CN113317508A - 一种水溶性植物甾醇纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水溶性植物甾醇纳米颗粒及其制备方法。该方法包括:将蛋白粉末加入水中,水化,得到蛋白溶液;将植物甾醇与乳化剂溶解在乙酸乙酯溶液中,形成有机相;向蛋白溶液中快速加入有机相,均质,微射流处理,将得到的混合溶液中的乙酸乙酯去除,喷雾干燥,得到产物。本发明将乳化技术与高压微射流进行有效结合,制备过程简便高效,经济绿色。且本发明得到的植物甾醇产品具有较小的粒径和较高的水溶性,同时实现了甾醇的高效包埋和生物利用,使用的原材料如大豆蛋白、植物甾醇、卵磷脂均具有一定的健康效果尤其是降胆固醇功效,拓宽了植物甾醇的应用范围,能够作为功能性因子较好地应用于各类食品基质及药品中。
Description
技术领域
本发明属于功能性食品加工技术领域,具体涉及一种水溶性植物甾醇纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
植物甾醇是一类来源于植物尤其是玉米、大豆等的功能性脂质,是植物体内甾醇类化合物的统称。作为一种天然活性物质,植物甾醇具有多种特殊功能特性,包括如降胆固醇作用、抗癌作用、抗氧化作用、抗炎退热作用等。在这之中,由于植物甾醇分子结构与人体内的胆固醇结构极为相似,可一定程度影响胆固醇在人体内的代谢,其降血脂胆固醇功能愈发成为人们的研究重点。包括美国、加拿大、澳大利亚在内的世界各地卫生当局也对植物甾醇在降低血脂方面的作用大为认可,早在2000年9月,美国食品与医药管理局(FDA)就批准添加了植物甾醇和植物甾醇酯食品可以使用“有益健康”的标签,规定推荐摄入量为每天至少摄入1.3g植物甾醇或3.4g植物甾醇酯,但一般认为植物甾醇摄入不宜超过2g。欧洲食品安全局也指出每人每日应摄入1.5~3.0g的植物甾醇,这样可以降低人体内7%~11.3%的低密度脂蛋白胆固醇。众多研究人员也利用各种体内体外实验证明了植物甾醇的健康功效。
尽管植物甾醇已被广泛认为是治疗和预防高血脂症的最佳天然物质,但在其在实际应用过程中仍存在较多限制。首先是其在水溶液及油中溶解度性均较差,生物利用率很低,约只有5%会为人体所吸收,要达到所需剂量摄入往往需要食用较多植物甾醇产品,因而导致高植物甾醇血症的发生,严重危害患者健康;其次是其高熔点,高结晶的结构,在食品中应用时颗粒感较重,使得最终产品的感官性能和质量不理性。目前针对上述限制主要通过两个方面入手,油溶性植物甾醇的制备是通过酯化反应来生成植物甾醇酯实现,酯化反应有效改善其溶解性和油溶性,同时天然植物甾醇的不良气味也得到了缓解。如专利CN109879925A就通过将植物甾醇和小分子有机酸在一定的温度下利用催化剂合成植物甾醇酯。但就植物甾醇酯而言,其应用较为受限,仅适用于高脂食品,因而对于一些遵循低脂饮食的人而言可能不是理想的选择。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足,本发明的目的是提供一种具有水溶性植物甾醇纳米颗粒及其制备方法。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)将蛋白粉末加入水中,分散均匀,水化,得到蛋白溶液;
(2)将植物甾醇与乳化剂加入乙酸乙酯中,室温搅拌溶解均匀,得到有机相;
(3)在搅拌状态下将步骤(1)所述蛋白溶液与步骤(2)所述有机相混合,均质处理,然后进行微射流处理,得到混合乳液;
(4)将步骤(3)所述混合乳液中的乙酸乙酯去除,喷雾干燥,得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。
进一步地,步骤(1)所述蛋白粉末为大豆分离蛋白粉末、酪蛋白粉末等中的一种以上;
进一步地,步骤(1)中,将蛋白粉末加入水中,分散均匀得到分散液,调节所述分散液的pH为中性后再进行水化。
进一步地,步骤(1)所述水化的温度为0-5℃,水化的时间为6-24h。
优选地,步骤(1)所述水化的温度为4℃;步骤(1)所述水化的时间为12h。
进一步地,在步骤(1)所述蛋白溶液中,蛋白的浓度为1-6wt%。
进一步地,步骤(2)所述植物甾醇为陕西海斯夫生物工程有限公司生产的大豆植物甾醇(其纯度≥95%)。
进一步地,步骤(2)所述乳化剂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、蔗糖酯等中的一种以上。
优选地,步骤(2)所述乳化剂为大豆卵磷脂。
进一步地,步骤(2)所述植物甾醇和乳化剂的质量比为1:1-1:4。
进一步地,步骤(2)所述乳化剂与乙酸乙酯的的质量体积比为25-100mg/mL。
进一步地,步骤(3)所述均质处理采用高速乳化剪切机进行的,所述高速乳化剪切机的转速为10000-40000rpm。
