CN109601994A - 一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种扇贝分离蛋白‑β‑胡萝卜素乳液的制备方法，包括如下步骤：制备扇贝生殖腺脱脂粉、制备扇贝分离蛋白、制备扇贝分离蛋白溶液、制备油相、制备初级乳液及制备载营养物乳液。本发明以扇贝雌性生殖腺分离蛋白为乳化剂，食用油为载体油相，采用动态高压微射流技术制备乳液，并包埋β‑胡萝卜素，制备一种新型的、稳定的、且可有效递送营养物质的乳液。通过本发明制备的乳液成本较低，且可以提高β‑胡萝卜素稳定性，在食品工业具有较好的应用前景。本发明不仅为β‑胡萝卜素乳液的制备提供了一种新的方法，也进一步扩大了β‑胡萝卜素、扇贝雌性生殖腺在食品领域的应用。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体地说，涉及一种扇贝分离蛋白β-胡萝卜素乳液的制备方法。
背景技术
作为典型的脂溶性生物活性物质，β-胡萝卜素是自然界中分布最广也是目前学者研究最多的类胡萝卜素。作为维生素A的前体，它被广泛用作抗氧化剂和天然着色剂，在预防人体的许多疾病(如癌症、心血管疾病、黄斑退化症、白内障)中发挥着至关重要的作用。然而，由于β-胡萝卜素的多不饱和结构，其通常会在光、热、酶、金属离子、与金属结合的蛋白质和微生物的作用下加速降解，因此其化学不稳定性，低生物利用度以及低水溶性极大的限制了其在多种水溶液中的应用。因此，利用水包油乳液对β-胡萝卜素进行递送可成为解决该问题的良好方法。
食品乳状液是一类重要的食品输送体系，乳化剂则是食品乳状液的一个重要的组成成分，也是稳定食品乳状液的主要成分。研究发现，典型的生物活性负载乳液体系可以通过将亲油性生物活性组分溶解在油相中然后将其与含有乳化剂的水相均质化以形成水包油乳液或纳米乳液来简单地制备，且基于乳液的输送体系适用于包埋类胡萝卜素、姜黄素、白藜芦醇、表没食子儿茶素没食子酸酯等疏水性生物活性物质，增强包埋芯材的生物利用率和小肠上皮细胞的吸收。与合成的表面活性剂和聚合物相比，蛋白质作为一类天然的生物大分子，具有易获得、细胞毒性低、稳定性好等特点，且本身具有亲水和亲油基团，它们能自发地吸附到油-水界面，降低界面张力，是制备水包油型食品乳状液的良好的乳化剂。现如今，用于食品工业的蛋白乳化剂较多，但大多采用乳清蛋白、酪蛋白、大豆蛋白、明胶等。然而，由于饮食偏好和地域限制，食品制造商和消费者正在寻找一些可替代的海洋源蛋白质。目前已经有一些学者以鲢鱼、南美白对虾为乳化剂进行了乳液的构筑，然而以贝类蛋白，尤其是扇贝生殖腺蛋白作为乳化剂构筑乳液系统的研究还相对空缺。
近年来，中国扇贝产业发展迅速，2017年全国扇贝养殖产量高达186万吨。然而在扇贝高产的同时，也产生了大量的食品工业废弃物。虾夷扇贝雌性生殖腺作为贝柱产品生产过程中的可食用副产物，其本身蛋白含量丰富，达到62.89±0.87％(以干重计)，是回收蛋白质的良好原料。此外，采用碱溶酸沉法提取的扇贝雌性生殖腺分离蛋白含有大量的卵黄蛋白，和少量的肌动蛋白，其极易形成疏水和亲水区域，并与油滴结合形成界面涂层。因此，其可以作为一种新型乳化剂应用于食品工业中。
发明内容
为了开发一种新型的脂溶性生物活性物质递送系统，本发明的目的在于提供一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，提高扇贝加工过程中副产物的利用率，同时采用高压微射流技术处理，保证产品乳液的稳定性强，口感细腻，并达到有效递送β-胡萝卜素的目的。
为达到上述目的，本发明提供了一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备扇贝生殖腺脱脂粉：将扇贝生殖腺匀浆，加入正己烷/无水乙醇混合液，搅拌、抽滤，所得滤饼风干后粉碎，过筛，得脱脂粉。
优选方式下，步骤S1所述制备扇贝生殖腺脱脂粉具体为：将扇贝雌性生殖腺2000～3000rpm、匀浆3～5min，加入8～12倍体积的正己烷/无水乙醇(2～3):1，(v:v)混合液，在4℃搅拌6～8h进行脱脂，抽滤去除正己烷和无水乙醇，将滤饼自然风干，球磨仪粉碎，过80～100目筛。
S2、扇贝分离蛋白的制备：将步骤S1所得扇贝生殖腺脱脂粉溶于水，调节pH为碱性，搅拌后取上清液；将所述上清液pH调节为酸性，静置后取沉淀；将所述沉淀溶于去离子水，调节pH至中性，使用磷酸盐缓冲液透析后冻干，得分离蛋白；
优选方式下，步骤S2所述扇贝分离蛋白的制备具体为：将步骤S1所得扇贝雌性生殖腺脱脂粉与水按照料液比1:(5～20)(g:mL)混匀，使用1M NaOH溶液调节pH至10～11.5，室温搅拌1～3h，2000～5000rpm离心15～30min，取上清液用1M HCl溶液调节pH至3～4，室温静置1～3h，于9000～12000rpm离心15～30min后，将沉淀溶于去离子水中，搅拌均匀，pH值调至7，利用2～5KDa的透析膜、10～30mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析20～24h，于1～5Pa，-25℃～-50℃条件下真空冷冻干燥60～72h冻干，即得扇贝雌性生殖腺分离蛋白；
