CN113318219A - 一种植物凝集素pha-l在制备抗冠状病毒药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物凝集素PHA‑L在制备抗冠状病毒药物中的用途，本发明经实验验证发现植物凝集素PHA‑L具有较好的抗高致病性冠状病毒的活性，能够同时抑制SARS‑CoV‑2、SARS‑CoV、MERS‑CoV病毒活性，表明所述植物凝集素PHA‑L可用于抗冠状病毒的药物的制备中，且具有重要的预防和/或治疗高致病性冠状病毒感染的应用前景。

Description

一种植物凝集素PHA-L在制备抗冠状病毒药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种植物凝集素PHA-L在制备抗冠状病毒药物中的用途。

背景技术

高致病性冠状病毒感染是近年来广受关注的公共卫生问题之一，这些高致病性冠状病毒包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severs acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2)、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(Severe acuterespiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(MiddleEast respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)，具有高传播性和高致病性，通过密切接触在人与人之间传播引起呼吸道综合征，发病率和病死率较高，已成为全球严重的呼吸道流行性疾病。

冠状病毒分为α、β、γ和δ共4个属，高致病性冠状病毒SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV均属于β属冠状病毒，已知可感染人类的冠状病毒有7种，其中2种(HCoV-229E和HCoV-NL63)为α属冠状病毒，5种(SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和SARS-CoV-2)为β属冠状病毒。γ、δ属冠状病毒具有牲畜高致病性。动物流行性冠状病毒会引起呼吸、肠道和神经系统的多种疾病。SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV引发的传染性疾病显示了冠状病毒可越过物种屏障感染人类。

冠状病毒的发病机制一般包括冠状病毒进入细胞、内质网(ER)应激反应/未折叠蛋白反应(Unfolded protein reaction，UPR)和细胞凋亡、免疫反应/炎性体活化，其中，冠状病毒进入细胞的主要途径是通过冠状病毒的S蛋白与细胞受体结合进入细胞；当ER折叠和加工蛋白质的能力超出极限时，未折叠或错误折叠的蛋白质会迅速积聚，从而激活ER应激反应或UPR，若UPR延长且不可逆，则会启动细胞凋亡；冠状病毒通常会编码蛋白质来干扰免疫系统，从而抑制一种反应或增强另一种反应作为其致病性的一部分。

目前，还没有专门用于预防和治疗高致病性冠状病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV)的特效药物，临床上主要以支持治疗和改善症状的对症治疗为主，因此，抗高致病性冠状病毒药物的研发刻不容缓，全球范围内针对高致病性冠状病毒已经开展了大量的药物筛选实验，但是筛选出的抗冠状病毒候选药物仅表现出窄谱活性，或仅在异常高剂量时治疗有效，否则会引起严重的不良反应或免疫抑制(Zumla A,Chan J F W,Azhar E I,etal.Coronaviruses—drug discovery and therapeutic options[J].Nature reviewsDrug discovery,2016,15(5):327-347.)。

由于没有针对性的有效药物，高致病性冠状病毒的新药研发意义重大，鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于预防、治疗高致病性冠状病毒感染的植物凝集素PHA-L及应用，目前尚未见将植物凝集素PHA-L应用于同时抑制SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV的相关报道。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种植物凝集素PHA-L在制备抗冠状病毒药物中的用途，经实验验证发现所述植物凝集素PHA-L具有较好的抗高致病性冠状病毒的活性，能够同时抑制SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV病毒活性，表明了植物凝集素PHA-L可用于抗冠状病毒的药物的制备中。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了植物凝集素PHA-L在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

本发明所述的“植物凝集素PHA-L”，是指白细胞凝集素(Phytohemagglutinin-L，PHA-L)，植物血凝素(PHA)属于高分子糖蛋白，是低聚糖(由半乳糖、N-乙酰葡糖胺和甘露糖所构成)和蛋白质形成的复合物，由4个亚基通过非共价键结合形成的四聚体糖蛋白，包含两种亚基分子，L亚基和E亚基。

