CN113311080B - 多种维生素d代谢物联合检测方法及其检测试剂盒和应用 - Google Patents

多种维生素d代谢物联合检测方法及其检测试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及多种维生素D代谢物联合检测方法及其检测试剂盒和应用。本发明提供的检测维生素D代谢物的方法为采用液相色谱串联质谱法进行检测，其中，液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为含有醋酸锂的水溶液，所述流动相B为含有醋酸锂的甲醇溶液。该方法可实现25OHD3、25OHD2、1,25(OH)2D3、1,25(OH)2D2、24,25(OH)2D3、24,25(OH)2D2的同时检测，可同时区分多种同分异构体和干扰；具有较高的灵敏度和特异性，且不需要衍生化处理，节约样本前处理时间，为维生素D代谢物的高通量检测提供便利。

Description

多种维生素D代谢物联合检测方法及其检测试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及多种维生素D代谢物联合检测方法及其检测试剂盒和应用。
背景技术
维生素D(vitaminD)是一种人体必须的脂溶性、类固醇类维生素，维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)是维生素D家族成员中最重要的成员，具有广泛的生理代谢活性。维生素D经过肝脏和肾脏代谢，会产生一系列代谢物，其中包括25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1,25二羟基维生素D3、1,25二羟基维生素D2、24,25二羟基维生素D3、24,25二羟基维生素D2等。
维生素D代谢物在体内的含量较低，且不同代谢物在结构、性质方面较为相似，且存在不同的同分异构体，这使得实现多种维生素D代谢物的同时有效检测存在较大难度。现有技术中的多数检测方法或依赖样品衍生，或仅能够实现个别代谢物的检测。因此，建立同时检测多种维生素代谢物、且具有较高特异性和灵敏度的检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供维生素D代谢物的检测方法，该方法能够同时检测25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1,25二羟基维生素D3、1,25二羟基维生素D2、24,25二羟基维生素D3、24,25二羟基维生素D2这六种维生素代谢物。本发明的另一目的是提供基于该方法的检测试剂盒及其应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供检测维生素D代谢物的方法，该方法采用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)进行检测，其中，液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为含有醋酸锂的水溶液，所述流动相B为含有醋酸锂的甲醇溶液。
优选地，所述流动相A和所述流动相B中，醋酸锂的浓度为0.18-0.22mM。
进一步优选地，所述流动相A和所述流动相B中，醋酸锂的浓度为0.2mM。
本发明发现，在对25-羟基维生素D3(25OHD3)、25-羟基维生素D2(25OHD2)、1,25二羟基维生素D3(1,25(OH)2D3)、1,25二羟基维生素D2(1,25(OH)2D2)、24,25二羟基维生素D3(24,25(OH)2D3)、24,25二羟基维生素D2(24,25(OH)2D2)进行同时检测时，采用25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2等检测常用的流动相无法将六种代谢物与其他结构类似物和同分异构体(例如：3-epi 25-羟基维生素D3、3-epi 24,25-羟基维生素D3、23R,25-羟基维生素D3、4β,25-二羟基维生素D3)很好地分离，而且，这些流动相在不对样品进行衍生的情况下，较难保证各代谢物均具有较高的灵敏度。在研发过程中，本发明发现，在流动相中引入醋酸锂能够使得六种维生素D代谢物很好地分离，且能够显著提高各代谢物检测的灵敏度。进一步对醋酸锂的浓度进行优化，确定采用上述含有特定浓度的醋酸锂的水溶液和甲醇溶液作为流动相。