S3、扇贝分离蛋白溶液的制备：取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解，配置成蛋白溶液；
优选方式下，步骤S3所述扇贝分离蛋白溶液的制备具体为：取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入pH3.0～8.0、浓度为3～10mM磷酸盐缓冲溶液，室温搅拌溶解过夜，配置成扇贝分离蛋白浓度为0.1％～0.5％的溶液。
S4、油相的制备：将β-胡萝卜素加热溶解于食用油中，配置成油相待用；
优选方式下，步骤S4所述油相的制备具体为：将β-胡萝卜素添加到食用油中，40～50℃加热20～30min，使β-胡萝卜素溶解于食用油中，制备成β-胡萝卜素含量为0.1％～0.3％的油相；所述油相为玉米油或中链脂肪酸(MCT)。
6、根据权利要求1或5所述扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，步骤S4所述食用油为玉米油或中链脂肪酸。S5、初级乳液的制备：将步骤S4制备的油相加入步骤S3制备的蛋白溶液中，室温下搅拌均匀，分散机分散，得初级乳液；
优选方式下，步骤S5所述分散条件为10000～15000rpm/min高速分散2～3min；所述初级乳液中，油相的含量为2％～5％(w/w)。
S6、载营养物乳液的制备：将步骤S5制备的初级乳液进行均质，随后加入抑菌剂叠氮化钠，即得到扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液；
优选方式下，步骤S6所述均质条件为于9000～12000psi的动态高压微射流下均质3～5次；所述叠氮化钠在扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液中的终浓度为0.01～0.02％(w/w)。
本发明以扇贝雌性生殖腺分离蛋白为乳化剂，两种不同的食用油—玉米油(长链脂肪酸)和MCT(中链脂肪酸)为载体油相，采用动态高压微射流技术制备乳液，并包埋β-胡萝卜素，制备一种新型的、稳定的、且可有效递送营养物质，并控制其释放的乳液。通过本发明制备的乳液成本较低，且可以提高β-胡萝卜素的水溶性、稳定性和生物利用率，在食品工业具有较好的应用前景。
本发明的有益效果是：
1、本发明方法提高了虾夷扇贝加工过程中可食用副产物的利用率，使其蛋白资源得到充分开发利用，同时减少了扇贝副产物对环境的污染，对扇贝生殖腺资源的开发利用具有重要意义。
2、本发明采用动态高压微射流技术微化乳液，解决了乳液粒径大、稳定性差等技术难题；生产出的乳液包埋率高、口感细腻，稳定性强，扩大了扇贝雌性生殖腺分离蛋白、β-胡萝卜素在食品领域的应用范围。
3、采用扇贝生殖腺分离蛋白作为乳化剂包埋水溶性差的β-胡萝卜素，能够提高β-胡萝卜素的热稳定性及其在人体内的消化吸收利用率，使产品具有较高的营养价值，为β-胡萝卜素的应用提供了新的思路。
4、本发明具有工艺简单、操作安全等特点，在食品行业上的应用具有广阔的发展前景。
迄今为止，在公开的文件中，还未见到过用扇贝生殖腺分离蛋白作为乳化剂有效递送β-胡萝卜素的报道，所述递送是指将β-胡萝卜素制备成乳液服用，通过胃肠道消化使其在小肠内有效释放，在提高β-胡萝卜素稳定性的同时最大程度的保留生物可及度即消化吸收利用率。
附图说明
图1为扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下的粒径分布图；
图2为扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下的平均粒径和zeta电位；
图3为扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下在4℃、室温及37℃存放15天后平均粒径图；
图4为扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下在4℃、室温及37℃存放15天后zeta电位图；
图5为扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下在4℃、室温及37℃存放30天后平均粒径图；
图6为扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下在4℃、室温及37℃存放30天后zeta电位图；
图7为实施例1制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放15天后的微观结构图；
图8为实施例1制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放15天后的微观结构图；