本发明提供了一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包含有效量的植物凝集素PHA-L；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

在本发明中，所述药物组合物能够应用于高致病性冠状病毒SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV的同时预防和/或治疗，具有广谱抗冠状病毒的活性，对高致病性冠状病毒的药物研发具有重要的参考价值。

进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式，本领域技术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)：乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物(例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油)，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味矫臭剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、抗氧化剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液，诸如此类的也可加入其中。

进一步，所述适合的药学上可接受的载体和/或辅料在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种药物组合物中可以使用的制剂可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药，使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人。

进一步，所述药物组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

进一步，所述药物组合物制剂选自颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、分散剂中的任意一种。

进一步，所述药物组合物也可和其他用于抗病毒的药物或化合物联合应用，或将两者制备成一种制剂以组合物的形式应用。

进一步，所述其他用于抗病毒的药物或化合物包括(但不限于)：瑞德西韦(GS-5734类)、罗匹那韦、利巴韦林、利托那韦、环孢素、干扰素、石蒜碱、依米汀、莫能菌素钠、霉酚酸酯、霉酚酸、非那吡啶、吡咯烷酸。

本发明所述的“有效量”，是指具有治疗效果的量或在治疗对象中产生治疗效果所需要的量。例如，药物治疗上或药学上有效量是指产生需要的治疗效果所需要的药物的量，治疗效果可以通过临床试验结果、模型动物研究和/或体外研究的结果来反映。药学上有效量取决于几个因素，包括(但不限于)：治疗对象的特征因素(如身高、体重、性别、年龄和用药史)、罹患疾病的严重程度。

本发明提供了植物凝集素PHA-L在制备冠状病毒抑制剂中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

本发明经实验验证发现植物凝集素PHA-L具有抗高致病性冠状病毒的活性，因此，植物凝集素PHA-L能够应用于冠状病毒抑制剂的制备中。

本发明提供一种用于抑制冠状病毒的抑制剂。

进一步，所述抑制剂包含植物凝集素PHA-L；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

进一步，所述抑制剂的活性成分为植物凝集素PHA-L，除活性成分外，还可包括其他载体和/或辅料，所述载体和/或辅料包括(但不限于)：稳定剂、抗氧化剂、盐、缓冲液、保护剂、湿润剂、分散剂等。

本发明提供了前面所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒感染中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

本发明所述的“预防和/或治疗”，是指以预防、改善、稳定、治愈疾病、病理状态或病症为目的对患者进行的医学管理，该术语包括积极疗法，即专门以改善疾病、病理状态或病症为目的的治疗，并且还包括病因治疗，即以除去相关疾病、病理状态或病症的病因为目的的治疗，此外，该术语还包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而非治愈疾病、病理状态或病症的治疗；预防性治疗，即以最大程度降低或者部分或完全抑制相关疾病、病理状态或病症的发展为目的的治疗；以及支持性治疗，即用于补充另一种以改善相关疾病、病理状态或病症为目的的特定疗法的治疗。

本发明提供了前面所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒感染引起的疾病中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

进一步，所述的冠状病毒感染引起的疾病包括(但不限于)：急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、脓毒性休克、代谢性酸中毒、出凝血功能障碍、支气管炎、肺炎、腹泻、心肌炎、新生儿坏死性肠炎、多发性硬化症、中耳炎。

本发明提供了前面所述的抑制剂在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

本发明提供了前面所述的抑制剂在抑制冠状病毒增殖、复制中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

本发明提供了前面所述的抑制剂在抑制冠状病毒中基因的表达、合成中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

本发明还提供了一种抑制高致病性冠状病毒感染动物的方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：给受试动物施用前面所述的药物组合物或抑制剂，以抑制高致病性冠状病毒感染受试动物；

本发明还提供了一种治疗高致病性冠状病毒感染引起的疾病的方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：给受试者施用前面所述的药物组合物，以治疗高致病性冠状病毒感染引起的疾病；