优选地,所述所述高速乳化剪切机的转速为30000rpm。
进一步地,步骤(3)所述均质处理的时间为2-6min。
优选地,步骤(3)所述均质处理的时间为4min。
优选地,步骤(3)中,可以先将高速乳化剪切机开启,在剪切的作用下将将步骤(1)所述蛋白溶液与步骤(2)所述有机相混合。
进一步地,步骤(3)所述有机相的体积为蛋白溶液体积的10-30%。
进一步地,步骤(3)所述微射流处理的压力为40-90MPa,所述微射流处理的次数为1-3次。
优选地,步骤(3)所述微射流处理的压力为60-90MPa。
进一步地,步骤(4)中,将混合乳液中的乙酸乙酯去除的方式为旋转蒸发;
优选地,所述旋转蒸发的温度为40-50℃。
进一步优选地,所述旋转蒸发的温度为45℃。
进一步地,步骤(4)所述喷雾干燥的进风温度为150-190℃,喷雾干燥的出风温度为50-80℃,喷雾干燥的料液流速为80-100mL/min。
优选的,步骤(4)所述的喷雾干燥条件为进风温度160℃,出风温度为60℃,料液流速为90mL/min。
本发明提供一种由上述的制备方法制得的水溶性植物甾醇纳米颗粒。
本发明发现:乳化形式的植物甾醇具有更高的水溶性,在降低血清胆固醇方面具有更高的效率,以水溶性形式制备的植物甾醇也使得它们能更为广泛的在食品中应用。
与现有技术相比,本发明具有如下优点和有益效果:
(1)本发明提供的制备方法中,所选用的原料如乳化剂卵磷脂,壁材大豆蛋白、芯材植物甾醇,均为具有一定营养价值特别是降胆固醇功效的,因而制备的植物甾醇纳米颗粒可认为是安全可食用,具有一定健康功效的;
(2)本发明提供的制备方法中,将乳化技术和高压微射流结合起来,在无需较高能量输入的前提下即可制备出具有良好稳定性的甾醇颗粒,涉及工艺简单、安全,且是一种绿色的生产技术,适于大规模生产;
(3)本发明制备的植物甾醇纳米颗粒具有良好的水溶性,较高的荷载率,且粒径较小,因而适于各种食品基质的应用,提高了植物甾醇的可利用性。
附图说明
图1是本发明实施例1制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的溶解度图。
图2是本发明实施例1制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的包埋率及荷载量图。
图3是本发明实施例2制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的溶解度图。
图4是本发明实施例2制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的包埋率及荷载量图。
图5是本发明实施例3制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的溶解度图。
图6是本发明实施例3制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的包埋率及荷载量图。
图7是本发明实施例5制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的溶解度及平均粒径图。
图8是本发明实施例5制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的包埋率及荷载量图。
图9是本发明实施例5制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的生物利用率与储藏稳定性图。
图10是是本发明实施例5制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的溶解度与包埋率图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明,但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是,以下若有未特别详细说明之过程,均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒通过国家标准DB13T812-2006测量其溶解度。
以下实施例制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒参考Leong W.F.,LaiO.M.,Long K.,Man Y.,Misran M.,&Tan C.P.Preparation and characterisation of water-solublephytosterol nanodispersions.Food Chemistry,2011,129(1),77-83.的方法测试其植物甾醇包埋率和荷载率。
具体方案如下:
取10mL水溶性植物甾醇纳米颗粒分散液(浓度为0.2M)于50mL平底烧瓶中,加入10mL浓度为1M的KOH的乙醇溶液,在80℃、95rpm下震荡皂化80min,使蛋白变性与甾醇分离。后将反应液转移至80mL的分液漏斗中,加入10mL正己烷萃取。待有机相与水相分离后,将有机相分3次用10mL蒸馏水洗涤,出去杂质。除去下层水分后,将有机相移至试管中,加入无水硫酸钠除去多余水分。然后将脱水的有机相移入干净的试管中,用高纯氮吹干。最后将干燥的植物甾醇震荡复溶到乙醇中,用磷硫铁法进行测定。
以下实施例制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的生物利用率通过如下方案进行测定:
通过Chen F.P.,Li B.S.,&Tang C.H.Nanocomplexation between curcumin andsoy protein isolate:influence on curcumin stability/bioaccessibility and invitro protein digestibility.Journal of Agricultural&Food Chemistry,2015,63(13),3559-3569.的体外消化模型获得植物甾醇颗粒消化液,取1mL消化液于10℃、10000g下离心30min,测定上清液中的甾醇含量。
以下实施例制备的水溶性植物甾醇纳米颗粒的储藏稳定性通过如下方案进行测定:
将制备的颗粒置于室温(25℃)的条件下保存储藏一周后,同上述植物甾醇包埋率测定方法测试储藏两周后颗粒中植物甾醇包埋率。
实施例1
一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)将大豆蛋白粉末加入水中,分散均匀,得到分散液,调节分散液pH为7.0,在温度为4℃的条件下水化12h,得到蛋白溶液(5wt%);
(2)将植物甾醇(陕西海斯夫生物工程有限公司生产的大豆植物甾醇)与卵磷脂溶解在乙酸乙酯中,所述植物甾醇与卵磷脂的质量比为1:1-1:4,所述卵磷脂与乙酸乙酯的质量体积比为50mg/mL,室温搅拌使其充分溶解均匀,得到植物甾醇溶液(有机相);
(3)开启高速乳化剪切机,在剪切状态下,将植物甾醇溶液加入到蛋白溶液中,所述植物甾醇溶液的体积为蛋白溶液体积的25%,在转速为30000rpm的条件下进行均质4min,随后将均质好的乳液在80MPa下进行微射流,微射流次数为1次,得到混合乳液;
(4)将步骤(3)得到混合乳液收集于蒸馏瓶中,在45℃的条件下旋转蒸发除去乙酸乙酯,随后在进风温度160℃,出风温度为60℃,料液流速为90mL/min的条件下进行喷雾干燥,即可得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。
本实例考察了蛋白溶液的浓度在5wt%时,不同植物甾醇/卵磷脂质量比(1:1-1:4)下获得的植物甾醇纳米颗粒在水中的溶解度、包埋率及荷载量,结果如图1和图2所示。如图1所示,可以看出,随着体系中卵磷脂含量的增加,颗粒的溶解度逐渐上升,并在大豆蛋白:卵磷脂比例达1:3时达到最大值(1.2202mg/g),继续添加卵磷脂,颗粒的溶解度则略有降低。同样的,植物甾醇的包埋率和荷载量呈现相同趋势的变化,如图2所示,在大豆蛋白:卵磷脂比例达1:3时,植物甾醇被充分包埋,继续增大则不利于其有效的包埋。由此可见卵磷脂的加入有效提高了植物甾醇颗粒的水溶性,且以乳化形式存在的植物甾醇更易为大豆蛋白所包埋。
实施例2
一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)将大豆蛋白粉末加入水中,分散均匀,得到分散液,调节分散液pH为7.0,在温度为4℃的条件下水化12h,得到蛋白溶液(5wt%);
(2)将植物甾醇(陕西海斯夫生物工程有限公司生产的大豆植物甾醇)与卵磷脂溶解在乙酸乙酯中,所述植物甾醇与卵磷脂的质量比为1:3,所述卵磷脂与乙酸乙酯的质量体积比为50mg/mL,室温搅拌使其充分溶解均匀,得到植物甾醇溶液(有机相);
(3)开启高速剪切机,在剪切状态下,将植物甾醇溶液加入到蛋白溶液中,所述植物甾醇溶液的体积为蛋白溶液体积的10-30%,在转速为30000rpm的条件下进行均质4min,随后将均质好的乳液在80MPa下进行微射流,微射流次数为1次,得到混合乳液;
(4)将步骤(3)得到混合乳液收集于蒸馏瓶中,在45℃的条件下旋转蒸发除去乙酸乙酯,随后在进风温度160℃,出风温度为60℃,料液流速为90mL/min的条件下进行喷雾干燥,即可得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。