优选地，所述流动相按照以下梯度进行梯度洗脱：0-0.2min，流动相A 75-78％，0.2-0.3min，流动相A 78-30％，0.3-6.0min，流动相A 30-29％，6.0-9.0min，流动相A 29-28％，9.0-10.0min，流动相A28-27％，10.0-10.5min，流动相A 27-20％，10.5-12.5min，流动相A 20％，12.5-12.6min，流动相A 20-5％，12.6-13.1min，流动相A5％，13.1-13.2min，流动相A 5-75％，13.2-14.0min，流动相A 75％。
上述梯度洗脱能够将六种维生素D代谢物很好地分离，并保证各代谢物均具有较高的灵敏度。
优选地，液相色谱的洗脱过程中，流动相的流速为0.2-0.6mL/min。
进一步优选地，流动相的流速为0.3mL/min。
上述液相色谱中，色谱柱的柱温优选为20-42℃。更优选为25℃。
本发明所述的检测方法中，液相色谱的色谱柱优选为Ascentis Express F5 2.1×100mm，2.7μm。
本发明所述的检测方法中，在液相色谱分离前，还包括样品前处理步骤，样品前处理可采用SPE柱进行，或者，不采用SPE柱，通过蛋白沉淀剂对样品蛋白沉淀处理，得到含有维生素D代谢物的上清。
采用SPE柱进行样品前处理可采用如下方法：首先使用甲醇、水活化SPE柱，之后加入血清样本，再加入正己烷洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干，再用复溶液复溶后进行液相色谱检测。
为节约检测成本，优选采用通过蛋白沉淀剂对样品蛋白沉淀处理的方法。具体地，所述样品前处理包括：将所述样品与内标液和甲醇混合得到第一混合液，再将所述第一混合液与硫酸锌水溶液以及正己烷和乙酸乙酯的混合溶液混合，得到第二混合液，将所述第二混合液的上清与沉淀分离，将所述上清经干燥、复溶后进行液相色谱分离。
优选地，样品前处理体系中，硫酸锌的终浓度为20-30mM，正己烷和乙酸乙酯的用量分别为样品体积的3-5倍和0.8-1.2倍。
进一步优选地，样品前处理体系中，硫酸锌的终浓度为24-26mM，正己烷和乙酸乙酯的用量分别为样品体积的4倍和1倍。
优选地，样品前处理体系中，甲醇的用量为样品体积的0.8-1.2倍，内标液的用量为样品体积的20-30％。
进一步优选地，样品前处理体系中，甲醇的用量为样品体积的1倍，内标液的用量为样品体积的25％。
优选地，所述复溶采用的复溶液为50％的甲醇水溶液。
上述样品前处理方法解决了现有方法中样本前处理需要保证低温操作，样本前处理过程复杂，需要PTAD衍生、增加前处理时间，需要使用SPE，增加成本等问题，具有操作简单易行、不需要衍生、前处理时间短、成本低的优势。
本发明所述的检测方法中，质谱检测条件如下：正离子、点喷雾电离、MRM采集定量离子对，Gas1、Gas2、气帘气和碰撞气分别为60psi，60psi，30psi和medium，离子喷雾电压为5500v，最佳探针温度为400℃。
上述质谱检测能够与本发明的液相色谱检测分离条件很好地配合作用，提高检测的特异性和灵敏度。
优选地，所述定量离子对如下：25OHD3的母离子为m/z 407.4，子离子为m/z389.3，25OHD2的母离子为m/z 419.3，子离子为m/z401.4，1,25(OH)2D3的母离子为m/z423.4，子离子为m/z 387.4，1,25(OH)2D2的母离子为m/z 435.4，子离子为m/z 381.4，24,25(OH)2D3的母离子为m/z 423.4，子离子为m/z 405.4，24,25(OH)2D2的母离子为m/z 435.4，子离子为m/z 417.4，25OHD3-d3的母离子为m/z410.4，子离子为m/z 392.3，25OHD2-d3的母离子为m/z 422.3，子离子为m/z404.4，1,25(OH)2D3-d3的母离子为m/z 426.3，子离子为m/z372.4，24,25(OH)2D3-d6的母离子为m/z 429.4，子离子为m/z 411.4。
本发明中，所述的样品可为血液样品，包括但不限于血清。
本发明的检测方法可用于维生素D代谢物的定性检测或定量检测。在进行定量检测时，利用不同浓度的标准品制作标准曲线，根据标准曲线进行样品中维生素D代谢物的定量。本发明发现，采用本发明的检测方法进行检测，标准曲线的相关系数高，能够满足定量检测的要求。
第二方面，本发明提供维生素D代谢物检测试剂盒，该试剂盒包括：