本发明所述的“受试者”或“受试动物”，是指任何动物，包括人类和非人类的动物，所述非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、蝙蝠和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是采用假病毒中和实验检测不同的植物凝集素对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV和VSV的抗病毒活性的结果统计图；

图2是SARS-CoV-2 S蛋白突变株和流行性突变株对不同的植物凝集素的中和敏感性的结果图；

图3是不同的植物凝集素对3种流行性突变株的抗病毒活性的结果图，其中，A图：B.1.1.7，B图：B.1.351，C图：P.1；

图4是植物凝集素的血细胞凝集活性的实验结果图；

图5是小扁豆凝集素对Balb/c小鼠体重增加的影响结果统计图；

图6是小扁豆凝集素在早期阶段抑制SARS-CoV-2感染的结果图，其中，A图：小扁豆凝集素在处理前后抑制假病毒感染的结果图，B图：CPE抑制实验的结果图；

图7是小扁豆凝集素的碳水化合物特异性及其对SARS-CoV-2 S蛋白的反应结果图，其中，A图：Cy3标记的小扁豆凝集素聚糖阵列结果图；B图：L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺(D-GlcNAc)、甲基α-D-甘露醇苷和D-GlcNAc与甲基α-D-甘露醇苷的摩尔混合物对小扁豆凝集素中和活性的竞争性抑制结果图，C图：小扁豆凝集素对ACE2-S三聚体结合的竞争性抑制结果图；

图8是小扁豆凝集素的碳水化合物特异性及其对SARS-CoV-2 S蛋白的反应结果图，其中，A图：N165的N-聚糖图谱，B图：N234的N-聚糖图谱，C图：N343的N-聚糖图谱，D图：SARS-CoV-2糖蛋白三聚体(Wuhan-Hu-1，GenBank:MN908947，PDB ID 6VSB)预融合结构上的代表聚糖N165(紫色)、N234(黄色)和N343(红色)，其中一个RBD为“上”构象，另外两个RBD为“下”构象，ACE2受体结合位点用淡蓝色表示，E图：N165、N234和N343能与小扁豆凝集素结合的N-聚糖比例的饼状结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1植物凝集素对SARS-CoV-2 S蛋白结合活性及抗病毒活性的检测

1、实验材料

小扁豆凝集素(Lentil lectin)、麦胚芽凝集素(WGA)、无梗接骨木凝集素(SSL)、花生凝集素(Peanut lectin)、怀槐凝集素(MAL)均购自于Wako(Japan)；曼陀罗凝集素(DSL)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)、雪花莲凝集素(GNL)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、来源于红芸豆的植物凝集素-M(PHA-M)和植物凝集素-P(PHA-P)均购自于Sigma Aldrich；HEK293细胞表达的SARS-COV-2 S三聚体购自于ACRO Biosystems公司(中国，北京)；293T细胞由美国典型培养物保藏中心(ATCC)提供；Huh7细胞由日本研究生物资源保藏中心(JCRB)提供；构建了SARS-CoV-2spike(Wuhan-Hu-1，MN908947；hCoV-19/South Africa/KRISP-K007869/2020，B.1.351，EPI_ISL_860630；hCoV-19/England/QEUH-F56F0F/2021，B.1.1.7，EPI_ISL_852526；hCoV-19/Brazil/AM-991/2020，P.1，EPI_ISL_833171)、SARS-CoV spike(GenBank:AY278491)、MERS-CoV spike(GenBank:AFS88936.1)、VSV glycoprotein(GenBank:M27165)表达质粒，其中，Wuhan-Hu-1spike表达质粒用作诱变的模板。

2、假病毒的制备、滴定和抗病毒的分析

首先进行假病毒的制备和滴定，在假病毒制备滴定完成后，采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测，将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中，然后加入50μL假病毒(1300TCID₅₀/mL)，并在37℃的条件下孵育1小时。然后，加入100μLHuh7细胞(2×10⁵cells/mL)，并在37℃、5％CO₂的湿化环境中孵育，孵育24小时后进行化学发光检测，采用Reed-Muench法计算各凝集素的IC₅₀。

