括通过测量权利要求1-10中任一项的pDicer1抗体与样品的结合来检测升高水平的磷酸化的Dicer1。

34.权利要求33的方法，其中样品是组织活检、细针抽吸物、唾液、尿液或血浆。

35.权利要求33的方法，其中与对照相比升高水平的磷酸化的Dicer1将样品鉴定为侵袭性癌症样品。

36.权利要求35的方法，其中侵袭性癌症是侵袭性子宫内膜癌。

37.权利要求35的方法，其中与对照相比升高水平的磷酸化的Dicer1表明预后不良。

38.权利要求33的方法，其中升高水平的磷酸化的Dicer1进一步定义为检测样品中超过50％的细胞对于磷酸化的Dicer1是阳性的。

39.权利要求33的方法，还包括将pDicer抗体施用于经鉴定具有升高水平的磷酸化的Dicer1的受试者。

40.小鼠，其基因组包含磷酸-模拟Dicer1。

41.权利要求40的小鼠，其中磷酸-模拟Dicer1具有被天冬氨酸替换的丝氨酸1712和/或丝氨酸1836。

42.权利要求40的小鼠，其中磷酸-模拟Dicer1具有被天冬氨酸替换的丝氨酸1712和丝氨酸1836。

43.权利要求40的小鼠，其中磷酸-模拟Dicer1具有被天冬氨酸替代的丝氨酸1712。

44.权利要求40的小鼠，其中磷酸-模拟Dicer1具有被天冬氨酸替换的丝氨酸1836。

45.权利要求40-45中任一项的小鼠，其中小鼠是Dicer^S1712D、Dicer^S1836D或Dicer^2SD小鼠。

46.权利要求40的小鼠，其中小鼠是Dicer^S183D/S183D小鼠。

47.权利要求40-46中任一项的小鼠，其中小鼠具有加速的老化。

48.权利要求40-47中任一项的小鼠，其中小鼠具有高代谢表型和/或改变的代谢miRNA。

49.权利要求40-49中任一项的小鼠，其中小鼠是雌性小鼠。

50.权利要求40-49中任一项的小鼠，其中小鼠是雄性小鼠。

51.从权利要求40-50任一项的小鼠中分离的细胞。

52.包含与人Dicer1至少90％相同的序列的多肽，其中对应于1728位的丝氨酸和/或对应于1852位的丝氨酸被天冬氨酸替换。

53.包含编码权利要求52的多肽的序列的多核苷酸分子。

Images