试剂I：含醋酸锂的浓度为0.18-0.22mM的水溶液，用于作为液相色谱分离的流动相A；
试剂II：含醋酸锂的浓度为0.18-0.22mM的甲醇溶液，用于作为液相色谱分离的流动相B；
试剂III：0.1-0.5M硫酸锌水溶液以及试剂IV：体积比为8:2的正己烷和乙酸乙酯混合溶液；用于作为样品前处理步骤的蛋白沉淀剂。
可选地，所述试剂盒还包括：
试剂V：25OHD3-d3、25OHD2-d3、24,25(OH)2D3-d6、1,25(OH)2D3-d6的混合溶液，用于作为内标液；
试剂VI：甲醇水溶液(优选为50％的甲醇水溶液)，用于作为复溶液；
试剂VII：25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1,25二羟基维生素D3、1,25二羟基维生素D2、24,25二羟基维生素D3、24,25二羟基维生素D2的标准品，用于作为质控品。
上述试剂盒可采用本发明所述的维生素D代谢物的检测方法进行使用。
第三方面，本发明提供所述试剂盒在维生素D代谢物检测中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明建立了基于液相色谱串联质谱检测维生素D代谢物的方法，该方法可实现25OHD3、25OHD2、1,25(OH)2D3、1,25(OH)2D2、24,25(OH)2D3、24,25(OH)2D2的同时检测，可同时区分包括3-epi 25(OH)D3、3-epi 24,25(OH)2D3、23R,25(OH)D3、4β,25(OH)2D等在内的多种同分异构体和干扰；该方法具有较高的灵敏度，可直接检测待测物的分子量(质荷比)，具有较高的特异性，避免复杂血液成分中的干扰；且不需要衍生化处理，节约样本前处理时间，为维生素D代谢物的高通量检测提供便利。
附图说明
图1为本发明实验例1中25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1,25二羟基维生素D3、1,25二羟基维生素D2、24,25二羟基维生素D3、24,25二羟基维生素D2的液相色谱图。
图2为本发明实验例1中维生素D代谢物与干扰物分离的液相色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供维生素D代谢物的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱法进行检测，具体如下：
1、样品前处理
向5mL玻璃管中依次加入200μL血清样品、标准品或质控品，再依次加入50μL混合内标溶液和200μL甲醇，充分混匀；然后加入500μL 0.1M硫酸锌水溶液、1mL正己烷和乙酸乙酯的混合溶液(正己烷和乙酸乙酯的体积比为8:2)，涡旋、混匀、12000g离心5min，取上清750μL转移到2mL的96孔板中，经氮气(37℃)吹干；加入100μL甲醇水溶液复溶(V:V＝5:5)，得到待测样品。取40μL待测样品进行LC-MS/MS分析检测。
混合内标溶液：各代谢物的浓度分别为：25OHD3-d3(50ng/mL)、25OHD2-d3(20ng/mL)、24,25(OH)2D3-d6(10ng/mL)、1,25(OH)2D3-d6(0.5ng/mL)。
用于校准的校准溶液如表1所示。
表1校准溶液
Figure BDA0003058563440000071
2、液相色谱检测
流动相：流动相A：含有0.2mmol/L醋酸锂的水溶液；
流动相B：含有0.2mmol/L醋酸锂的甲醇溶液；
流动相的配制：先配制100mM醋酸锂溶液，配制方法如下：准确称量1.3197g醋酸锂，溶解于200mL水中，配制成100mM醋酸锂溶液作为母液保存于玻璃瓶，并放置于4℃冰箱保存；将醋酸锂溶液分别与水和甲醇混合得到流动相A和B。
洗脱程序：梯度洗脱程序如表2所示。
表2液相梯度
Figure BDA0003058563440000081
液相色谱柱：采用Ascentis Express F5(2.1×100mm；2.7μm)色谱柱进行液相分离。
进样量：50μl。
流速：以0.3mL/min的流速进行梯度洗脱。
柱温箱温度设置为25℃。
仪器设备：LC-MS/MS系统，该系统由Shimadzu HPLC system(Shimadzu,Japan)(液相色谱仪)和APCI 6500Qtrap串联四极杆质谱仪(AB SCIEX,USA)组成。
3、质谱检测