3、表面等离子体共振(SPR)方法检测凝集素与SARS-CoV-2 S蛋白的结合活性

SPR检测在BIAcore T200仪器(BIAcore，Cytiva)上进行，采用胺偶联法将SARS-CoV-2 S蛋白三聚体固定在CM5芯片的第二流通池上，首先将400mM N-N-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐与100mM N-羟基琥珀酰亚胺的1:1混合物激活传感器芯片表面，将S三聚体稀释至25μg/mL的浓度，采用10mM醋酸钠溶液(pH 5.0)稀释，并注入活化的表面，用1.0M乙醇胺/盐酸(pH 8.5)溶液以10μL/min的速度阻断残留的反应表面封闭7min，达到约1000个响应单元(RU)的固定化水平。采用类似胺偶联剂处理流通池1，但不注射任何配体，作为空白对照。

采用0.01M HEPES、0.05％聚山梨酯20、150mM NaCl和3mM EDTA缓冲液对凝集素进行系列稀释，将稀释后的凝集素以30μL/min的速度注入芯片上2min，然后解离150s，用甘氨酸1.5(Cytiva)以20μL/min的浓度再生表面30s，以去除结合凝集素。

4、采用SEC-MALS测定蛋白质的分子量

通过体积排阻色谱法将凝集素流过TSK G3000 SWXL色谱柱(Tosoh BioscienceLLC，King of Prussia，PA，USA)，并通过三角光散射检测器(DAWN)和示差折光检测器(Optilab T-rEX，Wyatt Technology，Santa Barbara，California)进行检测，采用ASTRA 7进行数据分析，计算蛋白质的分子量(Mw)。

5、实验结果

实验结果显示，小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对SARS-CoV-2 S蛋白均具有较强的结合活性(见表1)，而花生凝集素和怀槐凝集素(MAL)对SARS-CoV-2 S蛋白对SARS-CoV-2 S蛋白则没有结合活性；

假病毒中和实验的结果显示，小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV假病毒均具有较强的抑制活性，5种凝集素对SARS-CoV-2的IC50在8.5～33.8μg/mL之间，其中，小扁豆凝集素和麦胚芽凝集素(WGA)对SARS-CoV-2的抑制活性最强。麦胚芽凝集素(WGA)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对水疱性口炎病毒VSV也显示出较强的抑制活性，无梗接骨木凝集素(SSL)虽然对SARS-CoV和SARS-CoV-2均有一定的抑制作用，但对MERS-CoV无抑制作用，花生凝集素未表现出病毒抑制作用，怀槐凝集素(MAL)对SARS-CoV-2 S蛋白无明显的结合活性，对SARS-CoV-2也无抗病毒活性，仅对MERS-CoV有不显著的抗病毒活性(见表1和图1)，结果表明了5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))对SARS-CoV-2 S蛋白具有较强的结合活性，且同时对SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV均有较强的抗病毒活性。

表1不同的植物凝集素对SARS-CoV-2的抗病毒活性的结果

实施例2植物凝集素对SARS-CoV-2 S蛋白突变株和SARS-CoV-2流行性突变株感染的抑制作用检测

本实施例分别检测了各种植物凝集素对SARS-CoV-2 S蛋白突变株和SARS-CoV-2流行性突变株感染的抑制作用，所述突变株包括英国流行突变株B.1.1.7、南非流行突变株B.1.351、巴西流行突变株P.1、组合突变株D614G+I472V、组合突变株D614G+A435S、A222V、K417N、S477N、E484K、N501Y、组合突变株A222V+D614G、组合突变株K417N+D614G、组合突变株S477N+D614G、组合突变株E484K+D614G、组合突变株N501Y+D614G等突变株；