图9为实施例1制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放15天后的微观结构图；
图10为实施例2制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放15天后的微观结构图；
图11为实施例2制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放15天后的微观结构图；
图12为实施例2制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放15天后的微观结构图；
图13为实施例3制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放15天后的微观结构图；
图14为实施例3制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放15天后的微观结构图；
图15为实施例3制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放15天后的微观结构图；
图16为实施例4制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放15天后的微观结构图；
图17为实施例4制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放15天后的微观结构图；
图18为实施例4制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放15天后的微观结构图；
图19为实施例5制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放15天后的微观结构图；
图20为实施例5制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放15天后的微观结构图；
图21为实施例5制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放15天后的微观结构图；
图22为实施例1制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放30天后的微观结构图；
图23为实施例1制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放30天后的微观结构图；
图24为实施例1制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放30天后的微观结构图；
图25为实施例2制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放30天后的微观结构图；
图26为实施例2制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放30天后的微观结构图；
图27为实施例2制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放30天后的微观结构图；
图28为实施例3制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放30天后的微观结构图；
图29为实施例3制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放30天后的微观结构图；
图30为实施例3制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放30天后的微观结构图；
图31为实施例4制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放30天后的微观结构图；
图32为实施例4制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放30天后的微观结构图；
图33为实施例4制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放30天后的微观结构图；
图34为实施例5制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃存放30天后的微观结构图；
图35为实施例1制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在室温存放30天后的微观结构图；
图36为实施例1制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在37℃存放30天后的微观结构图；
图37为扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下在4℃、室温及37℃存放30天后β-胡萝卜素保留率；