本实例考察了蛋白溶液的浓度在5wt%时,不同植物甾醇溶液体积比下的植物甾醇纳米颗粒在水中的溶解度、包包埋及荷载量,结果如图3和图4所示。由于植物甾醇不溶于水,因此通常需要先溶解在有机溶剂中来制备甾醇溶液,这里选择的乙酸乙酯,如图3所示,可以看出,当植物甾醇体积比较小时,植物甾醇与卵磷脂不能充分混匀,少量的植物甾醇仍以晶体形式存在,因而溶解度较低,随着植物甾醇溶液体积百分比(相对于蛋白溶液)的逐渐增大,溶解度也随之升高,并在25%时达到最高值。同样的,晶体形式存在的植物甾醇在经旋蒸进行水化的过程中,会显著增加颗粒的粒径,故而降低了包埋率和荷载量(如图4所示),因而与此相对应的,在植物甾醇溶液的体积为蛋白溶液体积的25%时,达到最高的包封率和荷载量,进一步增加植物甾醇含量,会因过量的乙酸乙酯对蛋白的变性作用而使得甾醇包封率(包埋率)的下降。
实施例3
一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)将大豆蛋白粉末加入水中,分散均匀,得到分散液,调节分散液pH为7.0,在温度为4℃的条件下水化12h,得到蛋白溶液(1-5wt%);
(2)将植物甾醇(陕西海斯夫生物工程有限公司生产的大豆植物甾醇)与卵磷脂按1:3的质量比溶解在乙酸乙酯中,所述植物甾醇与卵磷脂的质量比为1:3,所述卵磷脂与乙酸乙酯的质量体积比为50mg/mL,室温搅拌使其充分溶解均匀,得到植物甾醇溶液(有机相);
(3)开启高速剪切机,在剪切状态下,将植物甾醇溶液加入到蛋白溶液中,所述植物甾醇溶液的体积为蛋白溶液体积的25%,在转速为30000rpm/min的条件下进行均质4min,随后将均质好的乳液在80MPa下进行微射流,微射流次数为1次,得到混合乳液;
(4)将步骤(3)得到混合乳液收集于蒸馏瓶中,在45℃的条件下旋转蒸发除去乙酸乙酯,随后在进风温度160℃,出风温度为60℃,料液流速为90mL/min的条件下进行喷雾干燥,即可得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。
本实例考察了在不同蛋白溶液的浓度(1-6wt%)下获得的植物甾醇纳米颗粒在水中的溶解度、包埋率及荷载量,结果如图5和图6所示。由于大豆分离蛋白(SPI)与大豆卵磷脂间可通过静电相互作用和疏水相互作用自发地形成复合体系,因而蛋白浓度对于甾醇颗粒的性质具有一定的影响。如图5所示,随着蛋白浓度的增加,甾醇的溶解度不断提高,并在含量为4wt%时达到最大值,之后便逐渐降低。而包埋率及荷载量则在SPI浓度为5wt%时最高(如图6所示)。这可能是当蛋白过量时,会代替卵磷脂与植物甾醇结合,因而造成一定程度的聚集,导致溶解度的下降和甾醇的析出。综合来看,当SPI浓度为5wt%时,植物甾醇的理化性质最佳。
实施例4
一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)将大豆蛋白与酪蛋白按照一定质量比(1:1-5:1)加入水中,分散均匀,得到分散液,调节分散液pH为7.0,在温度为4℃的条件下水化12h,得到蛋白溶液,使其最终浓度为5wt%;
(2)将植物甾醇(陕西海斯夫生物工程有限公司生产的大豆植物甾醇)与卵磷脂溶解在乙酸乙酯中,所述植物甾醇与卵磷脂的质量比为1:3,所述卵磷脂与乙酸乙酯的质量体积比为50mg/mL,室温搅拌使其充分溶解均匀,得到植物甾醇溶液(有机相);
(3)开启高速剪切机,在剪切状态下,将植物甾醇溶液加入到蛋白溶液中,所述植物甾醇溶液的体积为蛋白溶液体积的25%,在转速为30000rpm的条件下进行均质4min,随后将均质好的乳液在80MPa下进行微射流,微射流次数为1次,得到混合乳液;
(4)将步骤(3)得到混合乳液中收集于蒸馏瓶中,在45℃的条件下旋转蒸发除去乙酸乙酯,随后在进风温度160℃,出风温度为60℃,料液流速为90mL/min的条件下进行喷雾干燥,即可得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。
表1
本实例考察了蛋白溶液的浓度为5wt%时,大豆蛋白:酪蛋白在不同质量比(1:1-1:5)下获得的植物甾醇纳米颗粒在水中的溶解度、包封率及荷载率。如表1所示,可以看出随着混合蛋白溶液中SPI含量的提高,颗粒的溶解度及包埋特性均不断改善,当质量比在1:4时具有最高的溶解的,而在质量比为1:5时期包埋率和荷载量最高。且相较于全SPI溶液,可以看出,适量的加入酪蛋白酸钠有效提高了颗粒的溶解度,甾醇也更充分的为蛋白所包埋。考虑到综合效果和生产成本,酪蛋白酸钠和大豆分离蛋白的最佳配比是1:4(质量比)。
实施例5
一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,包括如下步骤:
(1)将大豆蛋白与酪蛋白按照4:1的质量比加入水中,分散均匀,得到分散液,调节分散液pH为7.0,在温度为4℃的条件下水化12h,得到蛋白溶液,使其最终浓度为5wt%;