凝集素主要针对糖蛋白的糖基部分，在本实施例中，发明人研究了SARS-CoV-2 S蛋白的糖化位点的变化是否会影响其对凝集素的中和敏感性，共构建28个N-连接糖基化位点缺失(22个位点，24个突变体)或O-连接糖基化位点缺失(4个预测位点，4个突变体)的人工突变体。

1、基于假病毒(SARS-CoV-2 S蛋白突变株)的中和敏感性实验

分别检测了28个糖基化突变体以及各种组合突变株对各植物凝集素的敏感性，具体实验方法如下：

采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测，将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中，然后加入50μL假病毒(1300TCID₅₀/mL)，并在37℃的条件下孵育1小时。然后，加入100μL Huh7细胞(2×10⁵cells/mL)，并在37℃、5％CO₂的湿化环境中孵育，孵育24小时后进行化学发光检测，采用Reed-Muench法计算各凝集素的IC₅₀。

2、植物凝集素的抗病毒活性检测实验

分别检测了各种植物凝集素对SARS-CoV-2流行性突变株B.1.1.7、B.1.351和P.1的抗病毒活性，具体实验方法如下：

采用基于假病毒感染Huh7细胞的抗病毒实验进行检测，将100μL系列稀释的凝集素制剂稀释液添加到96孔板中，然后加入50μL假病毒(1300TCID₅₀/mL)，并在37℃的条件下孵育1小时。然后，加入100μL Huh7细胞(2×10⁵cells/mL)，并在37℃、5％CO₂的湿化环境中孵育，孵育24小时后进行化学发光检测，采用Reed-Muench法计算各凝集素的IC₅₀。

3、实验结果

中和敏感性的实验结果显示，小扁豆凝集素对28个糖基化突变体的抗病毒活性(中和敏感性)均未受影响，IC50的倍数变化均在4.0以下(见图2)，N122Q和N801Q对GNL的敏感性降低了4倍，N343Q对DSL和GNL的敏感性降低了4倍，而N709Q和位于近端膜C端的三个突变(N1098Q、N1134Q和N1173Q)对PHA-L、PHA-E的敏感性增加了4-10倍，N1098Q对WGA的敏感性增加了6倍(见图2)，表明了5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))可以对28个糖基化突变体高效中和；

抗病毒活性检测的结果显示，小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)对流行性突变株B.1.1.7、B.1.351和P.1的抗病毒活性与对SARS-CoV-2的抗病毒活性相似，均表现出一定的抗病毒活性，其中，小扁豆凝集素和WGA对3种流行性突变株的抗病毒活性最强(见图3A-C)，进一步证明了5种植物凝集素(小扁豆凝集素、麦胚芽凝集素(WGA)、植物凝集素(PHA-E)、白细胞凝集素(PHA-L)、琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A))对SARS-CoV-2及其流行性突变株均具有抗病毒活性。

实施例3植物凝集素的血细胞凝集活性和细胞毒性的检测

由于许多的天然凝集素都会引起血细胞凝集，因此，在本实施例中发明人研究了不同植物凝集素的血细胞凝集活性，并对Huh7和293T细胞的细胞毒性进行了研究。

1、植物凝集素的血细胞凝集活性的检测

采用鸡血标本检测植物凝集素的血细胞凝集活性，用PBS洗涤公鸡红细胞，并以1％(v/v)的终浓度重悬，将50μL 2倍系列稀释的植物凝集素溶液与等体积的红细胞溶液在96孔圆底板中混合，将流感抗原(B/Maryland/15/2016，NIBSC-UK-EN63QG，NIBSC代码：18/104，HA：69μg/mL)进行2倍系列稀释，并作为阳性对照，PBS溶液用作阴性对照，将板在室温条件下孵育1小时，并通过目测确定各种植物凝集素的血细胞凝集活性。