图38为扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下经胃肠道消化后β-胡萝卜素的生物可及度。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，经过下列工艺步骤：
S1、制备扇贝生殖腺脱脂粉：将扇贝雌性生殖腺2000pm、匀浆5min，加入10倍体积的正己烷/无水乙醇(3:1，v:v)混合液，在4℃搅拌6h进行脱脂，抽滤，将滤饼自然风干，球磨仪粉碎，过100目筛，得脱脂粉。
S2、制备扇贝分离蛋白：将扇贝雌性生殖腺脱脂粉与水按料液比1:5(g/mL)的比例混匀，使用1M NaOH调节pH11.5，室温搅拌2h，2000rpm离心15min取上清用1M HCl溶液调节pH3.8，室温静置2h，9000rpm离心30min后，将沉淀溶于去离子水中，搅拌均匀，pH值调至7，利用2KDa的透析膜、10mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析20h，于1Pa，-25℃条件下真空冷冻干燥60h冻干，即得扇贝雌性生殖腺分离蛋白；
S3、扇贝雌性生殖腺分离蛋白溶液的制备：称取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入浓度5mM pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液中，室温搅拌过夜，配制成质量浓度为0.25％(w/w)的蛋白溶液；
S4、油相的制备：将β-胡萝卜素加入到玉米油中，50℃加热20min，使其溶解于玉米油(长链脂肪酸)中，配制成油相待用，所述油相中β-胡萝卜素的含量为0.1％(w/w)；
S5、初级乳液制备：将步骤S4制备的油相加入步骤S3制备的蛋白溶液中，室温下搅拌均匀，于15000rpm/min高速分散2min，得初级乳液，所述初级乳液中油相的含量为2％(w/w)；
S6、载营养物乳液的制备：将步骤S5制备的初级乳液于12000psi的动态高压微射流下均质3次，随后加入0.02％(w/w)抑菌剂叠氮化钠，即得到包埋β-胡萝卜素的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液；
本实施例制备的可有效递送β-胡萝卜素的乳液，其乳液粒径为340nm，zeta电位为-44mV，4℃、室温及37℃下，30天后β-胡萝卜素保留率分别为为78％，56％和41％，经胃肠道消化后β-胡萝卜素的生物可及度达65.5％。
实施例2
一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，经过下列工艺步骤：
S1、制备扇贝生殖腺脱脂粉：将扇贝雌性生殖腺2500pm、匀浆4min，加入10倍体积的正己烷/无水乙醇(2:1，v:v)混合液，在4℃搅拌7h进行脱脂，抽滤，将滤饼自然风干，球磨仪粉碎，过100目筛，得脱脂粉。
S2、扇贝分离蛋白的制备：将扇贝雌性生殖腺脱脂粉与水按料液比1:20(g/mL)的比例混匀，使用1M NaOH调节pH11.5，室温搅拌2h，2000rpm离心15min取上清用1M HCl溶液调节pH3.8，室温静置2h，10000rpm离心20min后，将沉淀溶于去离子水中，搅拌均匀，pH值调至7，利用3KDa的透析膜、10mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析24h，于2Pa，-40℃条件下真空冷冻干燥70h冻干，即得扇贝雌性生殖腺分离蛋白；
S3、扇贝雌性生殖腺分离蛋白溶液的制备：称取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液(5mM)中，室温搅拌过夜，并配制成质量浓度为0.25％(w/w)的蛋白溶液。
S4、油相的制备：将β-胡萝卜素加入到MCT中，于40℃加热30min，使其溶解于MCT(中链脂肪酸)中，配制成油相待用，所述油相中β-胡萝卜素的含量为0.1％(w/w)；
S5、初级乳液制备：将步骤S4制备的油相加入步骤S3制备的蛋白溶液中，室温下搅拌均匀，于10000rpm/min高速分散3min，所述初级乳液中油相的含量为2％(w/w)；
S6、载营养物乳液的制备：将步骤S5制备的初级乳液于11000psi的动态高压微射流下均质4次，随后加入0.01％(w/w)抑菌剂叠氮化钠，即得到包埋β-胡萝卜素的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液；
本实施例制备的可有效递送β-胡萝卜素的乳液，其乳液粒径为300nm，zeta电位为-23mV，4℃、室温及37℃下，30天后β-胡萝卜素保留率分别为为67％，20％和13％，经胃肠道消化后β-胡萝卜素的生物可及度达23.1％。
实施例3
一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，经过下列工艺步骤：