采集模式：正离子、点喷雾电离、MRM。Gas1，Gas2，气帘气和碰撞气分别为60psi，60psi，30psi和medium。离子喷雾电压为5500v，最佳探针温度为400℃。
采集待测物的离子通道中均为待测物加锂的离子对。在前期方法学开发过程中，使用三通同时连接流动相、蠕动注射泵和质谱，获取响应最高、稳定性和选择最好的离子对。MRM采集的定量离子对如下表3所示。
表3 25OHD3、25OHD2、1,25(OH)2D3,1,25(OH)2D2,24,25(OH)2D3,24,25(OH)2D2及对应内标的MRM分析定量离子对及参数
Figure BDA0003058563440000091
实施例2
本实施例提供维生素D代谢物的检测方法，该方法采用液相色谱串联质谱法进行检测，其与实施例1的区别仅在于，流动相A和所述流动相B中，醋酸锂的浓度为0.22mM。
实验例1维生素D代谢物的分离效果检测
利用实施例1的检测方法对维生素D代谢物及其干扰的结构类似物进行液相分离，结果如图1和图2所示，结果表明，本发明的检测方法能够很好地将25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1,25二羟基维生素D3、1,25二羟基维生素D2、24,25二羟基维生素D3、24,25二羟基维生素D2这六种维生素代谢物进行分离，并与干扰物3-epi 25(OH)D3、3-epi 24,25(OH)2D3、23R,25(OH)D3、4β,25(OH)2D很好地分离。
实验例2检测方法的线性相关性分析
分别配制浓度为200ng/mL、100ng/mL、10ng/mL、10ng/mL、51.2ng/mL、51.6ng/mL的维生素D代谢物25OHD3、25OHD2、1,25(OH)2D3,1,25(OH)2D2,24,25(OH)2D3,24,25(OH)2D2的标准品溶液。采用实施例1的检测方法进行检测，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，计算回归方程及相关系数。各代谢物的线性相关系数结果如表4所示。
表4维生素D代谢物的相关性结果
Figure BDA0003058563440000101
实验例3检测方法的性能评价
1、精密度评价
采用实施例1的方法进行血清样本中维生素D代谢物的检测，对检测方法的精密度进行评价，具体方法如下：连续五天，每天检测五次，计算该方法的批内及总不精密度，评价结果如表5所示，结果表明，本发明的检测方法的精密度良好。
表5维生素D代谢物的精密度评价结果
Figure BDA0003058563440000111
2、灵敏度评价
利用25(OH)D3,25(OH)D2,24,25(OH)2D3,24,25(OH)2D2,1,25(OH)2D3和1,25(OH)2D2的标准品溶液检测实施例1的方法对各上述各代谢物的检测限(LOD)和定量限(LOQ)。结果显示，25(OH)D3、25(OH)D2、24,25(OH)2D3、24,25(OH)2D2、1,25(OH)2D3和1,25(OH)2D2的LOD和LOQ分别为0.78ng/mL和1.56ng/mL,0.36ng/mL和0.78ng/mL,0.05ng/mL和0.10ng/mL,0.05ng/mL和0.10ng/mL,0.02ng/mL和0.04ng/mL,0.02ng/mL和0.04ng/mL。
3、基质效应评价
对实施例1的检测方法的基质效应进行评价，采用提取后加标的方法进行基质效应评价，具体方法如下：血清样本经过前处理后，加入一定量浓度的标准品(具体浓度如表6所示)，比较处理后血清样本、标准品及处理后血清样本加标准品的响应，评价绝对基质效应。结果如表6所示，维生素D代谢产物的基质效应均在90％-110％之间。
表6维生素D代谢物的基质效应评价
Figure BDA0003058563440000121
4、回收率和准确度评价
对实施例1的检测方法采用添加各种维生素D代谢物标准品的加标供试品溶液进行添加回收试验，共设置四个水平的加标供试品溶液。结果如表7所示，维生素D代谢产物的平均回收率均在90％-110％之间。
表7维生素D代谢物的回收率评价
Figure BDA0003058563440000131
准确度结果如表8所示，25(OH)D3、25(OH)D2及24,25(OH)2D3的准确度分别为93.8-103.0％、101.0％、96.3-100％。
表8维生素D代谢物的准确度评价
Figure BDA0003058563440000141