2、植物凝集素的细胞毒性的检测

采用Huh7和293T细胞对各种植物凝集素的细胞毒性进行检测，植物凝集素对Huh7和293T细胞的细胞毒性活性以CC50(50％细胞毒浓度)表示；

此外，采用Balb/c小鼠对小扁豆凝集素在体内的影响进行了验证，在第0天，对小鼠腹膜内注射20mg/kg的小扁豆凝集素(n＝6)或PBS(n＝6)，其中，PBS为阴性对照，并在注射后每天测量小鼠的体重并记录，以Balb/c小鼠的体重增加作为机体健康状况的指标。

3、实验结果

血细胞凝集活性检测的实验结果显示，PBS没有显示出任何血凝活性，已知的血凝剂流感血凝剂HA在浓度高于0.03μg/mL时显示出血凝活性，小扁豆凝集素在最高浓度为1mg/mL时才会表现出较弱的凝集活性，琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)在1mg/mL时也未表现出血凝活性(见图4)，表明了小扁豆凝集素和琥珀酰-伴刀豆球蛋白A(succ-Con A)均具有较弱的血凝活性；

细胞毒性检测的实验结果显示，所有的植物凝集素在500μg/mL时均未表现出细胞毒性(见表1)，证明了本发明所述的植物凝集素不具有细胞毒性，进一步采用动物实验验证小扁豆凝集素在体内的影响的结果表明，在20mg/kg的注射量下，并未出现Balb/c小鼠的体重下降，进一步证明了所述的植物凝集素不具有细胞毒性(见图5)。

实施例4小扁豆凝集素抗SARS-CoV-2感染的机制研究

为了研究小扁豆凝集素对SARS-CoV-2感染的抑制作用的机制，本发明对其体外作用模式进行了研究，具体实施方式如下：

1、对小扁豆凝集素的抗病毒活性进行检测

首先用小扁豆凝集素分别对Huh7细胞或假病毒进行预处理和后处理，并检测其抗病毒活性。小扁豆凝集素预处理：用系列稀释的凝集素溶液在37℃的条件下与Huh7细胞共孵育1h，PBS洗涤5次后(此洗涤步骤也可省略)，用SARS-CoV-2假病毒感染细胞；小扁豆凝集素后处理：将SARS-CoV-2假病毒分别在37℃的条件下感染Huh7细胞0、1、2、4、6、8和24h后，再加入系列稀释的小扁豆凝集素，检测小扁豆凝集素对病毒感染的影响。

2、基于SARS-CoV-2活病毒的细胞病变抑制实验(CPE抑制实验)

首先将梯度稀释的小扁豆凝集素和100TCID50的SARS-CoV-2活病毒等体积混合，并在37℃的条件下孵育1小时，然后将混合物转移至铺有Vero E6细胞的96孔培养板中，37℃培养3天后，采用显微镜观察细胞的形态和状态，并记录相关数据，根据所得数据计算CPE抑制率，评估小扁豆凝集素对SARS-CoV-2活病毒的抗病毒作用。

3、聚糖阵列分析

用Cy3标记植物凝集素，并用基于假病毒的抗病毒测定实验检测其生物活性，用封闭缓冲液封闭N-Glycan微阵列载玻片(Creative Biochip，南京，中国)30分钟，然后用PBST(PBS缓冲液，0.05％Tween 20)洗涤，加入1～8μg/mL凝集素-Cy3，37℃孵育2小时，洗涤以去除未结合的凝集素，然后对微阵列载玻片进行扫描和分析。

4、基于SPR的ACE2竞争性结合测定

小扁豆凝集素对ACE2-S三聚体结合的竞争性分析是采用BIAcore T200系统(BIAcore，Cytiva)在25℃的条件下进行分析的，通过抗人IgG(Fc)抗体(Cat.No.BR100530,Cytiva)以5μg/mL的浓度将人ACE2-hFc标签捕获到S系列传感器芯片CM5的第二个流通池中，注射时间为30s，流速为10μL/min，以产生350RU的响应，在运行缓冲液(1×HEPES、0.005％Tween-20)中制备400nM SARS-CoV-2 S蛋白的测定溶液，其中含有浓度为0nM、0.5nM、5nM、20nM、50nM的小扁豆凝集素，流速为30μL/min，缔合时间为60s，解离时间为90s，检测对人ACE2结合的反应，用3M MgCl₂再生人ACE2和抗人IgG(Fc)抗体的表面，结合动力学参数采用