S1、制备扇贝生殖腺脱脂粉：将扇贝雌性生殖腺3000pm、匀浆3min，加入10倍体积的正己烷/无水乙醇(3:1，v:v)混合液，在4℃搅拌8h进行脱脂，抽滤，将滤饼自然风干，球磨仪粉碎，过100目筛，得脱脂粉。
S2、扇贝分离蛋白的制备：，将扇贝雌性生殖腺脱脂粉与水按料液比1:10(g/mL)的比例混匀，使用1M NaOH调节pH11.5条件下室温搅拌2h，2000rpm离心15min取上清，用1MHCl溶液调节pH3.8，室温静置2h，12000rpm离心15min后，将沉淀溶于去离子水中，搅拌均匀，pH值调至7，利用2KDa的透析膜、10mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析22h，于5Pa，-50℃条件下真空冷冻干燥72h冻干，即得扇贝雌性生殖腺分离蛋白；
S3、扇贝雌性生殖腺分离蛋白溶液的制备：称取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液(5mM)中，室温搅拌过夜，并配制成质量浓度为0.50％(w/w)的蛋白溶液。
S4、油相的制备：将β-胡萝卜素加入到玉米油中，于45℃加热30min，使其溶解于玉米油(长链脂肪酸)中，配制成油相待用，油相中β-胡萝卜素的含量为0.1％(w/w)；
S5、初级乳液制备：将步骤S4制备的油相加入步骤S3制备的蛋白溶液中，室温下搅拌均匀，于12000rpm/min高速分散2min，所述初级乳液中油相的含量为2％(w/w)；
S6、载营养物乳液的制备：将步骤S5制备的初级乳液于9000psi的动态高压微射流下均质5次，随后加入0.02％(w/w)抑菌剂叠氮化钠，即得到包埋β-胡萝卜素的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液；
本实施例制备的可有效递送β-胡萝卜素的乳液，其乳液粒径为308nm，zeta电位为-51mV，4℃、室温及37℃下，30天后β-胡萝卜素保留率分别为为82％，64％和42％，经胃肠道消化后β-胡萝卜素的生物可及度达56.6％。
实施例4
一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，经过下列工艺步骤：
S1、制备扇贝生殖腺脱脂粉：将扇贝雌性生殖腺2000pm、匀浆5min，加入10倍体积的正己烷/无水乙醇(3:1，v:v)混合液，在4℃搅拌6h进行脱脂，抽滤，将滤饼自然风干，球磨仪粉碎，过100目筛，得脱脂粉。
S2、扇贝分离蛋白的制备：将扇贝生殖腺脱脂粉与水按料液比1:15(g/mL)的比例混匀，使用1M NaOH调节pH11.5，室温搅拌2h，2000rpm离心15min取上清用1M HCl溶液调节pH3.8，室温静置2h，11000rpm离心15min后，将沉淀溶于去离子水中，搅拌均匀，pH值调至7，利用5KDa的透析膜、10mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析20h，于1Pa，-25℃条件下真空冷冻干燥60h冻干，即得扇贝雌性生殖腺分离蛋白；
S3、扇贝分离蛋白溶液的制备：称取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液(5mM)中，室温搅拌过夜，并配制成质量浓度为0.30％(w/w)的蛋白溶液。
S4、油相的制备：将β-胡萝卜素加入到MCT中，于45℃加热30min，使其溶解于MCT(中链脂肪酸)中，配制成油相待用，所述油相中β-胡萝卜素的含量为0.1％(w/w)；
S5、初级乳液制备：将步骤S4制备的油相加入步骤S3制备的蛋白溶液中，室温下搅拌均匀，于12000rpm/min高速分散2min；
S5、载营养物乳液的制备：将步骤S4制备的初级乳液于12000psi的动态高压微射流下均质5次，随后加入0.02％(w/w)抑菌剂叠氮化钠，即得到包埋β-胡萝卜素的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液，所述初级乳液中油相的含量为2％；
本实施例制备的可有效递送β-胡萝卜素的乳液，其乳液粒径为270nm，zeta电位为-28mV，4℃、室温及37℃下，30天后β-胡萝卜素保留率分别为为62％，23％和15％，经胃肠道消化后β-胡萝卜素的生物可及度达27.1％。
实施例5
一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，经过下列工艺步骤：
S1、制备扇贝生殖腺脱脂粉：将扇贝雌性生殖腺3000pm、匀浆4min，加入10倍体积的正己烷/无水乙醇(2:1，v:v)混合液，在4℃搅拌8h进行脱脂，抽滤，将滤饼自然风干，球磨仪粉碎，过100目筛，得脱脂粉。