(2)将植物甾醇(陕西海斯夫生物工程有限公司生产的大豆植物甾醇)与卵磷脂溶解在乙酸乙酯中,所述植物甾醇与卵磷脂的质量比为1:1-1:4,所述卵磷脂与乙酸乙酯的质量体积比为50mg/mL,室温搅拌使其充分溶解均匀,得到植物甾醇溶液(有机相);
(3)开启高速剪切机,在剪切状态下,将植物甾醇溶液加入到蛋白溶液中,所述植物甾醇溶液的体积为蛋白溶液体积的25%,在转速为30000rpm/min的条件下进行均质4min,随后将均质好的乳液在60-100MPa下进行微射流,微射流次数为1次,得到混合乳液;
(4)将步骤(3)得到混合乳液收集于蒸馏瓶中,在45℃的条件下旋转蒸发除去乙酸乙酯,随后在进风温度160℃,出风温度为60℃,料液流速为90mL/min的条件下进行喷雾干燥,即可得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。
本实例考察了蛋白溶液的浓度在5wt%时,不同高压微射流条件(60-90MPa)下获得的植物甾醇纳米颗粒在水中的溶解度、包埋率、荷载量、生物利用率与储藏稳定性,结果如图7、图8、图9及图10所示。由图7可以看出,随着微射流压力的提高,颗粒的溶解度逐渐提高,而粒径逐渐降低,并在80MPa下达到最佳,同样的,在此条件下,颗粒的包埋特性也达到了最佳,包埋率达91.83%(如图8所示)。如图9所示,生物利用率实验表明,经乳化、高压微射流后制备的植物甾醇纳米颗粒均具有较高的生物利用率,并在80MPa时达到最高值(82.36%),远远高于游离态植物甾醇的(21.94%),且此条件下的颗粒放置两周仍具有较好的稳定性,表明适度的高压微射流处理能可有效的提高植物甾醇的水溶性,实现甾醇的高荷载(如图10所示)和高生物利用,且能够稳定储存。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式,仅用于解释本发明,而非限制本发明,本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将蛋白粉末加入水中,分散均匀,水化,得到蛋白溶液;
(2)将植物甾醇与乳化剂加入乙酸乙酯中,室温搅拌溶解均匀,得到有机相;
(3)在搅拌状态下将步骤(1)所述蛋白溶液与步骤(2)所述有机相混合,均质处理,然后进行微射流处理,得到混合乳液;
(4)将步骤(3)所述混合乳液中的乙酸乙酯去除,喷雾干燥,得到所述水溶性植物甾醇纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述蛋白粉末为大豆分离蛋白粉末、酪蛋白粉末中的一种以上;步骤(1)所述水化的温度为0-5℃,水化的时间为6-24h。
3.根据权利要求1所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,其特征在于,在步骤(1)所述蛋白溶液中,蛋白的浓度为1-6wt%。
4.根据权利要求1所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述植物甾醇为陕西海斯夫生物工程有限公司生产的大豆植物甾醇;步骤(2)所述乳化剂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、蔗糖酯中的一种以上;步骤(2)所述植物甾醇和乳化剂的质量比为1:1-1:4。
5.根据权利要求1所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述乳化剂与乙酸乙酯的质量体积比为25-100:1mg/mL。
6.根据权利要求1所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述均质处理是采用高速乳化剪切机进行的,所述高速乳化剪切机的转速为10000-40000rpm,均质处理的时间为2-6min。
7.根据权利要求1所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述有机相的体积为蛋白溶液体积的10-30%。
8.根据权利要求1所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述微射流处理的压力为40-90MPa,所述微射流处理的次数为1-3次。
9.根据权利要求1所述的水溶性植物甾醇纳米颗粒的制备方法,其特征在于,步骤(4)中,将混合乳液中的乙酸乙酯去除的方式为旋转蒸发;所述旋转蒸发的温度为40-50℃;所述喷雾干燥的进风温度为150-190℃,喷雾干燥的出风温度为50-80℃,喷雾干燥的料液流速为80-100mL/min。
10.一种由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的水溶性植物甾醇纳米颗粒。
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