Insight软件(BIAcore，Cytiva)进行评估。

5、实验结果

抗病毒活性检测的实验结果显示，在处理0、1和2h后，以及用小扁豆凝集素预孵育假病毒1h后，观察到小扁豆凝集素对病毒感染性的显著抑制作用(见图6A)；用小扁豆凝集素预孵育Huh7细胞后，用大量PBS洗涤细胞以清除残留的凝集素，结果显示没有抑制作用，而不使用PBS洗涤的预孵育导致了显著的剂量依赖性的感染抑制作用；随着添加小扁豆凝集素时间的延长，抑制作用逐渐减弱，4h后无病毒抑制，表明了小扁豆凝集素在病毒感染的早期阶段发挥作用，且直接与SARS-CoV-2的S蛋白反应；

CPE抑制实验的结果显示，与SARS-CoV-2活病毒预孵育的小扁豆凝集素显示出了较强的抑制作用，IC50为60.26μg/mL(1.2μM)(见图6B)，进一步表明了小扁豆凝集素在病毒感染的早期阶段与SARS-CoV-2直接反应发挥抗病毒的作用；

聚糖阵列分析的结果显示，小扁豆凝集素与两种类型的N糖的结合效果最佳：从Man-5到Man-9的高甘露糖型N糖，以及非还原端含有GlcNAc的N糖(见图7A)，高甘露糖型Man-8和Man-9的结合亲和力最高，非还原端含有GlcNAc的N-聚糖可以是单天线复杂型N-聚糖(N020)、双天线复杂型N-聚糖(N000)或杂合型N-聚糖(N010)。凝集素分别与甲基α-D-甘露醇苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺(D-GlcNAc)和D-葡萄糖孵育后，抑制了小扁豆凝集素的抗病毒活性，其中α-D-甘露醇苷的抑制作用最强(见图7B)，表明小扁豆凝集素的抗病毒活性直接依赖于其高甘露糖型/GlcNAc结合功能；

基于SPR的竞争性结合测定的结果显示，50nM的小扁豆凝集素可有效地阻断ACE2受体和S三聚体蛋白的结合，从而在病毒感染的早期发挥抗病毒的作用。糖基化位点N165、N234和N343位于S蛋白受体结合位点周围(见图8D)，N234的N-聚糖是高甘露糖型，由Man-8(53.2％)、Man-9(40.3％)、Man-7(3.4％)、Man-6(1.5％)和Man-5(1.5％)组成，在N165和N343中，N-聚糖以复杂型为主，在N165中也发现了约20％的高甘露糖型聚糖Man-5和少量的杂合型聚糖(见图8A-C)，小扁豆凝集素与各糖基化位点特异性结合聚糖的比例见图8E，N234、N165和N343位点的大多数聚糖可与小扁豆凝集素结合，表明了小扁豆凝集素可与N234、N165和N343位点的N-聚糖结合，并阻断ACE2与RBD的结合，从而抑制SARS-CoV-2感染，发挥抗病毒的作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.植物凝集素PHA-L在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

2.一种用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的植物凝集素PHA-L；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或辅料。

4.植物凝集素PHA-L在制备冠状病毒抑制剂中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

5.一种用于抑制冠状病毒的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包含植物凝集素PHA-L；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

6.权利要求2或3所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒感染中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

7.权利要求2或3所述的药物组合物在预防和/或治疗冠状病毒感染引起的疾病中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

8.权利要求5所述的抑制剂在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染的药物中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

9.权利要求5所述的抑制剂在抑制冠状病毒增殖、复制中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

10.权利要求5所述的抑制剂在抑制冠状病毒中基因的表达、合成中的应用；

优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU中的任意一种或多种；

更优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV。

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