S2、制备扇贝分离蛋白：将扇贝雌性生殖脱脂粉与水按料液比1:15(g/mL)的比例混匀，使用1M NaOH调节pH11.5，室温搅拌2h，4000rpm离心15min取上清用1M HCl溶液调节pH3.8，室温静置2h，12000rpm离心15min后，将沉淀溶于去离子水中，搅拌均匀，pH值调至7，利用3KDa的透析膜、10mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析24h，于1Pa，-50℃条件下真空冷冻干燥72h冻干，即得扇贝雌性生殖腺分离蛋白；
S3、扇贝分离蛋白溶液的制备：称取步骤S2制得的扇贝分离蛋白，加入pH 8.0的磷酸盐缓冲溶液(5mM)中，室温搅拌过夜，并配制成质量浓度为0.40％(w/w)的蛋白溶液。
S4、油相的制备：将β-胡萝卜素加入到MCT中，于45℃加热30min，使其溶解于MCT(中链脂肪酸)中，配制成油相待用，所述油相中β-胡萝卜素的含量为0.1％(w/w)；
S5、初级乳液制备：将步骤S4制备的油相加入步骤S3制备的蛋白溶液中，室温下搅拌均匀，于12000rpm/min高速分散2min，所述初级乳液中油相的含量为2％；
S5、载营养物乳液的制备：将步骤S4制备的初级乳液于12000psi的动态高压微射流下均质5次，随后加入0.02％(w/w)抑菌剂叠氮化钠，即得到包埋β-胡萝卜素的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液；
本实施例制备的可有效递送β-胡萝卜素的乳液，其乳液粒径为303nm，zeta电位为-31mV，4℃、室温及37℃下，30天后β-胡萝卜素保留率分别为为69％，24％和18％，经胃肠道消化后β-胡萝卜素的生物可及度达31.0％。
实施例6
一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，经过下列工艺步骤：
S1、制备扇贝生殖腺脱脂粉：将扇贝雌性生殖腺2000pm、匀浆5min，加入8倍体积的正己烷/无水乙醇(3:1，v:v)混合液，在4℃搅拌6h进行脱脂，抽滤，将滤饼自然风干，球磨仪粉碎，过90目筛，得脱脂粉。
S2、扇贝分离蛋白的制备：将扇贝生殖腺脱脂粉与水按料液比1:15(g/mL)的比例混匀，使用1M NaOH调节pH10，室温搅拌1h，5000rpm离心20min取上清用1M HCl溶液调节pH3，室温静置1h，12000rpm离心15min后，将沉淀溶于去离子水中，搅拌均匀，pH值调至7，利用5KDa的透析膜、30mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析20h，于1Pa，-25℃条件下真空冷冻干燥60h冻干，即得扇贝雌性生殖腺分离蛋白；
S3、扇贝分离蛋白溶液的制备：称取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入pH 3.0的磷酸盐缓冲溶液(3mM)中，室温搅拌过夜，配制成质量浓度为0.10％(w/w)的蛋白溶液。
S4、油相的制备：将β-胡萝卜素于加入到MCT中，45℃加热25min，使其溶解于MCT(中链脂肪酸)中，配制成油相待用，所述油相中β-胡萝卜素的含量为0.3％(w/w)；
S5、初级乳液制备：将步骤S4制备的油相加入步骤S3制备的蛋白溶液中，室温下搅拌均匀，于12000rpm/min高速分散2min；
S5、载营养物乳液的制备：将步骤S4制备的初级乳液于12000psi的动态高压微射流下均质5次，随后加入0.02％(w/w)抑菌剂叠氮化钠，即得到包埋β-胡萝卜素的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液，所述初级乳液中油相的含量为5％；
本实施例制备的可有效递送β-胡萝卜素的乳液，其乳液粒径为305nm，zeta电位为-30mV，4℃、室温及37℃下，30天后β-胡萝卜素保留率分别为为65％，22％和20％，经胃肠道消化后β-胡萝卜素的生物可及度达29.8％。
实施例7
一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，经过下列工艺步骤：
S1、制备扇贝生殖腺脱脂粉：将扇贝雌性生殖腺2000pm、匀浆5min，加入12倍体积的正己烷/无水乙醇(3:1，v:v)混合液，在4℃搅拌6h进行脱脂，抽滤，将滤饼自然风干，球磨仪粉碎，过80目筛，得脱脂粉。
S2、扇贝分离蛋白的制备：将扇贝生殖腺脱脂粉与水按料液比1:10(g/mL)的比例混匀，使用1M NaOH调节pH10，室温搅拌3h，5000rpm离心30min取上清，用1M HCl溶液调节pH3，室温静置3h，12000rpm离心15min后，将沉淀溶于去离子水中，搅拌均匀，pH值调至7，利用5KDa的透析膜、20mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析22h，于1Pa，-25℃条件下真空冷冻干燥60h冻干，即得扇贝雌性生殖腺分离蛋白；