注：NIST：美国国家标准与技术研究院，SRM：标准参考物质(standard referencematerial)。
对实施例2的检测方法也进行上述实验例1-4的评价，结果显示，实施例2的检测方法可获得与实施例1的方法相当的检测效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，所述方法同时检测25-羟基维生素D3、25-羟基维生素D2、1,25二羟基维生素D3、1,25二羟基维生素D2、24,25二羟基维生素D3、24,25二羟基维生素D2这六种维生素代谢物，采用液相色谱串联质谱法进行检测，其中，液相色谱的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为含有醋酸锂的水溶液，所述流动相B为含有醋酸锂的甲醇溶液；
所述流动相A和所述流动相B中，醋酸锂的浓度为0.18-0.22mM；
所述流动相按照以下梯度进行梯度洗脱：0-0.2min，流动相A 75-78%，0.2-0.3min，流动相A 78-30%，0.3-6.0min，流动相A 30-29%，6.0-9.0min，流动相A 29-28%，9.0-10.0min，流动相A 28-27%，10.0-10.5min，流动相A 27-20%，10.5-12.5min，流动相A 20%，12.5-12.6min，流动相A 20-5%，12.6-13.1min，流动相A 5%，13.1-13.2min，流动相A 5-75%，13.2-14.0min，流动相A 75%；
液相色谱的色谱柱为Ascentis Express F5，2.1 × 100 mm，2.7 μm；
在液相色谱分离前，还包括样品前处理步骤，所述样品前处理包括：将所述样品与内标液和甲醇混合得到第一混合液，再将所述第一混合液与硫酸锌水溶液以及正己烷和乙酸乙酯的混合溶液混合，得到第二混合液，将所述第二混合液的上清与沉淀分离，将所述上清经干燥、复溶后进行液相色谱分离。
2.根据权利要求1所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，梯度洗脱过程中，所述流动相的流速为0.2-0.6 mL/min。
3.根据权利要求1所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，色谱柱的柱温为20-42℃。
4.根据权利要求1所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，样品前处理体系中，硫酸锌的终浓度为20-30mM，正己烷和乙酸乙酯的用量分别为样品体积的3-5倍和0.8-1.2倍。
5.根据权利要求4所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，样品前处理体系中，甲醇的用量为样品体积的0.8-1.2倍，内标液的用量为样品体积的20-30%。
6.根据权利要求1所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，质谱检测条件如下：正离子、点喷雾电离、MRM采集定量离子对，Gas1、Gas2、气帘气和碰撞气分别为60psi，60psi，30 psi和medium，离子喷雾电压为5500v，最佳探针温度为400℃。
7.根据权利要求6所述的检测维生素D代谢物的方法，其特征在于，所述定量离子对如下：25OHD3的母离子为m/z 407.4，子离子为m/z 389.3，25OHD2的母离子为m/z 419.3，子离子为m/z 401.4，1,25(OH)2D3的母离子为m/z 423.4，子离子为m/z 387.4，1,25(OH)2D2的母离子为m/z 435.4，子离子为m/z 381.4，24,25(OH)2D3的母离子为m/z 423.4，子离子为m/z405.4，24,25(OH)2D2 的母离子为m/z 435.4，子离子为m/z 417.4，25OHD3 -d3的母离子为m/z 410.4，子离子为m/z 392.3，25OHD2 -d3的母离子为m/z 422.3，子离子为m/z 404.4，1,25(OH)2D3 -d3的母离子为m/z 426.3，子离子为m/z 372.4，24,25(OH)2D3 -d6的母离子为m/z429.4，子离子为m/z 411.4。
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