S3、扇贝分离蛋白溶液的制备：称取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入pH 5.0的磷酸盐缓冲溶液(10mM)中，室温搅拌过夜，配制成质量浓度为0.10％(w/w)的蛋白溶液。
S4、油相的制备：将β-胡萝卜素加入到MCT中，于45℃加热25min，使其溶解于MCT(中链脂肪酸)中，配制成油相待用，所述油相中β-胡萝卜素的含量为0.2％(w/w)；
S5、初级乳液制备：将步骤S4制备的油相加入步骤S3制备的蛋白溶液中，室温下搅拌均匀，于12000rpm/min高速分散2min；
S5、载营养物乳液的制备：将步骤S4制备的初级乳液于12000psi的动态高压微射流下均质5次，随后加入0.02％(w/w)抑菌剂叠氮化钠，即得到包埋β-胡萝卜素的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液，所述初级乳液中油相的含量为3％；
本实施例制备的可有效递送β-胡萝卜素的乳液，其乳液粒径为298nm，zeta电位为-25mV，4℃、室温及37℃下，30天后β-胡萝卜素保留率分别为为61％，25％和14％，经胃肠道消化后β-胡萝卜素的生物可及度达26.0％。
对各个实施例制备的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的粒径、Zeta电位、微观结构、β-胡萝卜素保留率及模拟胃肠道消化后β-胡萝卜素生物可及度进行测定：取适量乳液(4℃、室温和37℃存放15天及30天)稀释100倍后，采用激光粒度仪进行粒径分布、平均粒径以及Zeta电位的检测；采用激光扫描共聚焦显微镜进行微观结构检测；采用紫外分光光度计进行β-胡萝卜素保留率的检测(并以溶于油相的游离的β-胡萝卜素作为对照)及生物可及度的测定。具体分析及理论依据如下：
(1)比较各实施例下制备的乳液的初始粒径分布，平均粒径及zeta电位；
(2)测定各实施例下制备的乳液分别在4℃、室温及37℃存放15天及30天的粒径以及zeta电位的变化；
(3)测定各实施例下制备的乳液分别在4℃、室温及37℃存放30天的β-胡萝卜素保留率；
(4)测定各实施例下制备的乳液分别在4℃、室温及37℃存放15天及30天的乳液微观结构；
(5)乳液粒径分布越窄，平均粒径越小，体系越均匀稳定；
(6)Zeta电位绝对值越大，体系相对越稳定；
(7)乳液微观结构油滴分布越均一，体系越均匀稳定；
(8)β-胡萝卜素保留率保留率越高，体系越稳定。
图1为本发明实施例制备的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下的粒径分布图。本发明制备的几种乳液均表现出相对较窄的单峰，说明粒径分布均匀。此外，由图2的结果也可知，与MCT作为载体油相制备的乳液(实施例1，3)相比，由玉米油作为油相制备的乳液(实施例2，4，5)相对粒径较大，但zeta电位绝对值也较大，这可能与油相的粘度有关。通常，高压微射流中液滴破碎的效率会随着分散相的粘度降低而增加。与MCT相比，玉米油具有更高的粘度和更多的阴离子杂质。因此，玉米油稳定的乳液的液滴破裂在微流化期间变得不太有效，这将导致形成更大的液滴并且带电更多。由此可见，MCT乳液具有相对较小的粒径，体系更加稳定。
图3～6为本发明实施例制备的扇贝雌性生殖腺分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在4℃、室温及37℃存放15和30天后平均粒径和zeta电位的变化。由图可见，经过30天的贮存后，37℃下乳液的粒径和zeta电位的变化要高于4℃和室温，但由图7～36的结果也可知，本发明实施例制备的乳液于37℃存放30天后，并没有发生明显的液滴聚集，这说明本发明实施例制备的乳液在30天内是很稳定的。
图37为本发明实施例制备的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下在4℃、室温及37℃存放30天后β-胡萝卜素保留率。由图可知，本发明实施例制备的乳液其β-胡萝卜素保留率要高于游离的β-胡萝卜素对照，且使用玉米油作为油相载体制备乳液(实施例1，3)的β-胡萝卜素保留率要显著高于使用MCT作为油相载体制备乳液(实施例2，4，5)。其中，所述游离的β-胡萝卜素对照为图37中的玉米油对照和MCT对照，即将胡萝卜素直接溶于玉米油或MTC中，不使用蛋白溶液包埋。
图38为本发明实施例制备的扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液在不同实施例条件下经胃肠道消化后β-胡萝卜素的生物可及度。所谓生物可及度是指乳液经过胃肠道消化后，溶解在胶束相中的胡萝卜素与初始乳液中的胡萝卜素的比值，它能够反映胡萝卜素的生物可及度。由图可知，经胃肠道消化后(口相，胃相，小肠相)，使用玉米油制备的乳液其β-胡萝卜素的生物可及度要显著高于使用MCT制备的乳液，其原因可能是，β-胡萝卜素是一种高度疏水的线性棒状结构分子，其有利于通过整个胶束核心与表面活性剂胶束成功结合。而长链脂肪酸比中链脂肪酸更容易形成胶束，它的疏水核心尺寸更大，因此具有更大的增溶能力。
由此可见，扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液因其较好的稳定性和较高的递送能力即生物可及度，可广泛应用于工业生产中，以提高β-胡萝卜素等亲脂性生物活性物质的消化吸收和生物可及度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，包括如下步骤：
S1、制备扇贝生殖腺脱脂粉：将扇贝生殖腺匀浆，加入正己烷/无水乙醇混合液，搅拌、抽滤，所得滤饼风干后粉碎，过筛，得脱脂粉；
S2、扇贝分离蛋白的制备：将步骤S1所得扇贝生殖腺脱脂粉溶于水，调节pH为碱性，搅拌后取上清液；将所述上清液pH调节为酸性，静置后取沉淀；将所述沉淀溶于去离子水，调节pH至中性，使用磷酸盐缓冲液透析后冻干，得分离蛋白；
S3、扇贝分离蛋白溶液的制备：取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入磷酸盐缓冲溶液，搅拌溶解，配置成蛋白溶液；
S4、油相的制备：将β-胡萝卜素加热溶解于食用油中，配置成油相待用；
S5、初级乳液的制备：将步骤S4制备的油相加入步骤S3制备的蛋白溶液中，室温下搅拌均匀，分散，得初级乳液；
S6、载营养物乳液的制备：将步骤S5制备的初级乳液进行均质，加入叠氮化钠，得扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液。
2.根据权利要求1所述扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，所述制备扇贝生殖腺脱脂粉具体为：将扇贝雌性生殖腺2000～3000rpm、匀浆3～5min，加入8～12倍体积的正己烷/无水乙醇混合液，在4℃搅拌6～8h进行脱脂，抽滤去除正己烷和无水乙醇，将滤饼自然风干，球磨仪粉碎，过80～100目筛；
其中，所述正己烷/无水乙醇混合液中，正己烷和无水乙醇的体积比为(2～3):1。
3.根据权利要求1所述扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，步骤S1所得扇贝生殖腺脱脂粉与水按照料液比1:(5～20)g:mL混匀，调节pH至10～11.5，室温搅拌1～3h，2000～5000rpm离心15～30min，取上清液调节pH至3～4，室温静置1～3h，于9000～12000rpm离心15～30min后，将沉淀溶于去离子水中，搅拌均匀，pH值调至7，利用2～5KDa的透析膜、10～30mM pH7.4的磷酸盐缓冲溶液透析20～24h，于1～5Pa，-25℃～-50℃条件下真空冷冻干燥60～72h冻干，即得扇贝雌性生殖腺分离蛋白。
4.根据权利要求1所述扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，步骤S3所述扇贝分离蛋白溶液的制备具体为：取步骤S2制得的扇贝雌性生殖腺分离蛋白，加入pH3.0～8.0、浓度为3～10mM磷酸盐缓冲溶液，室温搅拌溶解过夜，配置成扇贝分离蛋白浓度按重量计算为0.1％～0.5％的溶液。
5.根据权利要求1所述扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，步骤S4所述油相的制备具体为：将β-胡萝卜素加入到食用油中，40～50℃加热20～30min，制备成β-胡萝卜素的含量按重量计算为0.1％～0.3％的油相。
6.根据权利要求1或5所述扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，步骤S4所述食用油为玉米油或中链脂肪酸。
7.根据权利要求1所扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，步骤S5所述分散具体为：10000～15000rpm/min分散2～3min。
8.根据权利要求1所述扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，步骤S5所述初级乳液中，油相的含量按重量计算为2％～5％。
9.根据权利要求1所述扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，步骤S6所述均质具体为：9000～12000psi动态高压微射流下均质3～5次。
10.根据权利要求1所述扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液的制备方法，其特征在于，步骤S6所述叠氮化钠在扇贝分离蛋白-β-胡萝卜素乳液中的终浓度以重量计为0.01～0.02％。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190412 |
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